A C T A U N I V E R S I T A T I S L O D Z I E N S I S
F O L IA B IO C H IM IC A E T B IO P H Y SIC A 9, 1992
Błażej Rózga
P O JE D Y N C Z E P Ę K N IĘ C IA D N A F IB R O B L A S TÓ W O D OSÓ B Z Z ES P O Ł EM D O W N A
W pra cy b a d a n o ra dio cz ułoś ć trze ch tris om iczny ch (triso m ia + 2 1 ) linii fibrob las - tów ludzkich na d zia łan ie pro m ie nio w a n ia ga m m a. O k re śla n o przebieg ind ukcji i n ap raw y pojedync zy ch pękn ięć w D N A w k o m ó rk a c h ho d o w an y ch in vitro. Stw ie rdzo no, że pojedyncze pęk nięcia w D N A ko m ó rek praw id łow ych i triso m icznyc h in d uk o w an e są z je d n a k o w ą w y da jn ośc ią, ró żne jes t n a to m ia s t te m po na praw y tych us zkodzeń . T riso m icz ne k o m ó rk i n a p ra w ia ją us zk od z en ia ok. trzy razy wolniej, co być m oże je st przy czyn ą ich wysokiej wrażliw ości na pro m ie n io w an ie jon izu ją ce, w yraża ją cej się m . in. zw iększo ną śm ierteln ością k om órek czy d u ż ą ilością a b erra cji c h ro m o -so m ow y ch w n ap ro m ie nio w a n y ch in vitro k o m ó rk a ch .
1. W ST Ę P
Zespół D ow na (DS) uw aru nk ow any trisom ią ch rom o so m u 21, zw iązany jest z różno rod nym i zabu rzen iam i, do któ ry ch m o żna zaliczyć szereg neuro
-p ath, zab urzeń fizjologicznych i zm ian biochem icznych. K om órki DS -p osiad a-ją zwiększony poziom i/lub aktyw ność enzym ów [12, 22], zm ien io ną ilość lub
własności m etabo litów [8], a w śród nich enzym ów zw iązanych z przem ianam i tlenu (S O D , G S H -P x ) [4, 7, 8, 13, 24],
Te biochem iczne niepraw idłow ości są p ra w d o p o d o b n ie zw iązane bezpo-średnio lub p ośred nio z efektem daw ki genu w ynikającym z obecności d od atko w ego ch ro m o som u 21 [8, 15], P ierw otne ko m órkow e, cytogenetyczne czy biochem iczne zm iany prow a dzą do specyficznej klinicznej m anifestacji zespołu D ow na. K om ó rk i DS ch arak tery zu ją się nien orm alnie w ysoką w raż-liwością na prom ieniow anie jo nizujące i związki chem iczne o m echanizm ie d ziałania po do bn ym do tego typ u pro m ienio w an ia [20, 23, 28]. W yrazem tego jest wysoki poziom ind uko w an ych aberracji chrom o som ow ych w ho dow anych
ch rom osom ow y ch in vivo i tym sam ym zw iększone ryzyko w ystępow ania ch o ró b now otw orow ych [6, 15]. Niejasny jest nato m iast wpływ prom ienio w a-nia UV na kom ó rk i ho do w an e in vitro [28].
M iarą wrażliwości k o m órek n a d ziałanie różnego rod zaju czynników fizyko-chem icznych m oże być, w śród innych p aram etró w , ilość pojedynczych i podw ójnych pęknięć w łańcuch ach D N A o raz przebieg procesów napraw y tych uszkodzeń w kom órce. Ściśle zw iązany z o brazem tych zm ian jest rodzaj i ilość aberracji chrom osom ow ych obserw ow anych w b ada nia ch cytogenetycz- nych k o m órek p o dd any ch d ziałan iu tych czynników .
W pracy za p om o cą prom ien io w an ia gam m a in d uk o w an o pojedyncze pęknięcia w D N A fibroblastów ludzkich h od ow anych in vitro o raz określan o przebieg n ap raw y uszkodzeń D N A w tych k om ó rkach .
