Działanie in vitro olejku eukaliptusowego (Oleum Eucalypti) na bakterie mikroaerofilne

*Anna Kędzia

_{, Andrzej W. Kędzia}

Działanie in vitro olejku eukaliptusowego

(Oleum Eucalypti) na bakterie mikroaerofilne

The activity in vitro of eucalyptus oil (Oleum Eucalypti)

to microaerophilic bacteria

1

_{Emerytowany profesor dr hab. n. med. Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego}

2

_{Katedra Auksologii Klinicznej i Pielęgniarstwa Pediatrycznego, Uniwersytet Medyczny}

im. Karola Marcinkiewicza w Poznaniu

Kierownik Katedry: dr hab. n. med. Andrzej W. Kędzia, prof. nadzw.

SUMMARY

Introduction. The essential oil (Eucalyptus globulus, family Mirtaceae) is a widely used in medicine as analgesic, anti-inflammatory

and antipyretic. It is applied in cosmetics, food and pharmaceutical industries. The essential oil is obtained by the steam distillation of leaves of the plant. Major constituents of the oil is 1,8-cyneole. Oil contains among others: α- and β-pinene, p-cymene, camphene,

γ-terpinene, d-limonene, α-phelandrene, allo-aromadendrene, aromadendrene, globulol, aldehydes (myrtenal) and ketones (carvone

and pinocarvone). Eucalyptus oil posses antibacterial, antiviral, antifungal, anti-protozoa and insecticidal activity.

Aim. The aim of this study was to investigate the susceptibility of microaerophilic bacteria to eucalyptus oil.

Material and methods. The bacteria were isolated from oral cavity. A total 26 strains of isolated from patients and 6 reference strains

were tested. The susceptibility (MIC) was determined two fold dilution method in Brucella agar supplemented with 5% sheep blood. Concentration of oil used were: 0.06, 0.12, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 mg/ml. The inoculum containing 105 _{CFU/spot was transferred}

with Steers replicator upon the surface of agar which containing appropriate eucalyptus oil (Semifarm) concentrations as well upon that with no oil added (strains growth control). Incubation was performed for 48 hrs at 37°C in anaerobic jar and microaerophilic conditions (CAMPY Pak, BBL) or anaerobic conditions for control strains. The MIC was defined as the lowest concentrations of oil that completely inhibited the growth of tested bacterial strains.

Results. The results of investigation indicated, that the most susceptible to eucalyptus oil were the strains from the species of

Ag-gregatibacter actinomycetemcomitans. MIC for 50% strains was ≤ 0.06 mg/ml, and for another 33% of the strains from 0.25 to 1.0 mg/ml. The oil showed good activity against the Eikenella corrodens strains. The growth of 55% of the strains was inhibited with range ≤ 0.06-0.12 mg/ml. The strains from the species of Campylobacter sputorum were the lowest sensitive to eucalyptus oil (MIC for 60% strains was ≥ 4.0 mg/ml).

Conclusions. The eucalyptus oil showed good activity against tested microaerophilic bacteria. The most susceptible to oil were the

strains from species of Aggregatibacter actinomycetemcomitans. The Gram-negative rods Campylobacter sputorum were the lowest sensitive to eucalyptus oil.

Keywords: susceptibility, microaerophilic bacteria, infection, eucalyptus oil, oral cavity

STRESZCZENIE

Wstęp. Olejek eukaliptusowy (Eucalyptus globulus, rodzina Myrtaceae) jest często stosowany w medycynie, jako środek przeciwbólowy,

przeciwzapalny i przeciwgorączkowy. Jest on też używany w kosmetyce, żywności i przemyśle farmaceutycznym. Olejek uzyskuje się z liści rośliny drogą destylacji z parą wodną. Głównym jego składnikiem jest 1,8-cyneol. Wśród innych związków, które zawiera, są:

α- i β-pinen, p-cymen, kamfen, γ-terpinen, d-limonen α-felandren, alloaromadendren, aromadendren, globulol, aldehydy (myrtenal)

i ketony (karwon i pinokarwon). Olejek eukaliptusowy wykazuje właściwości przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe i przeciwgrzybicze, ponadto oddziałuje przeciw pierwotniakom i insektom.

Cel pracy. Celem badań była ocena wrażliwości bakterii mikroaerofilnych na olejek eukaliptusowy.

