Medycyna Wet. 2006, 62 (8) 909
Praca oryginalna Original paper
Ob³oniak (haemangiopericytoma) jest nowotworem wystêpuj¹cym u ludzi i psów. Wed³ug obowi¹zuj¹cej klasyfikacji WHO zaliczany jest do grupy z³oliwych guzów mezenchymalnych skóry i tkanki podskórnej (6). Prawdopodobnie wywodzi siê z perycytów, co potwierdzono badaniami ultrastrukturalnymi jedynie u ludzi.
W przypadku psów histogeneza tego guza nie jest do koñca wyjaniona. Mimo ¿e cechy przypisane ob-³oniakom, takie jak: s³abo wykszta³cona b³ona pod-stawna, szcz¹tkowe po³¹czenia miêdzykomórkowe, pêcherzyki pinocytarne s¹ zgodne z ultrastruktur¹ pe-rycytów, nie mo¿na jednak wykluczyæ pochodzenia tego guza z fibroblastów onerwia, poniewa¿ posiada-j¹ one identyczne cechy ultrastrukturalne (7, 8, 11, 14). Nowotwory te u psów wystêpuj¹ dosyæ czêsto, sta-nowi¹c 3,2-4,2% wszystkich guzów skórnych (2, 5). Pojawiaj¹ siê g³ównie na koñczynach w okolicy sta-wów, chocia¿ stwierdzano je równie¿ w ledzionie (10) i ¿o³¹dku (13). Natomiast u ludzi odnotowano przy-padki wystêpowania ob³oniaka tak¿e w ródpiersiu, macicy, w¹trobie i p³ucach (4).
S¹ to zwykle guzy pojedyncze, wolno rosn¹ce, osi¹-gaj¹ce rozmiary od 0,6 do 25 cm rednicy. Dotycz¹ psów w wieku 7-10 lat, g³ównie du¿ych ras. Skóra pokrywaj¹ca guz mo¿e byæ bezw³osa z obecnoci¹
owrzodzeñ. Ob³oniaki mog¹ byæ spoistoci twardej, gumowatej lub podobnej do tkanki t³uszczowej (2, 5, 6, 8, 12, 14). Mimo ¿e s¹ zmianami dobrze odgrani-czonymi od s¹siaduj¹cych tkanek, otaczaj¹ca masê guza pseudotorebka umo¿liwia im rozprzestrzenianie siê wzd³u¿ powiêzi i miêni. Sprawia to trudnoci w ustaleniu w³aciwego marginesu ciêcia chirurgicz-nego, a tym samym jest przyczyn¹ wysokiego odsetka wznowy, 26-60% (8, 9, 12). Z ka¿d¹ wznow¹ wi¹¿e siê wzrost aktywnoci mitotycznej komórek guza, co zwiêksza jego zdolnoæ do dawania przerzutów, która w przypadku pierwotnej zmiany jest bardzo niska.
Histologicznie cech¹ charakterystyczn¹ ob³oniaków wystêpuj¹cych u psów jest obecnoæ warstw wrzecio-nowatych komórek u³o¿onych w koncentryczny wzór dooko³a centralnego naczynia okrelany jako odcisk palca (fingerprinting). U cz³owieka mo¿emy zaob-serwowaæ ciasno upakowane owalne lub wrzeciono-wate komórki u³o¿one dooko³a cienkociennych na-czyñ krwiononych (4, 7, 11).
Wzór odcisku palca jest cech¹ dominuj¹c¹ w ob-³oniakach psów, ale mo¿e równie¿ wystêpowaæ w in-nych nowotworach, jak: nerwiakow³ókniaku, w³óknis-tej histiocytomie, w³ókniakomiêsaku (7, 11). Sprawia to du¿e trudnoci w diagnostyce histopatologicznej i sk³ania do poszukiwania dodatkowych metod
diag-Immunohistochemiczna analiza ob³oniaków u psów
AGNIESZKA JASIK, WOJCIECH £OPUSZYÑSKI*,
ZBIGNIEW NOZDRYN-P£OTNICKI*, WOJCIECH KOZACZYÑSKI
Zak³ad Anatomii Patologicznej Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego Pañstwowego Instytutu Badawczego, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy
*Katedra Anatomii Patologicznej Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej AR, ul. G³êboka 30, 20-612 Lublin
Jasik A., £opuszyñski W., Nozdryn-P³otnicki Z., Kozaczyñski W.
