Aleksandra Pliszczak-Król
1, A–D, Maria Szymonowicz
2, A–D, Jarosław Król
3, C,
Zbigniew Rybak
2, E, F, Stanisław Graczyk
1, E, F, Dorota Haznar
4, B, G, Janusz Pluta
4, B, GWpływ matryc żelatynowo-alginianowych na zmiany
morfologiczne i czynnościowe leukocytów krwi*
Influence of Gelatin-Alginian Matrixes on Morphological and Functional
Changes of Blood Leukocytes
1 Katedra Immunologii, Patofizjologii i Prewencji Weterynaryjnej, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, Wrocław, Polska
2 Zakład Chirurgii Eksperymentalnej i Badania Biomateriałów, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, Wrocław, Polska
3 Katedra Patologii, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, Wrocław, Polska 4 Katedra i Zakład Technologii Postaci Leku, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, Wrocław, Polska
A – koncepcja i projekt badania; B – gromadzenie i/lub zestawianie danych; C – analiza i interpretacja danych; D – napisanie artykułu; E – krytyczne zrecenzowanie artykułu; F – zatwierdzenie ostatecznej wersji artykułu; G – opracowanie składun matryc
Streszczenie
Wprowadzenie. Znajomość relacji biomateriału i tkanek żywych stanowi niezbędną informację, która powinna być
wyko-rzystywana podczas komponowania składu optymalnych nośników, np. dla leków lub preparatów wspomagających krzep-nięcie krwi.
Cel pracy. W artykule przedstawiono ocenę wpływu kontaktowania matryc żelatynowo-alginianowych z krwią na
reaktyw-ność leukocytów: zdolreaktyw-ność komórek jednojądrzastych (limfocytów i monocytów) do tworzenia radialnej segmentacji jąder – RS (zmiana morfologiczna) oraz zdolność do fagocytozy komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae i produkcji aktywnych związków tlenu leukocytów (zmiany czynnościowe).
Materiał i metody. Po kontakcie z matrycami wykonano: test indukowanej i spontanicznej RS, testfagocytarny oraz test redukcji błękitu nitrotetrazoliowego dla leukocytów krwi.
Wyniki. Na podstawie uzyskanych wyników badań stwierdzono, że matryce zmniejszają zdolność komórek jednojądrzastych
do tworzenia RS oraz zdolność granulocytów do redukcji błękitu nitrotetrazoliowego, zwiększają natomiast ich aktywność fagocytarną.
Wnioski. Czasowy kontakt gąbek żelatynowo-alginianowych z krwią nie wywołał zmian morfologicznych w komórkach
krwi, ale spowodował zmiany ich reaktywności (Polim. Med. 2013, 43, 3, 153–158).
Słowa kluczowe: matryce żelatynowo-alginianowe, radialna segmentacja jądra (RS), fagocytoza, redukcja błękitu
nitrotetra-zoliowego.
Abstract
Background. Knowledge of the relation of biomaterials and living tissues constitutes necessary information which should be
used when composing a set of optimal carriers, e.g. for drugs or preparations supporting blood clotting.
Objectives. This paper presents an assessment of the influence of contact of gelatin-alginian matrixes with blood on leukocyte
reactivity: the ability of mononuclear cells (lymphocytes and monocytes) to create a radial segmentation of nuclei – RS (the
Polim. Med. 2013, 43, 3, 153–158 © Copyright by Wroclaw Medical University
ISSN 0370-0747
PRACE oRyGINALNE
* Praca była przedstawiona na XIX Konferencji „Biomaterials in Medicine and Veterinary Medicine”, 15–18 października 2009, Rytro.