Materiał i metody. Bakterie zostały wyizolowane z jamy ustnej. Badaniom poddano ogółem 26 szczepów pochodzących od pacjentów

i 6 szczepów referencyjnych. Wrażliwość (MIC) drobnoustrojów oznaczono metodą seryjnych rozcieńczeń w agarze Brucella z do-datkiem 5% krwi baraniej. Inokulum zawierające 105 _{jtk/kroplę nanoszono aparatem Steersa na powierzchnię agaru zawierającego}

odpowiednie rozcieńczenie olejku eukaliptusowego (Semifarm) lub bez niego (kontrola wzrostu szczepów). Użyto następujących stężeń olejku: 0,06, 0,12, 0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0 mg/ml. Inkubację posiewów prowadzono w anaerostatach w warunkach mikroaero-filnych (CAMPY Pak, BBL) oraz w warunkach beztlenowych (dla szczepów wzorcowych) przez 48 godz. w 37°C. Za MIC zostało przyjęte takie najmniejsze stężenie olejku, które całkowicie hamowało wzrost badanych szczepów bakterii.

artretyzmie i reumatyzmie (8, 9, 14, 16, 25-30). Z

ba-dań różnych autorów wynika, że olejek eukaliptusowy

ma działanie przeciwbakteryjne, przeciwgrzybicze,

przeciwwirusowe, działa także przeciw

pierwotnia-kom i przeciw insektom (26, 28, 31-42). Jednak

w piśmiennictwie brakuje danych na temat

aktyw-ności olejku wobec bakterii rosnących w warunkach

mikroaerofilnych.

Cel pracy

Celem badań była ocena wrażliwości na olejek

eu-kaliptusowy bakterii mikroaerofilnych pochodzących

z jamy ustnej.

Materiał i metody

Bakterie mikroaerofilne wykorzystane w

ba-daniach zostały wyizolowane z materiałów, które

pobrano z jamy ustnej pacjentów. Doświadczenia

objęły łącznie 32 szczepy, w tym 26 szczepów

pochodzących od pacjentów, należących do

ga-tunków Aggregatibacter

actinomycetemcomi-tans (12 szczepów), Campylobacter sputorum (5),

Eikenella corrodens (9) oraz 6 szczepów

wzorco-wych z gatunków Bacteroides fragilis ATCC 25285,

Bacteroides ovatus ATCC 8483, Bacteroides

vulga-tus ATCC 8482, Fusobacterium nucleatum ATCC

25286, Propionibacterium acnes ATCC 11827

i Peptostreptococcus anaerobius ATCC 27337.

Do badań wykorzystano olejek eukaliptusowy

fir-my Semifarm. Wrażliwość (MIC) bakterii

oznaczo-no metodą seryjnych rozcieńczeń w agarze Brucella

z dodatkiem 5% krwi baraniej. Olejek rozpuszczano

w dwumetylosulfotlenku (DMSO, Serwa), a

następ-nie dodawano do jałowej wodzy destylowanej w celu

uzyskania stężeń wynoszących: 0,06, 0,12, 0,25, 0,5,

1,0, 2,0, 4,0 mg/ml. Inokulum, zawierające 10

_jtk

(jednostek tworzących kolonie) w jednej kropli,

na-noszono aparatem Steersa na powierzchnię agaru

zawierającego odpowiednie rozcieńczenie olejku

eu-kaliptusowego. Kontrolę wzrostu szczepów stanowiło

podłoże niezawierające olejku. Inkubację podłoży

prowadzono w 37°C przez 48 godz., w anaerostatach

Wstęp

W składzie flory bakteryjnej jamy ustnej, poza

do-minującymi beztlenowcami, występują też bakterie

mikroaerofilne. Do wzrostu wystarcza im obecność

od 5 do 20% tlenu. Uznaje się je za drobnoustroje

oportunistyczne ze względu na możliwość

powo-dowania zakażeń lub uczestnictwa w zakażeniach

mieszanych, zarówno w jamie ustnej, jak i poza

nią. Ich obecność stwierdzono w bakteryjnej błonce

nazębnej (dental plaque) oraz w kieszonkach

przy-zębnych (1-5). Niektóre gatunki tych bakterii mogą

być przyczyną chorób przyzębia, ropni

okołozębo-wych, zakażeń miazgi zęba, dziąseł i ropni

około-implantowych. Ponadto uczestniczą w chorobach

różnych narządów, w tym sercowo-naczyniowych,

lub je powodują.