2. M A T E R IA Ł I M E T O D Y
2.1. Materiał
D o b ad ań używ ano fib ro blastów ludzkich pochod zących z wyselek-cjon ow anych linii kom órk ow ych będących w p o siad aniu b ank ów ko m órek przy instytucjach naukow ych . K o m órki były przecho w yw ane w tem p eratu rze -1 96°C , w roztw orze surow icy cielęcej z d o d atk iem 3% D M S O . W y ko rzystano fibroblasty należące d o czterech linii k om órk ow ych, których charak tery sty kę p rzedstaw ion o w tab. 1.
T a b e l a 1
A ktyw no ś ć w y bra nyc h enzym ów zw iązan yc h z p rz em ian a m i tle nu w fib ro b la stac h ludzkich
L inia K a rio ty p n SO D - 1 U /m g b iałk a x ± s K a ta laz a k [l/S ]/m g b iałk a X + S G SH -P x nm ol N A D P H / m in/m g b iałk a X + S B 2 4 6,X Y 15 2,6 0,4 0,043 0,002 13,6 0,6* B - l 47 ,X X , + 21 15 4,2 0,8 0,047 0,002 18,5 1,2 T -7 4 47,X X ,+ 2 1 10 3,5 0,5 0,034 0,006 17,8 0,8 T -1 0 7 4 7 ,X Y ,+ 21 12 4,0 0,3 0,041 0,002 18,4 2,0 * n = 4
Po ch od ze nie ko m ó rek : Linia B - l , B 2 - fibro blas ty sk óry - In s ty tu t G en ety k i M edycznej, A k a d em ia N a u k M edyc zn ych, Z S R R ; L inia T -7 4 , T -1 0 7 - fib ro b la sty tk a n k i p ło d u - C e ntru m Z d ro w ia D zieck a, W arsza w a.
2.2. Metody
2.2.1. H o do w la ko m órek
H odow lę ko m órek p ro w adzo no klasyczną tech niką jedno w arstw ow ych k u ltu r k om órek diploidalnych. K o m órki po wyjęciu z p ar ciekłego azo tu szybko ro zm rażan o i um ieszczano w m edium w zrostow ym Eagle’a, w zbogaconym 10% surow icą cielęcą i 15% R TN z d od atk iem gentam ycyny (5 /ig/cm3 pożywki). K o m órki in ku b o w ano w tem p eratu rze 37°C, stężeniu C O2 5% i w ilgotności 100% w in ku b ato rze H eraeus, R F N . D N A fib rob lastó w zn ak ow ano m etyl3H tym id yną (R adiochem ical C entre, A m ersh am ) o akty w -ności specyficznej 2 C i/m M . K om ó rk i in ku b o w ano przez 4 8-6 0 godz. w poży-wce zawierającej 1 //C i/cm3 izoto pu. N astęp nie w ym ien iano m edium i przez 24 godz. h o do w an o k om ó rki w pożywce bez izotopu. K o m ó rk i p obieran o do b adań po trypsynizacji i dw uk rotny m przem yciu roztw orem PBS. Po po li-czeniu k om ó rek, sp o rz ądza no zaw iesinę fib ro blastów w PBS o zaw artości
1 x 106/cm 3.
2.2.2. W aru nki n ap ro m ienio w ania
Zawiesinę fibroblastów w PBS o stężeniu 106/c m3 nap rom ieniow yw ano w tem peratu rze 0°C, w pow ietrzu, prom ieniow aniem gam m a. Źród łem był 60C o o energii ok. 1 MeV i w ydajności 530 G y /g odz. P o naprom ieniow aniu, dla zah am o w ania procesów reperacyjnych, ko m ó rk i przechow yw ano w tem -peraturze 0°C.
W celu określenia przebiegu procesów reperacyjnych fibro blasty n apro m ie-niow yw ano daw ką 100 G y i następnie in k u bo w an o w m edium hodow lanym w tem p eratu rze 37°C.