Immunohistochemical analysis of canine haemangiopericytomas Summary
The aim of the study was an attempt to elucidate canine haemangiopericytoma histogenesis based on immunohistochemical analysis using a range of commercially available antibodies. Seventeen canine haemangiopericytomas were examined. Histological analysis revealed the presence of spindle cells arranged in a circular pattern around capillaries (fingerprint pattern) or interlacing bundles. Fingerprint patterns were the distinguishing feature in all examined haemangiopericytomas. Immunohistochemical analysis revealed positive expressions of vimentin, neuron-specific enolase (NSE), glial fibrillary acidic protein (GFAP), S-100 protein (S-100) and smooth muscle actin (a-SMA). Negative reactions in tumor cells were observed for cytokeratin (CK), desmin (DES), epithelial membrane antigen (EMA) and VIII-related antigen factor (FVIII). Positive expressions of neuronal markers may not necessarily reflect the neural origin of tumors due to their low specificity. Immunoreactivity for a-SMA and DES negativity may suggest the presence of vascular smooth muscle cells or cells of pericytic origin. Moreover, the a-SMA antibody may be useful for a differential diagnosis of canine haemangiopericytomas.
Medycyna Wet. 2006, 62 (8) 910
nostycznych. Obecnoæ specyficznych markerów tkan-kowych w ob³oniaku, a brak ich w innych guzach o po-dobnym wygl¹dzie histologicznym, mog³aby u³atwiæ rozpoznanie. Jak dot¹d nie okrelono dok³adnie profi-lu immunohistochemicznego ob³oniaków u psów, byæ mo¿e dlatego, ¿e wiêkszoæ przeciwcia³ stosowanych w diagnostyce ludzkiej nie wykazuje specyficznego powinowactwa do tkanki zwierzêcej. Dlatego te¿ ce-lem pracy by³a analiza immunohistochemiczna ob³o-niaków u psów z zestawem dziewiêciu powszechnie dostêpnych przeciwcia³ i próba wyjanienia na pod-stawie ich ekspresji w tkance nowotworowej, histoge-nezy tego guza.
Materia³ i metody
Badaniom poddano 17 usuniêtych chirurgicznie guzów, pochodz¹cych od psów w ró¿nym wieku i ró¿nych ras. Materia³ przekazano do Katedry Anatomii Patologicznej AR w Lublinie. Pobrane z ka¿dego guza wycinki tkanko-we utrwalono w 10% obojêtnej formalinie, a nastêpnie prze-prowadzono rutynowo do bloczków parafinowych i krojo-no na skrawki histologiczne o gruboci 5 µm. Rozpoznania preparatów barwionych hematoksylin¹ i eozyn¹ dokonano w oparciu o klasyfikacjê guzów ³¹cznotkankowych skóry i tkanek miêkkich wg WHO. Do badania immunohistoche-micznego (IHC) 5 µm skrawki nanoszono na silanizowane szkie³ka, które nastêpnie odparafinowano i uwodniono. Blokowanie endogennej peroksydazy przeprowadzono przez inkubacjê preparatów w 3% roztworze wody utle-nionej przez 10 minut. Nastêpnie skrawki inkubowano z ze-stawem 9 przeciwcia³ (tab. 1). Celem odmaskowania
anty-genów tkankowych, skrawki przeznaczone do wykrywa-nia cytokeratyny (CK), bia³ka S-100 (S-100), antygenu nab³onkowego (EMA), czynnika FVIII (FVIII) i kwanego bia³ka w³ókienkowego gleju (GFAP) inkubowano z protei-naz¹ K (Dako) przez 1,5-5 minut.