Zioła były wykorzystywane w lecznictwie od

sta-rożytności. Kolejne wieki dostarczały nowych

infor-macji, poszerzając możliwości wykorzystywania ich

w celach terapeutycznych i profilaktycznych. Badania

dowiodły, że substancje ziołowe, a szczególnie olejki

eteryczne, charakteryzują się szerokim działaniem,

w tym przeciwzapalnym, przeciwbólowym, ściągającym

i przeciwdrobnoustrojowym.

Olejek eukaliptusowy jest otrzymywany z

euka-liptusa gałkowego (Eucalyptus globulus Lab.,

rodzi-na Myrtaceae). Drzewo rodzi-należy do szybko rosnących

i osiąga wysokość nawet do 60 m. Uprawiane głównie

w Australii i na Tasmanii, a obecnie także w Indonezji,

Nowej Zelandii i Indiach. Liście drzewa są

wykorzy-stywane do produkcji olejku eukaliptusowego, na

drodze destylacji z parą wodną.

Przeważającym składnikiem olejku jest

eukalip-tol (1,8-cyneol), którego zawartość może wynosić do

90% (6-12). W mniejszych ilościach są też wytwarzane

monoterpeny, a wśród nich: α- i β-pinen, p-cymen,

kamfen, γ-terpinen, d-limonen i α-felandren;

seskwi-terpeny, obejmujące: alloaromadendren,

aromaden-dren i globulol; aldehydy (myrtenal) oraz ketony

(kar-won i pinokar(kar-won) (7-9, 11, 13-24).

Olejek jest stosowany przede wszystkim w

za-każeniach dróg oddechowych, chorobach skóry,

Wyniki. Wyniki badań wskazują, że najbardziej wrażliwe na olejek eukaliptusowy były szczepy z gatunku Aggregatibacter

actinomyce-temcomitans. MIC dla 50% wymienionych szczepów wynosiło ≤ 0,06 mg/ml, a dla kolejnych 33% szczepów od 0,25 do 1,0 mg/ml. Olejek wykazał dużą aktywność wobec szczepów Eikenella corrodens. Wzrost 55% tych szczepów był hamowany w zakresie stężeń ≤ 0,06-0,12 mg/ml. Pałeczki z gatunku Campylobacter sputorum były mniej wrażliwe na olejek eukaliptusowy (MIC dla 60% szczepów wynosiło ≥ 4,0 mg/ml).

Wnioski. Olejek eukaliptusowy wykazał dużą aktywność wobec badanych bakterii mikroaerofilnych. Najbardziej wrażliwe na olejek

były szczepy z gatunku Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Szczepy Gram-ujemnych pałeczek z gatunku Campylobacter spu-torum okazały się najmniej wrażliwe na badany olejek eukaliptusowy.

lub wyższych. Pałeczki Gram-ujemne z gatunku

Eikenella corrodens także okazały się wysoce

wraż-liwe na olejek. Spośród nich, wzrost 55% szczepów

był hamowany w zakresie stężeń ≤ 0,06-0,12 mg/ml.

Olejek był najmniej aktywny wobec szczepów z

ga-tunku Campylobacter sputorum, z których więcej

niż połowa wymagała do zahamowania wzrostu

wyższych stężeń (MIC dla 60% szczepów wynosiło

≥ 4,0 mg/ml).

Z wcześniejszych naszych badań aktywności olejku

eukaliptusowego wobec bakterii beztlenowych wynika,

że te drobnoustroje były mniej wrażliwe na olejek

eukaliptusowy (39). Stężenia ≤ 0,06-1,0 mg/ml

ha-mowały wzrost 57% szczepów bakterii beztlenowych,

a 65% badanych obecnie bakterii mikroaerofilnych.

Z badań wynika, że bakterie tlenowe wykazują

zróż-nicowaną wrażliwość na olejek, jednak do

zahamo-wania wzrostu zwykle wymagają użycia wyższych

stę-żeń. Aktywność olejku, wykorzystując różne metody

badawcze wobec szczepów Staphylococcus aureus,

wykazali Fit i wsp. (19), Vidya i Vidya (34), Trivedi

w warunkach mikroaerofilnych (CAMPY Pak, BBL)

oraz w warunkach beztlenowych (dla szczepów

wzor-cowych). Za MIC przyjmowano najmniejsze stężenie

olejku, które całkowicie hamowało wzrost badanych

szczepów bakterii.

