Medycyna Wet. 2011, 67 (8) 527
Artyku³ przegl¹dowy Review
Kancerogeneza jest z³o¿onym procesem, w którym g³ówn¹ rolê odgrywaj¹ zmiany molekularne prowadz¹ce do modyfikacji morfologicznych wybranych komórek. Najnowsze badania wskazuj¹, ¿e ten wieloczynnikowy proces rozpoczyna siê na poziomie zmian w genomie, w których jedn¹ z g³ównych ról pe³ni¹ po³¹czenia funk-cjonalne pomiêdzy specyficznymi grupami genów (5). Poznanie genomów wiêkszoci gatunków ssaków po-ci¹gnê³o za sob¹ koniecznoæ poszukiwania metod pozwalaj¹cych na analizowanie zmian w sekwencji ge-nomu oraz badanie wp³ywu tych zmian na funkcjono-wanie komórek. Przyk³adem takich metod s¹ mikro-macierze, okrelane równie¿ jako biomikromikro-macierze, które sta³y siê niezbêdnym narzêdziem w identyfikacji zmian genetycznych. Mikromacierze s¹ docelowym narzêdziem badawczym w analizowaniu profili ekspre-syjnych genów, aczkolwiek ostatnie doniesienia suge-ruj¹ mo¿liwoæ ich wykorzystania w przesiewowym analizowaniu (screening) mutacji i/lub badaniach czês-toci wystêpowania polimorfizmów wybranych genów. Szerokie mo¿liwoci wykorzystania mikromacierzy spowodowa³y ich powszechne stosowanie w naukach biomedycznych ze szczególnym uwzglêdnieniem
ba-dañ markerów nowotworowych zarówno u ludzi, jak i innych gatunków ssaków, w tym psów.
Zastosowanie mikromacierzy w analizach DNA
Proces kancerogenezy polega na nagromadzeniu wie-lu zmian genetycznych i epigenetycznych (8). Zmiany te skutkuj¹ transformacj¹ fenotypow¹ komórek, które przyjmuj¹ nowe cechy charakterystyczne dla komórek nowotworowych. Mikromacierze DNA pozwalaj¹ na przesiewow¹ analizê zmian jakociowych oraz ilocio-wych w sekwencji genomowego DNA komórki nowo-tworowej. Technologia wykorzystuj¹ca mikromacierze DNA polega na wykorzystaniu porównawczych hybry-dyzacji, dziêki którym mo¿liwe jest wykrywanie muta-cji i/lub genotypowanie polimorfizmów (12). Technika sekwencjonowania przez hybrydyzacjê polega na kon-strukcji nieznanej sekwencji dostarczonej z baz danych. Ka¿da z sekwencji DNA posiada nachodz¹ce na siebie krótkie fragmenty sekwencji porównanych z hybrydy-zuj¹cymi oligomacierzami. Przygotowana w ten spo-sób macierz sk³ada siê z sekwencji docelowej o d³u-goci oktameru do 70-oligomeru. Wyznakowane frag-menty DNA ³¹cz¹ siê tylko do tych sekwencji, które s¹ do nich w pe³ni komplementarne. Nastêpnie na podsta-wie zastosowanych algorytmów okrela siê tzw. specy-ficzny profil wi¹zania, aby nastêpnie zidentyfikowaæ ca³¹ sekwencjê wyjciow¹ (oryginaln¹) (6).
Wykorzystanie macierzy DNA oraz RNA
w identyfikacji markerów onkogenezy u ssaków*
)
BARTOSZ KEMPISTY, PIOTR ZAWIERUCHA, MICHA£ NOWICKI
Katedra i Zak³ad Histologii i Embriologii Wydzia³u Lekarskiego II UM, ul. wiêcickiego 6, 60-781 Poznañ
Kempisty B., Zawierucha P., Nowicki M.
Using of DNA and RNA microarrays in order to identify oncogenesis markers in mammals Summary
In recent years an increased number of diagnosed cancers in mammals have been noted, mainly in dogs, and has lead to intensive research based on the causes and course of cancers in animals. The development of molecular biological techniques, statistics and bioinformatics has made possible the development of new diagnostic methods. The DNA microarrays is a technique that is prepared for the identification of new mutations within the scale of the whole genome as well as in the determination of the frequency of single nucleotide polymorphisms (SNP). A consequence of the development of this method is the creation of RNA microarrays based on transcriptomics technology. Using both of these methods in the scale of whole genome and/or transcriptome leads to describing the causes of oncogenesis induction as well as suggests more efficient methods of therapeutic treatments. In this article the methodological characteristics and possible practical application of DNA and RNA microarrays in research on mammalian oncogenesis has been presented.