2.2.3. U ltraw irow anie D N A w gradiencie gęstości sacharo zy alkalicznej
U ltraw irow anie D N A w gradiencie gęstości sacharo zy alkalicznej p ro w a-dzono według m etod y Mc G ra th i W illiam s [17]. Liniowy 5 -2 0 % ww. gradient (5 -20 % sach aro za w 1,0 M N a O H , 0,9 M N aC l, 0,001 M ED TA ) przygotow y-w an o y-w 4 ml poliallom eroy-w ych p ro b ó y-w k ach przy użyciu autom atyczn eg o urządzenia G ra dien t F o rm er typ 570, ISC O, USA.
Lizę ko m ó rek przep ro w ad zano na pow ierzchni roztw o ru sacharo zy w tem -p eraturze -pokojow ej -przez 40 min za -po m ocą ro ztw o ru lizującego o składzie: 0,5 M N aO H i 0,1 M ED TA . W irow anie w yko nyw ano w ultraw irów ce
Beckm an m odel L5-65 używ ając ro ztw o ru SW-60 przez 90 m in przy 40 45 tys. o br./m in w tem p eratu rze 10°C.
O dw irow an e p rób y frak cjo n ow an o n a ok. dw adzieścia cztery frakcje za p om ocą urządzenia G rad ien t F ra c tio n a to r m odel 640, firm y 1SCO, USA.
P ołożenie D N A z fib rob lastów po ultraw iro w aniu oznaczano m etodą rad io izoto po w ą w płynie scentylacyjnym d o roztw orów w odnych przy użyciu spek tro m etru Beckm an-9000, USA.
S tałą sedym entacji S2o,w dla D N A w poszczególnych frakcjach w irow anych p ró b ob liczano z zależności B urgi-H ershey [5], m asę cząsteczkow ą z rów n ania S tudiera [26], Dla każdej wirowanej p ró by w y znaczano średn ią w ażoną m asę cząsteczkow ą M w i liczbę średnich m as cząsteczkow ych M n według zależności opisanej przez O rm erod a [18].
2.4. Oznaczenia enzymatyczne
A ktyw ność enzym ów w fib ro blastach ludzkich o zn aczan o w cytosolu uzyskanym z badanych ko m ó rek po uprzedn im od w irow an iu ho m o genatu ko m órk ow eg o przy 100 000 x g . A k tyw ność d ysm u tazy p onadtlen kow ej o zn a-czan o na podstaw ie reakcji redukcji N B T w edług m etod y opisanej przez B eaucham p i F ridovich [3], aktyw ność k atalazy w edług m etody A ebi’ego [1], P o dstaw ą oznaczeń w tej m etodzie jest rozk ład I b O i przez k atalazę i zw iązany z tym spadek absorbancji przy 240 nm . D o oznaczeń aktyw no ści peroksydazy glu tationo w ej w cytosolu k om órko w y m w yk orzy stan o m etod ę p o d an ą przez H op kinsa [11].
3. W Y N I K I
W pracy , chcąc określić rolę enzym ów anty oksy dacy jnych, o znaczano ak tyw ność S O D , katalazy i p eroksydazy g lu tatio n u w cytosolu prawidłow ym i trisom icznych fibroblastów skóry i tk a n ki płod u. D an e opisu jące aktyw ność ww. enzym ów w b ad an ych k o m ó rk ach przed staw io no w tab. 1.
S tw ierdzono , że w k om ó rkach trisom icznych w poró,wnaniu z k om órkam i praw idłow ym i występuje o ok. 50% zw iększona aktyw ność dysm utazy p o n a d -tlenkowej i niewiele - w gran icach 30% - zw iększona ak tyw ność perok sydazy g lu tation u. A ktyw ność k atalazy w p oró w n yw anych k om ó rkach była zbliżona.
M etod ą u ltraw irow an ia w alkalicznym gradiencie gęstości sacharozy ok reślano przebieg indukcji i nap raw y pojedynczych pęknięć wywołanych prom ien iow aniem jonizujący m w D N A badan y ch kom órek. B adan e fibroblas- ty n ap rom ien io w yw an o daw kam i 50-300 G y, zm ieniając czas ekspozycji. P rzy kładow ą zależność zm ian m asy cząsteczkow ej D N A fib ro blastów uzys-k an ą dla uzys-ko m óreuzys-k praw idłow ych przedstaw ia rys. 1. P o do b ne zależności o trz ym an o po ultraw iro w an iu D N A ko m ó rek pozostałych linii fibroblastów .