Wyniki i omówienie

Uzyskane wyniki wrażliwości bakterii

mikroaero-filnych na olejek eukaliptusowy zostały

przedsta-wione w tabeli 1, a szczepów wzorcowych w tabeli 2.

Spośród wszystkich badanych szczepów 65% było

wrażliwych na niskie stężenia olejku w zakresie

≤ 0,06-1,0 mg/ml. Pozostałe szczepy wymagały do

zahamowania wzrostu stężeń wynoszących 4,0 mg/

ml i wyższych. Największą wrażliwością

charaktery-zowały się Gram-ujemne pałeczki mikroaerofilne

z gatunku Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Wartości MIC dla 50% tych szczepów wynosiły

≤ 0,06 mg/ml, a dla kolejnych 33% szczepów od 0,25

do 1,0 mg/ml. Tylko 17% szczepów wymagało do

zahamowania wzrostu stężeń w wysokości 4,0 mg/ml

Tab. 1.

Wrażliwość 26 szczepów bakterii mikroaerofilnych na olejek eukaliptusowy

Drobnoustroje _szczepówLiczba

Najmniejsze stężenie hamujące (MIC) olejku eukaliptusowego (mg/ml)

≥ 4,0 2,0 1,0 0,5 0,25 0,12 ≤ 0,06

Aggregatibacter actinomycetemcomitans 12 2 1 2 1 6

Campylobacter sputorum 5 3 1 1

Eikenella corrodens 9 4 1 4

Bakterie mikroaerofilne, ogółem 26 9 2 2 1 1 11

Tab. 2.

Wrażliwość 6 szczepów wzorcowych bakterii beztlenowych na olejek eukaliptusowy

Drobnoustroje _szczepówLiczba

Najmniejsze stężenie hamujące (MIC) olejku eukaliptusowego (mg/ml) ≥ 4,0 2,0 1,0 0,5 0,25 0,12 ≤ 0,06 Bacteroides fragilis ATCC 25285 1 1 Bacteroides ovatus ATCC 8483 1 1 Bacteroides vulgatus ATCC 8482 1 1 Fusobacterium nucleatum ATCC 25286 1 1 Propionibacterium acnes ATCC 11827 1 1 Peptostreptococcus anaerobius ATCC 27337 1 1

Wnioski

1. Olejek eukaliptusowy był wysoce aktywny wobec

testowanych bakterii mikroaerofilnych.

2. Najbardziej wrażliwe były Gram-ujemne pałeczki

z gatunku Aggregatibacter

actinomycetemcomi-tans.

3. Olejek charakteryzował się najmniejszą

aktyw-nością wobec szczepów z gatunku Campylobacter

sputorum.

i Hotchandani (43), Ghalem i Mohamed (44), Yousef

i wsp. (35) oraz Kumar i wsp. (38). Działanie wobec

Gram-ujemnych pałeczek opisali Kędzia i wsp. (33),

Delaquis i wsp. (37), Rosato i wsp. (45), Yousef

i Tawil (35), Kalemba i Kunicka (32) oraz Kumar

i wsp. (38).

Podsumowując wyniki przeprowadzonych badań,

można zaznaczyć, że olejek eukaliptusowy wykazał

dużą aktywność wobec ocenianych bakterii

mikro-aerofilnych.

Piśmiennictwo

1. Magier DL, Ximenez-Fyvie LA, Haffajee AD i wsp. Distri-bution of selected bacterial species on intraoral surfaces. J Clin Periodontol 2003; 30:644-54.

2. Nishihara T, Koseki T. Microbial etiology of periodontitis. Periodontology 2004; 36:14-26.

3. Socransky SS, Haffajee AD. Periodontal microbial ecology. Periodontology 2005; 38:135-87.

4. Canigia LF, Moreira AN, Furman L i wsp. Microbial asses-sment of subgingival plaques from Argentinian patients with adult periodontitis. Anaerobe 1999; 5:263-5.