Skrawki tkankowe do wykrycia wimentyny (VIM), go-towano w buforze cytrynianowym o pH 6,0 przez 5 min., natomiast preparaty dla wykrycia desminy (DES) i a-akty-ny (aAK) gotowano w buforze Tris-EDTA o pH 9,0 przez 5 min. W badaniu IHC wykorzystano zestaw HRP/LSAB+ (Dako). Pierwotne przeciwcia³a rozcieñczono w rozcieñ-czalniku Antibody Diluent (Dako) i skrawki inkubowano przez 30 min. w temp. pokojowej w wilgotnej komorze. Nastêpnie zastosowano przeciwcia³o wtórne biotynylowa-ne anty-pierwotbiotynylowa-ne na 30 min. w temp. pokojowej. W kolej-nym etapie skrawki inkubowano przez 20 min. ze strepta-widyn¹. Inkubacjê z kolejnymi odczynnikami przerywano poprzez dwukrotne p³ukanie skrawków w buforze TBST. Miejsca reakcji antygenprzeciwcia³o uwidoczniono, in-kubuj¹c preparaty z czterochlorowodorkiem 3,3-dwuami-nobenzydyny (Vector), otrzymuj¹c brunatny wynik reak-cji. W koñcowym etapie preparaty podbarwiono hemato-ksylin¹ Meyera, ró¿nicowano w wodzie amoniakalnej, od-wodniono, przewietlono w ksylenie i zamkniêto w balsa-mie kanadyjskim. Jako kontrolê negatywn¹ wykorzystano skrawki ob³oniaków, zastêpuj¹c pierwotne przeciwcia³o buforem TBST, natomiast jako kontrolê pozytywn¹ wyko-rzystano skrawki macicy i tkanki mózgowej psa.
Wyniki i omówienie
W obrazie mikroskopowym wszystkich badanych guzów ujawniono obecnoæ wrzecionowatych komó-rek zaopatrzonych w wypustki cytoplazmatyczne z owalnymi centralnie u³o¿onymi j¹drami i centralnie po³o¿onymi jednym lub dwoma j¹derkami. Komórki te tworzy³y zró¿nicowane uk³ady histologiczne. W czê-ci preparatów uk³ada³y siê w koncentryczny wzór do-oko³a cienkociennych naczyñ krwiononych (wzór odcisku palca), podczas gdy w innych rejonach tego samego guza w przeplataj¹ce siê pêczki. W
wiêkszo-o ³ a i c w i c e z r P Producent Rozcieñczenie o ³ a i c w i c e z r p e n l a n o l k o n o m e i s y M 6 1 1 F N M n o l k , e i n y t a r e k o t y c o k w i c e z r p o k a D , n o it a m o t y C k r a m n e D 1:100 o ³ a i c w i c e z r p e n l a n o l k o n o m e i s y M 9 V n o l k , e i n y t n e m i w o k w i c e z r p o k a D , n o it a m o t y C k r a m n e D 1:100 o ³ a i c w i c e z r p e n l a n o l k o n o m e i s y M 3 3 D n o l k , e i n i m s e d o k w i c e z r p o k a D , n o it a m o t y C k r a m n e D 1:100 o ³ a i c w i c e z r p e n l a n o l k o n o m e i s y M o k w i c e z r p a-aktyniemiêniowe,j 4 A 1 n o l k o k a D , n o it a m o t y C