Keywords: Microarrays, SNP, Gene expression profiling, transcriptomics
*) Publikacja jest czêci¹ projektu CAOM Centrum archiwizacji obrazów
morfologicznych, wspó³finansowan¹ przez Europejski Fundusz Rozwoju Re-gionalnego, z projektu Innowacyjna gospodarka, 2007-2013. Has³o projektu: Inwestujemy w twoj¹ przysz³oæ.
Medycyna Wet. 2011, 67 (8) 528
Analiza mutacji
Identyfikowanie nowych mutacji odgrywa istotn¹ rolê w przypadku nowotworów g³ównie ze wzglêdu na po-znawanie przyczyn indukcji ontogenezy (15). W ci¹gu ostatnich kilku lat wzros³o zainteresowanie oraz wyko-rzystanie oligomacierzy, zwanych równie¿ macierzami oligonukleotydowymi. Analizowanie nowych mutacji przez sekwencjonowanie opieraj¹ce siê na hybrydy-zacji ma na celu identyfikowanie specyficznych zmian w sekwencjach DNA. W identyfikowaniu tych zmian powszechne zastosowanie zyska³a równie¿ metoda polegaj¹ca na resekwencjonowaniu (resequencing). W przypadku tej techniki wzór hybrydyzacyjny niezna-nej próbki porównuje siê z sekwencj¹ dzikiego typu (re-ferencyjnym DNA). Wszelkie zmiany w analizowanej sekwencji skutkuj¹ specyficznymi zmianami wzoru hybrydyzacyjnego sekwencji referencyjnej (24). Obie przedstawione powy¿ej techniki znalaz³y powszechne zastosowanie w identyfikacji mutacji wybranych genów, jak: BRCA1 i/lub BRCA2 w przypadku badañ nad ge-netycznym pod³o¿em raka gruczo³u mlekowego u lu-dzi (9-11). Wyniki przytoczonych badañ dowiod³y, ¿e techniki te stanowi¹ bardzo wydajne narzêdzie w iden-tyfikacji specyficznych mutacji, ma³ych insercji i dele-cji w niepowtarzaj¹cych siê sekwencjach, aczkolwiek istnieje potrzeba prowadzenia kolejnych badañ w celu analizowania powtarzaj¹cych siê sekwencji, gdzie zmia-ny nie zawsze s¹ mo¿liwe do odró¿nienia od sekwencji dzikiego typu. Próby takiej analizy zosta³y przeprowa-dzone w innych badaniach odnosz¹cych siê do iden-tyfikacji mutacji w takich genach, jak: K-ras i TP 53. Autorzy tych badañ sugeruj¹, ¿e uzyskane przez nich wyniki s¹ w pe³ni porównywalne z wynikami standar-dowego sekwencjonowania (25), aczkolwiek zastoso-wane w przypadku tej pracy mikromacierze s¹ techni-k¹ bardziej czu³¹, dok³adniejsz¹ i szybsz¹ w porówna-niu do klasycznego sekwencjonowania.
Sugeruje siê, ¿e zastosowanie mikromacierzy w celu identyfikacji mutacji stanie siê prze³omem w badaniach zmian w sekwencjach wielu onkogenów, genów supre-sorowych oraz innych grup genów zaanga¿owanych w indukcjê onkogenezy u ssaków.
Genotypowanie polimorfizmów
Badanie polimorfizmów wyselekcjonowanych genów stanowi kolejne narzêdzie badawcze w analizowaniu zmian w strukturze genów komórek nowotworowych (18). Sugeruje siê, ¿e najwa¿niejszym aspektem tego typu badañ jest zrozumienie i okrelenie, w jaki sposób te zmiany s¹ zwi¹zane z funkcjami biologicznymi ko-mórek oraz czy fenotyp ten mo¿e byæ dziedziczony.
Polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (single nucleotide polimorphism, SNPs) stanowi¹ najczêstsze zmiany polimorficzne w DNA w genomie ssaków. Po-szczególne SNP zajmuj¹ cile okrelone miejsce na chromosomie, jednak¿e czêstoæ ich wystêpowania jest cech¹ ró¿ni¹c¹ poszczególne osobniki. W genomie po-szczególnych osobników identyfikuje siê du¿¹ liczbê
ró¿nych SNP, dlatego te¿ okrelenie wszystkich poli-morfizmów tego typu w ca³ym genomie stanowi swo-isty genetyczny odcisk palca. Pomimo ¿e SNP s¹ rozmieszczone w genomie przypadkowo, tylko nielicz-ne z nich maj¹ funkcjonalnielicz-ne znacznie, dziêki temu, ¿e wystêpuj¹ w koduj¹cych regionach podlegaj¹cych trans-krypcji i/lub w regulatorowych sekwencjach danego genu. Wiele sporód prac identyfikuje SNP jako mar-kery genetyczne sprzê¿one z wybranymi jednostkami chorobowymi o pod³o¿u genetycznym. Bior¹c pod uwagê badania nad genomem cz³owieka, analizowanie SNP wydaje siê dostarczaæ mniej istotnych informacji w porównaniu do innych metod, jak mikrosatelity. Na-tomiast identyfikacja SNP mo¿e mieæ równie¿ postaæ specjalnie skonstruowanych macierzy, gdzie poszu-kiwanie polimorfizmów jest w pe³ni automatyzowane. Mikromacierze SNP maj¹ postaæ oligomacierzy, gdzie SNP s¹ identyfikowane dziêki zastosowaniu pojedyn-czych prób oligonukleotydów. Pierwszy etap badañ po-lega na tym, ¿e ró¿ne oligonukleotydy s¹ wykorzysty-wane do analizy wielu tysiêcy SNP, a nastêpnie wybra-ne, specyficzne oligonukleotydy mog¹ zostaæ u¿yte do wykrywania danych SNP w okrelonych próbach (19). W ostatnim czasie macierze SNP znalaz³y powszechne zastosowanie w analizie utraty heterozygotycznoci alleli (loss-of-heterozygosity, LOH), w podatnoci na wybrane choroby oraz badaniach farmako- i toksyko-genetycznych. Mei i wsp. (16) oraz Lindblad-Toh i wsp. (14) wykorzystali macierze SNP w badaniach nad utra-t¹ heterozygotycznoci w nowotworach (np. drobno-komórkowy rak p³uc). Uzyskane wyniki badañ z obu eksperymentów potwierdzi³y mo¿liwoci zastosowania klasycznych metod w identyfikacji LOH oraz wyko-rzystania macierzy SNP w badaniach nad brakiem rów-nowagi allelicznej wykrywanej w komórkach nowotwo-rowych.
Podobne badania wykorzystuj¹ce macierze SNP oraz SNP fingerprint wykonuje siê w grupie osobników o zwiêkszonej podatnoci na dan¹ chorobê w odniesie-niu do grupy ma³ego ryzyka zachorowalnoci. Stoso-wana w takich przypadkach technologia macierzy umo¿-liwia analizê tysiêcy SNP w sposób w pe³ni zautomaty-zowany, szybki i w efekcie koñcowym bardziej ekono-miczny.
Macierze SNP znalaz³y w ostatnim czasie powszech-ne zastosowanie w okrelaniu stopnia rozwoju nowo-tworu oraz we wprowadzaniu skuteczniejszych metod terapii. Farmakogenetyka jest dziedzin¹ nauki podej-muj¹c¹ zagadnienie pod³o¿a genetycznego indywidu-alnej odpowiedzi danego osobnika na terapiê (13, 21). Identyfikacja plimorfizmu typu SNP w sekwencji ko-duj¹cej i/lub regulatorowej danego genu prowadzi za-zwyczaj do utraty lub zmniejszenia aktywnoci kodo-wanego przez nie bia³ka, co z kolei wi¹¿e siê z ró¿n¹ odpowiedzi¹ na podany lek. Identyfikacja pojedynczych SNP przy wykorzystaniu macierzy pozwala na okre-lenie nie tylko podatnoci danego osobnika na dan¹ jed-nostkê chorobow¹, ale i stwarza mo¿liwoæ okrelenia
Medycyna Wet. 2011, 67 (8) 529
odpowiadaj¹cego danemu SNP fenotypu, jak np. osob-niki wra¿liwie b¹d oporne na zastosowane leczenie. Roses i wsp. (17) zaproponowali mo¿liwoci wykorzy-stania macierzy SNP w farmakogenetyce. Autorzy ci okrelili zastosowanie tej techniki w identyfikacji pro-fili farmakogenetycznych jako: 1) mo¿liwoæ wyse-lekcjonowania osobników podatnych na leczenie, cha-rakteryzuj¹cych siê ponadto obni¿on¹ liczb¹ efektów ubocznych zastosowanej terapii, 2) wprowadzanie nowych leków oraz ulepszanie terapii, 3) udzia³ w ana-lizie ró¿nicowej osobników objêtych t¹ sam¹ jednostk¹ chorobow¹, ale w ró¿ny sposób reaguj¹cych na terapiê, w celu okrelenia heterogennoci danej choroby, jak i opracowywaniu nowych strategii leczenia.