Rysunek 2 przedstaw ia zależności daw kaefek t uzy skane dla indukcji pojed yn -czych pęknięć D N A fib ro b lastów ludzkich w zakresie daw ek 50-300 Gy. S tw ierd zo no, że prom ien iow anie jo nizu jące w zakresie stosow anych daw ek w jed n ako w ym stop niu induk uje uszkodzenia w D N A p oró w nyw any ch ko m órek. Ilość ind uko w any ch pęknięć wynosi ok. 3 x l 010 D ', G y ', co o d po w iad a energii ok. 30 eV potrzebnej d o w yw ołania pojedynczego p ęk-nięcia.
M w x 1 0 7
d a w k a [ G y ]
Rys. I. Z m ia n a m asy czą stec zkow ej (M w) D N A fib ro b la stó w linii B-2 pod wpływem p ro m ie n io w an ia ga m m a
d a w k a [Gy]
linia B-e — linia T - 107 Unia B-l — Unia T-74
Rys. 2. Z m ian y o dw ro tn oś c i śre dn ich m as czą stec zko w y ch w funkcji da w k i p ro m ie n io w an ia zależn ość d aw k a-e fe k t
M W ( % )
c z a i I n k u b a c j i ( m i n )
l i n i a B - 2 - ® ~ l i n i a B - l l i m a T - 1 0 7 — b - l i n i a T - 7 4
R ys. 3. K in etyk a z m ia n m asy cząstec zkow ej D N A p o dc za s inku bac ji
i l o ś ć p o j e d y n c z y c h p ę k n i ę ć D NA [ % ]
czas inkubacji [min]
linia B-2 - B - linia B-l Unia T-107 -0 - Unia T-74
Rys. 4. N a p ra w a po jed ync zyc h p ękn ięć w D N A fib ro b la stó w
N a rys. 3 p rzedstaw ion o zm iany m asy cząsteczkow ej D N A fibro blastów ludzkich n ap ro m ien io w an ych d aw ką 100 G y i następ nie ink ubo w any ch w te m p eratu rze 37°C w m edium ho dow lan ym . Z aob serw ow an o, że w raz ze w zro stem czasu inkubacji n astępuje w zrost m asy cząsteczkowej D N A , co
świadczy ,o tym , że w badan ych k om órk ach zachodzi n apra w a uszkodzonego D N A . Szczególnie w yraźny w zrost m asy cząsteczkowej w ystępuje podczas inkubacji ko m ó rek linii B-2, tj. ko m órek o praw idłow y m kariotypie. Przebieg •procesu n ap raw y pojedynczych pęknięć w D N A przed staw io no na rys. 4.
Z przedstaw ionych danych w ynika, że w bad any ch k om ó rk ach różne jest tem p o nap raw y pow stałych uszkodzeń. C zas nap raw y 50% pojedynczych pęknięć D N A wynosi dla kom órek praw idłow ych ok. 12 m in, w obec 30 min p otrzebn ych do nap raw y tej samej ilości uszkodzeń przez trisoiniczne ko m ó rk i skó ry i pło du. Sądzić należy, że m echanizm y n ap raw y uszkodzeń D N A w trisom icznych k om ó rk ach fun kcjo nują z m niejszą w ydajnością.
4. D Y SK U S J A
P odw yższona wrażliwość różn oro dn ych ko m órek poch odzący ch od osób z zespołem D o w na na pro m ien iow an ie jon izujące, prom ien io w an ie X czy szereg zw iązków chem icznych o p od o b ny m w oln oro dn iko w ym m echanizm ie d ziałania była przedm iotem szeregu doniesień [8, 15, 23],
W p racach tych wnioski au to ró w opierały się głów nie na obserw acjach ilości aberracji ch ro m osom ow ych w k o m órk ach n aprom ien io w an ych in vitro [15, 21, 22] i ró żn oro d ny ch testach żyw otności ko m ó rek [15, 28]. N a to m iast b rak jest jedno zn aczn eg o stano w iska w spraw ie in dukcji i n ap raw y pęknięć w D N A tych patologicznych kom órek.