5. Sonicini J, Kanasi E, Lu SC i wsp. Oral microbiota of children in a school-based dental clinic. Anaerobe 2010; 16:278-82. 6. Silva J, Abebe W, Sausa SM i wsp. Analgesic and

anti-inflammatory effects of essential oils of Eucalyptus. J Ethno-pharmacol 2003; 89:277-83.

7. Sacchetti G, Maietti S, Muzzoli M i wsp. Comparative eva-luation of 11 essential oils of different origin as functional antioxidants, antiradicals and antimicrobials in food. Food Chem 2005; 91:621-32.

8. Balacs T. Cineole-rich-eucalyptus. Int J Aromather 1997; 8(2):15-21.

9. Sadlon AE, Lamson DW. Immune-modifying and antimicro-bial effects of eucalyptus oil and simple inhalation devices. Altern Med Rev 2010; 15(1):33-46.

10. Upadhyay S. Essential oils: antimicrobial, anthelminthic, an-tiviral, anticancer and anti-insect properties. J Appl Biosci 2010; 36(1):1-22.

11. Pereira SI, Freire CSR, Netp CP i wsp. Chemical compo-sition of the essential oil distilled from the fruits of

Euca-lyptus globulus grown in Portugal. Flavour Fragr J 2005;

20:407-9.

12. Pandey RR, Dubey RC, Saini S. Phytochemical and anti-microbial studies on essential oils of some aromatic plants. Afric J Biotechnol 2010; 9(28):4364-8.

13. Bacchir RG, Bengali M. Antibacterial activity of leaf essen-tials oils of Eucalyptus globulus and Eucalyptus

camaldulen-sis. Afr J Pharm Pharmacol 2008; 2(10):211-5.

14. Bhattaram VA, Graefe V, Kohler C i wsp. Pharmacokinetics and bioavailability of herbal medicinal products. Phytomed 2002; Suppl III. 9:1-33.

15. Indian Pharmacopeia. Delhi: Government of India, Ministry of Health and Family Welfare – Controller of Publications 1996; Vol. 1:310.

16. Inoue S, Yamaguchi H, Takizawa T. Screening of the anti-bacterial effects of a variety of essential oils on respiratory tract pathogens, using a modified dilution assay method. J Infect Chemother 2001; 7:251-4.

17. Debbarma J, Kishore P, Nayak BB i wsp. Antibacterial acti-vity of ginger, eucalyptus and sweet orange peel essential oils on fish-borne bacteria. J Food Proc Preserv 2013; 37:1022-30.

18. Bosnic T, Softic D, Grujic-Vasic J. Antimicrobial activity of some essential oils and major constituents of essential oils. Acta Med Academ 2006; 35:19-22.

19. Fit IN, Rapuntean G, Rapuntean S i wsp. Antibacterial ef-fect of essential vegetal extracts on Staphylococcus aureus compared to antibiotics. Not Bot Hort Agrobot Cluj 2009; 37(2):117-23.

20. Inouye S, Takizawa T, Yamaguchi H. Antibacterial activity of essential oils and their major constituents against respira-tory tract pathogens by gaseous contact. J Antimicrob Che-mother 2001; 47:565-73.

21. Meygalla SE, El-Keltrawi NEM, Ross SA. A study of antimi-crobial action of some essential oil constituents. Herba Pol 1980; 26:181-6.

22. Damjanovic-Vratnica B, Dakov T, Sukovic D i wsp. Anti-microbial effects of essential oil isolated from Eucalyptus

globulus Labill. from Montenegro. Czech J Food Sci 2011;

29(3):277-84.

23. Djenane D, Yanguela J, Amorouche T i wsp. Chemical com-position and antimicrobial effects of essential oils of

Euca-lyptus globules, Myrtus communis and Satureja hortensis

aga-inst Escherichia coli 0157:H7 and Staphylococcus aureus in minced beef. Food Sci Technol Int 2011; 17 (6):505-16. 24. Mulyaninigshih S, Sporer F, Reichling J i wsp. Antimicrobial

activity of essential oils from eucalyptus and selected compo-nents against multidrug resistant bacterial pathogens. Pharm Biol 2011; 49(9):893-9.

25. Shumny D, Szypuła E, Szydłowski M i wsp. Leki roślinne sto-sowane w chorobach układu oddechowego. Den Med Probl 2007; 44(4):507-15.