k r a m n e D 1:100 o ³ a i c w i c e z r p e n l a n o l k il o p e z c il ó r K 0 0 1 -S u k ³ a i b o k w i c e z r p GBieormrteanndy, Predliuted o ³ a i c w i c e z r p e n l a n o l k il o p e z c il ó r K j e n z c if y c e p s o n o r u e n o k w i c e z r p e iz a l o n e , d n e rt o i B y n a m r e G Predliuted o ³ a i c w i c e z r p e n l a n o l k il o p e z c il ó r K u k ³ a i b u m e n a w k o k w i c e z r p u j e l g u m e w o k n e i k ó ³ w o k a D , n o it a m o t y C k r a m n e D 1:500 o ³ a i c w i c e z r p e n l a n o l k o n o m e i s y M , u m e w o k n o ³ b a n i w o n e g y t n a o k w i c e z r p 4 . 1 P G n o l k , d n e rt o i B y n a m r e G Predliuted o ³ a i c w i c e z r p e n l a n o l k il o p e z c il ó r K II I V i w o k i n n y z c o k w i c e z r p GBieormrteanndy, Predliuted Tab. 1. Przeciwcia³a wykorzystane w badaniu immunohisto-chemicznym ob³oniaków
Ryc. 1. Histologiczny obraz ob³oniaka u psa. Widoczny cha-rakterystyczny koncentryczny uk³ad wrzecionowatych komó-rek doko³a centralnego naczynia (wzór odcisku palca strza³ki). Barwienie HE, pow. ok. 200 ×
Medycyna Wet. 2006, 62 (8) 911
ci guzów stwierdzono jednoczenie obecnoæ miejsc o zwartym i lunym utkaniu komórek nowotworowych. W histologicznej ocenie wzór odcisku palca by³ ce-ch¹ dominuj¹c¹ we wszystkich badanych preparatach (ryc. 1). Wyniki barwienia immunohistochemicznego przedstawiono w tab. 2. We wszystkich preparatach komórki nowotworowe wykaza³y siln¹ ekspresjê wi-mentyny (ryc. 2). Rozlany odczyn dodatni, cytoplaz-matyczno-j¹drowy na neuronospecyficzn¹ enolazê stwierdzono w 16 ob³oniakach (ryc. 3). Sporód po-zosta³ych markerów neuronalnych ogniskow¹ ekspres-jê GFAP stwierdzono w 6 ob³oniakach, natomiast
bia³-ka S-100 w 2 przypad-kach. Reakcje obu prze-ciwcia³ obserwowano w komórkach nowotwo-rowych. Brak reakcji za-obserwowano w komórkach nowotworowych dla CK, DES, EMA i czynnika FVIII. Reakcja na czynnik FVIII ogranicza³a siê do komórek ródb³onka naczyñ, przed-stawiaj¹c tym samym unaczynienie guza (ryc. 4). Eks-presjê a-SMA stwierdzono w perycytach têtnic, ¿y³ i naczyñ w³osowatych zlokalizowanych zarówno w masie guza, jak i w otaczaj¹cej go tkance ³¹cznej we wszystkich przypadkach. Natomiast dodatni odczyn cytoplazmatyczny w komórkach nowotworowych dla a-SMA zaobserwowano w 12 ob³oniakach, zarówno w rejonie wzoru odcisku palca, jak i lunego utka-nia komórkowego (ryc. 5).