S tosując p rom ien iow an ie jo nizujące do indu kcji pojedynczych i po dw ój-nych pęknięć w D N A trisom iczój-nych fib ro blastów S teiner i W oo ds [25] nie w ykazali różnic w ilości tych uszko dzeń w zm ienionych i prawidłow ych k om ó rk ach . N ie w ykazano rów nież od m ienno ści w obecności czy tem pie procesów reperacyjnych owych uszkodzeń.
N ato m iast A h an asiou i wsp. [2] o raz L eon ard i M erz [15] w pracach na ho do w a ny ch lim focytach uzyskali wyniki świadczące o obniżeniu szybkości n ap raw y pojedynczych pęknięć w k o m órk ach pochod zących od o sób z ze-społem D o w n a. O istnieniu różnic w indukcji pojedynczych pęknięć w D N A trisom icznych k om ó rek donosili również Łukaszew icz i wsp. [16] w lim -fo cytach krw i obw odow ej o raz K ędziora i wsp. [14] - w hodow an ych fibro blastach skóry.
Sądzić należy, że w poró w n yw an ych k o m ó rk ach in duk cja pojedynczych pęknięć przebiega z jed n ak ow ą w ydajn ością, n a to m iast w trisom icznych ko m ó rk ach po chod zących od osób z zespołem D ow n a m echanizm y nap raw y uszkodzeń D N A fu nk cjon ują z m niejszą w ydajnością, co m oże pow odow ać, że część z nich nie zo stanie nap raw io n a i poprzez pod w ójne pęknięcia m oże zo stać zm ienion a w obserw ow an e w m etafazie aberracje stru k tu raln e ch ro m o -som ów bądź po w odo w ać zw iększoną śm iertelność kom órek.
5. B IB L IO G R A F IA
[1] A e b i H. (1974), M e thod s in E nzy m a tic A na lysis , H. U . B ergm eyer (red.), A cad em ic Press, N ew Y o rk , L on d o n, 2, 673 674. [2] A t h a n a s i o u K. , S i d e r i s E. G. , B a r t s o c a s C. (1980), P ed iat. R es., 14, 3 36 - -3 3 8 . [3] B e a u c h a m p C., F r i d o v i c h I. (1971), A nal. B iochem ., 44, 276 287. [4] B e r m a n H. C. , A d n a m s C . M ., J u a n e t i c h K. M ., K e n e k J. E. (1976), Biochem . J., 157, 237-241. [5] B u r g i E., H e r s h e y A. D. (1963), Biophys. J., 3, 309 311. [6] C a i r n s J. (1981), „ N a tu re ” , 289, 353 357. [7] C r o s t i N. , S e r r a A. . R i g o A., V i g l i n o P. (1976), H u m . G e n e t., 31, 197 202. [8] E p s t e i n C. J. (1983), B iological A spec ts o f A lz h e im er ’s Disease, R . K a tz m a n (re d.), C o ld
Sp ring H a rb o r L a b o ra to ry , C o ld Sp ring H a rb o r, 168-182.
[9] F r i d b e r g E. C. , A n d e r s o n C „ B a n d u r a T „ C o m e R. , S i m o n s R. (1978), D N A R epair M echanism s, A c ade m ic Press, N ew Y ork , 1-38.
[10] F r i d b e r g E. C ., E h m a n n U . K., W i 11 i a m s J. I. (1979), A d van ces in R adiation B iology, J. H. L e tt, H . A dle r (red.), A ca dem ic Press, N ew Y o rk , 8, 85-1 17.