Podsumowuj¹c, w ci¹gu ostatnich kilku lat badania z wykorzystaniem macierzy SNP zyska³y bardzo du¿¹ popularnoæ, g³ównie ze wzglêdu na ich w pe³ni auto-matyczne i szybkie wykonanie oraz mo¿liwoci zasto-sowania w wielu dziedzinach nauk biomedycznych. Dlatego te¿ macierze SNP sta³y siê niezwykle atrakcyj-nym narzêdziem badawczym w badaniach nad nowo-tworami, jak: ich indukcj¹, tempem rozwoju, oporno-ci¹ na zastosowane leczenie oraz opracowywaniu no-wych skuteczniejszych chemioterapeutyków.
Profilowanie ekspresji genów transkryptomika
Pomimo ¿e wszystkie komórki posiadaj¹ tê sam¹ informacjê genetyczn¹ zawart¹ w DNA, tylko oko³o 3-5% genów jest aktywnych w komórkach w danym czasie. Ta selektywna kontrola genomu skutkuje zró¿ni-cowaniem funkcjonalnym i morfologicznym komórek oraz indukuje szerokie spektrum odpowiedzi komór-kowej na zmiany rodowiskowe. Wiêkszoæ genomu jest wyciszona (selektywna represja) dziêki adaptacyj-nemu mechanizmowi polegaj¹cemu na regulacji eks-presji genów. Kontrola ta mo¿e przejawiaæ siê na po-ziomie transkrypcji b¹d translacji.
Dawniej badanie ekspresji przeprowadzano poprzez wizualizacjê transkryptów na drodze analiz gen po genie. Takie podejcie umo¿liwia³o uzyskanie wielu informacji na temat funkcji, struktury oraz regulacji ekspresji danych genów. Jednak w odpowiedzi na szkod-liwe czynniki, jak i podczas normalnego cyklu ¿ycio-wego komórki dochodzi do zmian w ekspresji, co po-ci¹ga za sob¹ aktywacje i/lub inaktywacje wielu genów. Z tego powodu zwraca siê uwagê na metody pozwala-j¹ce badaæ geny w du¿ej skali. Wraz z nadejciem in-formacji o bardziej kompletnym genomie cz³owieka oraz wiêkszoci ssaków techniki, takie jak seryjna ana-liza ekspresji genów czy mikromacierze DNA wyko-rzystane przy jego tworzeniu znalaz³y zastosowanie w codziennej praktyce laboratoryjnej (23). Techniki te dostarczaj¹ informacji na temat ilociowej oceny transkryptów co odzwierciedla poszczególne popula-cje komórkowe zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych. W zwi¹zku z tym transkryptomika zyska³a na znaczeniu jako nowe podejcie analityczne w badaniach biologicznych i biomedycznych.
Trans-kryptomika jest w rzeczywistoci nauk¹ o dynamice transkryptów. Obecnie nauka ta bada: 1) w jaki sposób poszczególne komórki komunikuj¹ siê ze sob¹ i two-rz¹ dziêki temu funkcjonalne tkanki, 2) jak zmienia siê ekspresja genów w odpowiedzi na zmiany rodowisko-we oraz 3) stara siê odkryæ przyczyny ludzkich chorób, jak i bada ich przebieg (przyczyny i skutki, znaczenie terapeutyczne oraz lepsze prognozowanie i diagnozo-wanie).