o ³ a i c w i c e z r P CK VIM DES S100 NSE GFAP EMA FVIII a K-A w ó k d a p y z r p h c i n t a d o d a b z c i L h c y n a d a b h c i k t s y z s w y b z c il o d 0/17 17/17 0/17 2/17 16/17 6/17 0/17 0/17 12/17 Tab. 2. Wyniki reakcji immunohistochemicznej badanych ob³oniaków
Ryc. 2. Dodatnia reakcja immunohistochemiczna na obecnoæ vimentyny V9. Rozlany odczyn cytoplazmatyczny w komór-kach nowotworowych. Metoda HRP/LSAB+ vimentyna, pow. ok. 200 ×
Ryc. 3. Dodatnia reakcja immunohistochemiczna na obecnoæ neuronospecyficznej enolazy. Silny odczyn cytoplazmatycz-no-j¹drowy w komórkach nowotworowych. Metoda HRP/ LSAB+ NSE, pow. ok. 200 ×
Ryc. 5. Dodatnia reakcja immunohistochemiczna na obecnoæ a-aktyny miêniowej. Odczyn obecny w perycytach naczyñ oraz ogniskowo w komórkach nowotworowych koncentrycz-nie uk³adaj¹cych siê dooko³a centralnego naczynia. Metoda HRP/LSAB+ a-SMA, pow. ok. 200 ×
Ryc. 4. Reakcja immunohistochemiczna komórek ródb³on-ka naczyñ na obecnoæ czynniródb³on-ka FVIII. Reakcja ta obrazuje unaczynienie guza. Metoda HRP/LSAB+ czynnik FVIII, pow. ok. 200 ×
Medycyna Wet. 2006, 62 (8) 912
Obraz histologiczny potwierdza obserwacje innych autorów, co do rodzaju i wygl¹du komórek tkanki gu-zowatej, jak i ich charakterystycznego koncentrycz-nego u³o¿enia doko³a naczyñ (1-11, 14-16).
Pozytywna reakcja na obecnoæ VIM przy braku reakcji ze strony CK jest zgodna z domniemanym mezenchymalnym pochodzeniem ob³oniaków i by³a opisywana wczeniej zarówno u ludzi, jak i u psów (3, 7, 8, 11). Podobnie jak w przypadku ob³oniaków analizowanych przez Williamsona i wsp. (15), w ba-danej grupie psich guzów nie stwierdzono obecnoci DES, co sugeruje brak miêniowego zró¿nicowania ob³oniaków. Jakkolwiek obecnoæ tego markera od-notowano incydentalnie, to jednak traktowano jego ekspresjê jako niespecyficzn¹ (7). Obecnoæ pozytyw-nej reakcji dla markerów neuronalnych, takich jak S-100, GFAP czy NSE, niektórym autorom nasuwa podejrzenie nerwowego pochodzenia ob³oniaków. Jed-nak jeli wemie siê pod uwagê wystêpowanie bia³ka S-100 w czerniakach, nerwiakow³ókniakach, komór-kach Langerhansa, a NSE i GFAP tak¿e w miêniako-miêsakach pr¹¿kowanokomórkowych psów (3), wów-czas mo¿na zakwestionowaæ specyficznoæ stosowa-nych przeciwcia³ i tym samym ich u¿ytecznoæ w diag-nostyce ró¿nicowej. Mo¿na te¿ uznaæ perycyty za ko-mórki wielopostaciowe, które w zale¿noci od stop-nia zró¿nicowastop-nia wykazuj¹ obecnoæ tych markerów. Z podobn¹ sytuacj¹ spotkamy siê w przypadku eks-presji a-SMA. Ludzkie perycyty wykazuj¹ ekspresjê a-SMA, natomiast brak tego antygenu w przypadku ludzkich ob³oniaków. Prawdopodobnie wi¹¿e siê to z utrat¹ antygenowoci podczas procesu nowotworo-wej transformacji. Mo¿e to równie¿ wskazywaæ na zu-pe³nie inne pochodzenie ob³oniaków. Natomiast w przypadku psich guzów w opisanych dot¹d bada-niach mamy do czynienia z siln¹ ekspresj¹ a-SMA (3, 7, 11). W analizowanych w tej pracy nowotworach ogniskow¹ ekspresjê a-SMA stwierdzono w 12 z 17 ob³oniaków. Obecnoæ a-SMA opisywano jak dot¹d jedynie w przypadku ob³oniaków i miêniakomiêsa-ków g³adkokomórkowych, natomiast w przypadku guzów wywodz¹cych siê z os³onki nerwów obwodo-wych stwierdzono brak ekspresji tego antygenu zarów-no u ludzi, jak i psów (7, 11). Zatem przeciwcia³o to mo¿e byæ u¿yteczne w diagnostyce ró¿nicowej ob³o-niaków. Ponadto nie potwierdza to hipotezy nerwo-wego pochodzenia tych guzów. Ekspresja a-SMA w badanych guzach, przy braku reakcji na desminê mo¿e wiadczyæ o obecnoci komórek miêni g³ad-kich naczyñ lub komórek pochodz¹cych z perycytów. Jednak na potwierdzenie tej hipotezy nale¿a³oby prze-prowadziæ badania na wiêkszej liczbie przypadków oraz poszerzyæ zestaw przeciwcia³ o inne bardziej spe-cyficzne markery nowotworowe.