[11] H o p k i n s B. P. (1973), Br. J. H ae m a to l., 25, 563-575 . [12] K ę d z i o r a J., Ł u k a s z e w i c z R. (1982), Z ag. Biof. W spó ł., 7, 111 138. [13] K ę d z i o r a J., J e s k e J , W i t a s H. , B a r t o s z G. , L e y k o W . (1977), A c ta Biol. M ed. Sei. G erm ., 36, 779-782. [14] K ę d z i o r a J., Si b i ń s k a E., R ó z g a B., B a r t o s z G . (1986), „ H e re d ita s ” , 105, 161— -1 6 2 . [15] L e o n a r d J. C. , M e r z T. (1982), M u t. Res., 105, 417-4 22. [16] Ł u k a s z e w i c z R., S i b i ń s k a E., K ę d z i o r a J. (1982), „ H e re d ita s ” , 97, 155-156. [17] M c G r a t h R. A. , W i l l i a m s R. W. (1966), „ N a t u re ” , 212, 534-535.
[18] O r m e r o d M . G . (1973), P hysico -C hem ic al P roperties o f N ucleic A cid, A c ad em ic Press, L on d o n , 139-145.
[19] O t s u k a F. , T a r o n e R. E., R o b b i n s J. H. (1983), C lin. R es., 31, 658A.
[20] O t s u k a F ., T a r o n e R. E ., S e g u i n L. R ., R o b b i n s J. H. (1985), J. N e u ro l. Sei., 69, 103-112.
[21] P r e s t o n R. J. (1981), E n viron . M u ta g en ., 3, 85-89 .
[22] P r i c e D. J., W h i t e h o u s e P . J. , S t r u b l e R . G . , C o y l e J. T . , D e L o n g M . R. , C o r k L. C. , H e d r e e n H . (1982), A lz h eim e r ’s Disease, D o w n ’s S yn dr om e an d A gin g, F. M . Sinex, C . M . M a rril (re d.), N e w Y o rk A c ade m y o f Sciences, N ew Y o rk , 145-164.
[23] R o b b i n s J. H. (1983), Cellular R esponses to D N A D am age, E. C . F ried b erg, B. A. B ridges (re d.), A lan R. Liss, N ew Y o rk , 671-700.
[24] S i n e t P. M. , C o u t u r i e r J. , D y t r i l l a u x B., P o i s s o n i e r M. , R a o u l O. , A l l a r d D. , L e j e u n e J., J e r o m e H . (1976), Exp. Cell Res., 97, 47-55.
[25] S r e i n e r M. E., W o o d s W. G . (1984), M u t. Res., 95, 515-523. [26] S t u d i e r W . (1965), J. M ol. Biol., 11, 373-376.
[27] V i j a y a l a x m i A. , E v a n s H. J. (1982), M u t. R es., 105, 107-113.
[28] Y o t t i L. P., G l o v e r T. W. , T r o s k o J. E., S e g a l D. J. (1980), Pe diat. R es., 14, 88 -92 .
W pły nęło d o R edakc ji K a te d ra Biofizyki
„ F o lia bio ch im ica et biop h y sica ” U n iw e rs y te tu Ł ó dzk ie go 25.10.1991
B lazej R ozga
D N A S IN G L E S T R A N D B R E A K S IN F IB R O B L A S T F R O M D O W N S Y N D R O M E P A T IE N T S
T h e ra d ios en sitiv ity o f tree triso m ie (tris om ia + 2 1 ) s tra in s o f h u m an fib ro b la s ts to g am m a ra d ia tio n h as been inves tiga ted in vitro a n d th e c ous es o f ind u c tio n a n d re p air o f single s tra n d D N A b re a ks in these cells have been e stim a ted . T he single s tra n d b re a k s in D N A o f n o rm al an d tris om ie cells ha ve been fou n d to be a m e lio rated w ith a n a p p ro x im a te ly e qual efficiency. R ep air has been fo un d to be three tim es slow er in triso m ie cells c o m p a red to th eir n o rm a l relev ant, m ost likely d u e to th eir elev ated se nsitivity to ion izing ra d ia tio n a nd th e follo w ing m o rta lity o f triso m ie cells, a n d /o r th e p o te ntia l oc cu rre nce o f a grea t n u m b e r o f c h ro m o s o m e a b e rra tio n s in cells irrad ia te d in vitro.