Metodyka
Macierze RNA pozwalaj¹ na profilowanie du¿ej iloci genów poprzez przygotowanie RNA z materia³u genetycznego, umieszczonego nastêpnie w oddzielnych próbkach. W wiêkszoci przypadków próby przezna-czone do analizy tworzy siê poprzez odwrotn¹ trans-krypcjê ca³kowitego RNA b¹d mRNA. Wyznakowa-ne nukleotydy podczas tej reakcji s¹ wbudowywaWyznakowa-ne w nowo powsta³¹ niæ cDNA. Inne protoko³y przewidu-j¹ bezporednie znakowanie RNA biotyn¹ b¹d pored-nie znakowapored-nie z wykorzystapored-niem polimerazy faga T7 przepisuj¹cej cDNA na cRNA.
W analizie polegaj¹cej na radioaktywnym znakowa-niu próby przygotowane z odrêbnych materia³ów
wyj-ciowych s¹ znakowane P32 i osobno hybrydyzowane
na indywidualnych p³ytkach. Inna strategia wykorzy-stuje do znakowania nukleotydów barwniki fluorescen-cyjne (powszechnie u¿ywane to Cy3 i Cy5) jako cz¹-steczki referencyjne. Próby mog¹ byæ odró¿niane na podstawie przyporz¹dkowania odmiennych fluorochro-mów. Nastêpnie miesza siê tê sam¹ iloæ ró¿nych prób i nak³ada na pojedyncz¹ mikromacierz. W zale¿noci od iloci wyjciowego mRNA, hybrydyzacja zajdzie w mniejszym lub wiêkszym stopniu na ka¿dej matrycy umieszczonej w membranie b¹d bezporednio zsynte-tyzowanej na slajdach lub innym noniku. W przypad-ku u¿ycia slajdów mikroskopowych o hybrydyzacji mówi stopieñ w³aciwego skanowania obrazu wybar-wionego fluorochromami Cy3 i Cy5.
Warto wspomnieæ o mo¿liwociach, jakie daje po³¹-czenie profilowania genów z mikromacierzami. Dziêki takiemu podejciu mo¿na uzyskaæ wyniki stanowi¹ce stosunek intensywnoci sygna³ów pochodz¹cych z obu tych technik. To z kolei pozwala na uwidocznienie ilo-ciowych ró¿nic w ekspresji poszczególnych genów miêdzy próbami. Generalnie o ró¿nicy w ekspresji mo¿-na mówiæ wtedy, gdy stosunek ten ma wartoæ powy¿ej ustalonej linii progowej (czêsto przyjmuje siê dwukrot-nie wiêksz¹ wartoæ stosunku intensywnoci ponad liniê progow¹), ale w przypadku analizowania wydaj-nych replikonów poziom istotnoci mo¿na statystycz-nie obni¿yæ. W typowym eksperymencie wykazuje siê ró¿nice w ekspresji setek, a nawet tysiêcy genów. Po-nadto, brak zmian w ekspresji znacz¹cego genu tak¿e mo¿e dostarczyæ cennych informacji. Nastêpnym kro-kiem jest obranie odpowiedniej strategii pozwalaj¹cej zanalizowaæ ogrom informacji dostarczonych przez technikê mikromacierzy.
Medycyna Wet. 2011, 67 (8) 530
Analiza wyników ekspresji
Profilowanie ekspresji genów szybko sta³o siê obsza-rem ³¹cz¹cym takie dziedziny nauki, jak: matematyka, statystyka, bioinformatyka i biologia. To interdyscypli-narne naukowe po³¹czenie buduje obecnie narzêdzia bioinformatyczne, które musz¹ sprostaæ dostarczonej du¿ej liczbie danych.
G³ównymi aspektami w analizach statystycznych i bioinformatycznych s¹: analiza obrazów, normaliza-cja danych, ró¿nicowa analiza ekspresji oraz centrali-zacja danych. Wiele z tych za³o¿eñ zosta³o ju¿ dobrze opisanych w wielu pracach (2, 3). W poni¿szej pracy nie skupiono siê na szczegó³ach, podjêto jedynie próbê przybli¿enia pewnych metod szeroko wykorzystywa-nych w analizach dawykorzystywa-nych.