26. Katiyar A, Singh D, Mishra BN. Essential oil: production for health care in current scenario. Ann Biol Res 2010; 1(3):200-9.

27. Prabuseenivasan S, Jayakumar M, Ignacimuthu S. In vitro antibacterial activity of some plant essential oils. BMC Com-pl Altern Med 2006; 6(39):1-8.

28. Cermelli C, Fabio A, Fabio G i wsp. Effect of eucalyptus es-sential oil on respiratory bacteria and viruses. Curr Micro-biol 2008; 56:89-92.

29. Salari MH, Amine G, Shirazi MH i wsp. Antibacterial effects of Eucalyptus globulus leaves extract on pathogenic bacteria isolated from specimens of patients with respiratory tract disorders. Clin Microbiol Infect 2006; 12(2):194-6.

38. Kumar A, Sharma VD, Sing AK i wsp. Antibacterial properties of different eucalyptus oils. Fitotherapy 1988; 59:141-4.

39. Kędzia A. Działanie olejku eukaliptusowego na bakterie beztlenowe. Post Fitoter 2006; (4):183-7.

40. Maruzzella JC, Sicurella N. Antibacterial activity of essential oil vapors. J Am Pharm Assoc 1960; 49:692-4.

41. Takarada K, Kimizuka N, Takchashi K i wsp. A com-parison of the antimicrobial efficiaces of essential oils against oral pathogens. Oral Microbial Immunol 2004; 19:61-5.

42. Luangnarumitchai S, Lamlertthon S, Tiyaboonchai W. An-timicrobial activity of essential oils against five strains of

Propionibacterium acnes. Mahidol Univ J Pharm Sci 2007;

37(1-4):60-4.

43. Trivedi NA, Hotchandani SC. A study of the antimicro-bial activity of oil of Eucalyptus. Ind J Pharmacol 2004; 36(2):93-5.

44. Ghalem BR, Mohamed B. Antibacterial activity of leaf es-sential oils of Eucalyptus globulus and Eucalyptus

camaldu-lensis. Afric J Pharm Pharmacol 2008; 2(10):211-5.

45. Rosato A, Vitali C, De Laurentis N i wsp. Antibacterial ef-fect of some essential oils administrated alone or in combi-nation with Norfloxacin. Phytomed 2007; 14:727-32. 30. Bhat D, Sachan AK, Jains S i wsp. Studies on inhibitory

ef-fects of eucalyptus oil on sebaceous glands for the manage-ment of acne. Ind J Nat Prod Res 2011; 2(3):345-9. 31. Morris JA, Khettry A, Seitz EW. Antimicrobial activity of

aroma chemicals and essential oils. J Am Oil Chem Soc 1979; 56:595-603.

32. Kalemba D, Kunicka A. Antibacterial and antifungal prop-erties of essential oils. Curr Med Chem 2003; 10:813-29. 33. Kędzia B, Hołderna-Kędzia E. Badanie wpływu olejków

ete-rycznych na bakterie, grzyby i dermatofity chorobotwórcze dla człowieka. Post Fitoter 2007; (2):71-7.

34. Vidya TJ, Vidya P. Antimicrobial activity of Scan Vet Cream. Veterinary 2000; 16(24):155-9.

35. Yousef RT, Tawil GG. Antimicrobial activity of volatile oils. Pharmazie 1980; 35(11):698-701.

36. Karpanen TJ, Worthington T, Hendry ER i wsp. Antimicro-bial efficacy of chlorhexidine alone and with combination with eucalyptus oil, tea tree oil and thymol against planctonic and biofilm cultures of Staphylococcus epidermidis. J Antimi-crob Chemother 2008; 62:1031-6.

37. Delaquis PJ, Stanich K, Girard B i wsp. Antimicrobial activ-ity of individual and mixed fractions of dill, cilantro, corian-der and eucalyptus essential oils. Int J Food Microbiol 2002; 74:101-9.

Adres/address:

Konflikt interesów Conflict of interest

Brak konfliktu interesów None

otrzymano/received: 21.07.2017 zaakceptowano/accepted: 10.08.2017

Adres/address: *prof. dr hab. n. med. Anna Kędzia ul. Małchowskiego 5/5, 80-262 Gdańsk Wrzeszcz