Pimiennictwo
1.Beust B. R., Suter M. M., Summers B. A.: Factor VIII-related antigen in cani-ne endothelial cani-neoplasms: an immunohistochemical study. Vet. Pathol. 1988, 25, 251-255.
2.Bostock D. E.: Neoplasms of the skin and subcutaneous tissues in dogs and cats. Br. Vet. J. 1986, 142, 1-19.
3.Chijiwa K., Uchida K., Tateyama S.: Immunohistochemical evaluationof canine peripheral nerve sheath tumors and other soft tissue sarcomas. Vet. Pathol. 2004, 41, 307-318.
4.Evans R. W.: Histological Appearances of Tumours. Livingstone Ltd, Edin-burgh and London 1966, s. 103-107.
5.Graves G. M., Bjorling D. E., Mahaffey E.: Canine hemngiopericytoma: 23 cases (1967-1984). J. Am. Vet. Med. Assoc. 1988, 192, 99-102.
6.Hendrick M. J., Mahaffey E. A., Moore F. M., Vos J. H., Walder E. J.: Histo-logical classification of mesenchymal tumors of skin and soft tissues of domestic animals. Bull. WHO, vol II, 1998, 32-33.
7.Mazzei M., Millanta F., Citi S., Lorenzi D., Poli A.: Haemangiopericytoma: histological spectrum, immunohistochemical characterization and progno-sis. Vet. Dermatol. 2002, 13, 15-21.
8.Meuten D. J.: Tumors in Domestic Animals. Blackwell Publishing Compa-ny, Iowa State Press 2002, s. 94-95.
9.Morris J., Dobson J.: Onkologia ma³ych zwierz¹t. SIMA WLW, Warszawa 2003, s. 74-81.
10.Obwolo M. J.: Primary splenic haemangiopericytoma in a German shepherd dog. J. Comp. Pathol. 1986, 96, 285-288.
11.Pérez J., Bautista M. J., Rollón E., Chacón-M. de Lara F., Carrasco L., Martín de las Mulas J.: Immunohistochemical characterization of heman-giopericytomas and other spindle cell tumors in the dog. Vet. Pathol. 1996, 33, 391-397.
12.Richardson R. C., Render J. A., Rudd R. G., Shupe R. S., Carlton W. W.: Metastatic canine hemangiopericytoma. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1983, 182, 705-706.
13.Sapierzyñski R., Malicka E., Skrzypczak M., Soko³owska J.: Nowotwory ¿o-³¹dka u psów. ¯ycie Wet. 2002, 77, 581-584.
14.Sapierzyñski R., Sapierzyñska E.: Nowotwory mezenchymalne skóry i tkan-ki podskórnej u psów i kotów. Czêæ II. Ob³oniak, nerwiakow³ókniakomiê-sak i t³uszczak naciekaj¹cy. ¯ycie Wet. 2004, 79, 435-439.
15.Williamson M. M., Middleton D. J.: Cutaneous soft tissue tumours in dogs: classification, differentiation and histogenesis. Vet. Dermatol. 1998, 9, 43--48.
16.Yost D. H., Jones T. C.: Hemangiopericytoma in the dog. Am. J. Vet. Res. 1958, 159-163.
Adres autora: lek. wet. Agnieszka Jasik, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy; e-mail: agnieszka@piwet.pulawy.pl