Wydobywanie informacji na temat ekspresji genów wymaga statystycznej analizy ró¿nych poziomów eks-presji tych genów. W metodzie grupowanie grupuje siê razem obiekty (geny lub próby) na podstawie ich podobieñstw (7). Metoda ta traktuje obiekty jako jed-nostki matematyczne, obliczaj¹c odleg³oci miêdzy nimi i transformuj¹c je we wspó³czynniki korelacji. Takie podejcie jest szeroko stosowane w taksonomii oraz badaniach filogenetycznych.
Dwie metody z rodzaju grupowania s¹ obecnie wykorzystywane w bioinformatyce. Jest to grupowanie nadzorowane i nienadzorowane. Grupowanie nienadzo-rowane nie bierze pod uwagê poprzednich wyników analizy w celu unikniêcia narzuconych relacji miêdzy funkcjami, strukturami czy zmiennymi. Wymylono kilka algorytmów umo¿liwiaj¹cych tak¹ analizê m.in.: grupowanie hierarchiczne, grupowanie K-redniej, gru-powanie podzielone oraz samoorganizuj¹ce siê mapy (20). Po³¹czona metoda analizy genów i prób nazwana grupowaniem dwukierunkowym pozwala na przypisa-nie poszczególnych genów do odpowiednich próbek (1). W przeciwieñstwie do grupowania nienadzorowanego, grupowanie nadzorowane uwzglêdnia znane referencje do obiektów przy ich ³¹czeniu (4). Pozwala to na uzy-skanie wiêkszej b¹d mniejszej iloci dodatkowych in-formacji oraz na sklasyfikowanie danych. Dla przyk³a-du, kilka testów klinicznych oraz wskaników stanu chorobowego mo¿na wykorzystaæ w populacji pacjen-tów chorych na nowotwór, co pozwoli uzyskaæ funkcjê celu. Nastêpnie uzyskany model genetyczny mo¿na zastosowaæ przy podejciu globalnym. G³ówne zada-nie grupowania nadzorowanego polega na znalezieniu markerów klas dla ró¿nych wielkoci hierarchicznych. Typowa analiza wykorzystuje grupowanie nienadzo-rowane w celu uporz¹dkowania danych i opcjonalnie grupowanie nadzorowane dla uproszczenia ich inter-pretacji.
Podsumowuj¹c mo¿na stwierdziæ, ¿e wszystkie wy-mienione metody dostarczaj¹ wielu cennych informa-cji opieraj¹cych siê na surowych danych, opracowanych za pomoc¹ ró¿nych algorytmów grupowania b¹d po-wtórnie analizuj¹c dane uzyskane za pomoc¹ innych metod, jak analiza gen po genie (22).
Pimiennictwo
1.Alon U., Barkai N., Notterman D. A., Gish K., Ybarra S., Mack D., Levine A. J.: Broad patterns of gene expression revealed by clustering analysis of tumor and normal colon tissues probed by oligonucleotide arrays. Proc. Natal. Acad. Sci. USA 1999, 96, 6745-6750.
2.Altman R. B., Raychaudhuri S.: Whole-genome expression analtsis: Challenges beyond clustering. Curr. Opin. Struct. Biol. 2001, 11, 340-347.
3.Brazma A., Vilo J.: Gene expression data analysis. FEBS Lett 2000, 480, 17-24. 4.Brown M. P., Grundy W. N., Lin D., Cristianini N., Sugnet C. W., Furey T. S., Ares M. Jr, Haussler D.: Knowledge-based analysis of microarray gene expres-sion data by using support vector machines. Proc. Natal. Acad. Sci. USA 2000, 97, 262-267.
5.Cazaux C.: Genetic instability as a driver for oncogenesis. Bull Cancer 2010, 97, 1241-1251.
6.Chechetkin V. R., Turygin A. Y., Proudnikov D. Y., Prokopenko D. V., Kirillov E. V., Mirzabekov A. D.: Sequencing by hybridization with the generic 6-mer oligonucleotide microarray: An advanced scheme for data processing. J. Bio-mol. Struct. Dyn. 2000, 18, 83-101.
7.Eisen M. B., Spellman P. T., Brown P. O., Botstein D.: Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Natal. Acad. Sci. USA 1998, 95, 14863-14868.
8.Fabbri M., Calin G. A.: Epigenetics and miRNAs in human cancer. Adv Genet. 2010, 70, 87-99.
9.Favis R., Day J. P., Gerry N. P., Phelan C., Narod S., Barany F.: Universal DNA array detection of small insertions and deletions in BRCA1 and BRCA2. Nat. Biotechnol. 2000, 18, 561-564.
10.Hacia J. G., Brody L. C., Chee M. S., Fodor S. P., Collins F. S.: Detection of heterozygous mutations in BRCA1 using high density oligonucleotide arrays and two-colour fluorescence analysis. Nat. Genet. 1996, 14, 441-447. 11.Hacia J. G., Edgemon K., Fang N., Mayer R. A., Sudano D., Hunt N., Collins
F. S.: Oligonucleotide microarray based detection of repetitive sequence chan-ges. Hum. Mutat. 2000, 16, 354-363.
12.Kallioniemi A., Kallioniemi O. P., Sudar D., Rutovitz D., Gray J. W., Wald-man F., Pinkel D.: Comperative genomic hybridization for malecular cytogenic analysis of solid tumors. Science 1992, 258, 818-821.
13.Lam C. W., Lau K. C., Tong S. F.: Microarrays for personalized genomic medi-cine. Adv. Clin. Chem. 2010, 52, 1-18.
14.Lindblad-Toh K., Tanenbaum D. M., Daly M. J., Winchester E., Lui W. O., Villa-pakkam A., Stanton S. E., Larsson C., Hudson T. J., Johnson B. E., Lander E. S., Meyerson M.: Loss-of-heterozygosity analysis of small-cell lung carcinomas using single nucleotide polymorphism arrays. Nat. Biotechnol. 2000, 18, 1001-1005. 15.Liotta L., Petricoin E.: Molecular profiling of human cancer. Nat. Rev. Genet.
2000, 1, 48-56.
16.Mei R., Galipeau P. C., Prass C., Berno A., Ghandour G., Patil N., Wolff R. K., Chee M. S., Reid B. J., Lockhart D. J.: Genome-wide detection of allelic imbalance using human SNPs and high-density DNA arrays. Genome Res. 2000, 10, 1126-1137.
17.Roses A. D.: Pharmacogenetics and the practice of medicine. Nature 2000, 405, 857-865.
18.Ross D. T., Scherf U., Eisen M. B., Perou C. M., Rees C., Spellman P., Iyer V., Jeffrey S. S., Van de Rijn M., Waltham M., Pergamenschikov A., Lee J. C., Lashkari D., Shalon D., Myers T. G., Weinstein J. N., Botstein D., Brown P. O.: Systematic variation in gene expression patterns in human cancer cell lines. Nat. Genet. 2000, 24, 227-235.
19.Sapolsky R. J., Hsie L., Berno A., Ghandour G., Mittmann M., Fan J. B.: High-troughput polymorphism screening and genotyping with high-density oligonucleotide arrays. Genet. Anal. 1999, 14, 187-192.
20.Sherlock G.: Analysis of large-scale gene expression data. Curr. Opin. Immu-nol. 2000, 12, 201-205.
21.Slanar O., Zima T.: Pharmacogenetic aspects of current pharmacotherapy. Èas. Lek. Cesk. 2010, 149, 472-475.
22.Tamayo P., Slonim D., Mesirov J., Zhu Q., Kitareewan S., Dmitrovsky E., Lander E. S., Golub T. R.: Interpreting patterns of gene expression with self--organizing maps: Method and application to hematopoetic differentiation. Proc. Natal. Acad. Sci. USA 1999, 96, 2907-2912.
23.Velculescu V. E., Zhang L., Vogelstein B., Kinzler K. W.: Serial analysis of gene expression. Science 1995, 270, 484-487.
24.Voelkerding K. V., Dames S., Durtschi J. D.: Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology. J. Mol. Diagn. 2010, 12, 539--551.
25.Wen W. H., Bernstein L., Lescallett J., Beazer-Barclay Y., Sullivan-Halley J., White M., Press M. F.: Comparison of TP53 mutations identified by oligo-nucleotide microarray and conventional DNA sequence analysis. Cancer Res. 2000, 60, 2716-2722.
Adres autora: dr Bartosz Kempisty, ul. wiêcickiego 6, 60-781 Poznañ; e-mail: etok@op.pl