Dużo uwagi nadal poświęca się intensywnym po-szukiwaniom odpowiednich nośników dla substan-cji leczniczych. optymalny nośnik powinien spełniać określone wymagania. Po podaniu lub implantacji ma uwalniać lek w ściśle określonym miejscu i przez okreś- lony czas. Powinien być biologicznie obojętny i nie wywoływać reakcji organizmu – nie może przyczyniać się do powstawania efektu cytotoksycznego ani też in-nych niepożądain-nych odczynów. Struktura chemiczna nośnika powinna umożliwiać w odpowiednim czasie, po skutecznym zadziałaniu leku jego całkowitą resorp-cję [1–3].
Wiele właściwości licznych materiałów, z których są komponowane nośniki jest już dobrze poznanych. Na-leżą do nich: żelatyna, alginiany, kolagen [2, 3], które z powodzeniem są stosowane jako substancje pomocni-cze w produkcji tabletek, kapsułek, opatrunków hemo-statycznych. Nadal jednak niewiele wiadomo na temat bezpośrednich, wzajemnych relacji tych nośników i ko-mórek żywych. Znajomość pojawiających się, w wyni-ku kontaktu nośnika z tkanką lub krwią, ewentualnych zmian morfologicznych i czynnościowych w komórkach stanowiłaby niewątpliwie cenną wskazówkę przy dobo-rze materiałów – komponentów służących do pozyski-wania jak najbardziej optymalnych nośników [4, 5].
Celem pracy była ocena wpływu kontaktowania matryc (gąbek) żelatynowo-alginianowych z krwią ob-wodową na morfologię i reaktywność leukocytów krwi obwodowej z użyciem wybranych testów in vitro.
Materiał i metody
Żelatynowo-alginianowe matryce o strukturze gąb-ki zostały wytworzone w Zakładzie Farmacji Aptecznej Katedry Technologii Postaci Leku UM we Wrocławiu.
Gąbki uzyskano przez spienienie mieszaniny jałowych roztworów żelatyny, alginianu sodu oraz glicerolu w odpowiednich proporcjach i następnie liofilizację przez 24 h (tab. 1).
Dla wszystkich rodzajów matryc wykonano ozna-czenia: średniej gęstości teoretycznej, zdolności sorp-cyjnych oraz odporności na rozmywanie w warunkach
in vitro w 1% roztwór pepsyny w 0,1 M HCL [2].
Do kontaktu z matrycami wykorzystano krew pięciu zdrowych klinicznie świń, pozyskaną w czasie okresowych, rutynowych badań kontrolnych stanu zdrowia zwierząt. Świnie rasy mieszanej (Polish Large White × Polish Landrace), o wadze ok. 80–90 kg były własnością prywatnego hodowcy. Krew w ilości 20 ml pobrano z vena jugularis do strzykawek zawierających heparynę w ilości 10 j/1 ml krwi.
Każdy typ matrycy (o masie ok. 0,0364 g) kontak-towano z krwią (4 cm3) przez 4 h w temp. 37°C oraz
równolegle w tych samych warunkach inkubowano sa-mą krew (4 cm3) bez matryc, która stanowiła kontrolę
doświadczenia.
Na szkiełkach podstawowych wykonano po 2 roz-mazy z każdej próbki. Wysuszone w temperaturze pokojowej preparaty barwiono metodą panoptyczną Pappenheima, a następnie analizowano komórki krwi z użyciem obiektywu immersyjnego (×100) mikrosko-pu świetlnego. W każdym preparacie oceniano 200 leu-kocytów.
Test spontanicznej i indukowanej segmentacji ją-der leukocytów krwi wykonano według metody Söją-der- Söder-ströma et al. w modyfikacji własnej [6, 7]. Z każdej próbki krwi kontaktowanej z matrycami oraz kontrol-nej pobrano porcję krwi i podzielono ją na dwie równe części po 0,8 cm3. Do jednej dodano 0,2 cm³ mieszaniny
szczawianów potasu i amonu (RS indukowana). Druga
active oxygen derivatives (functional changes).
Material and Methods. After having contact with the matrixes, the test of induced and spontaneous RS, the phagocytic test
and nitroblue tetrazolium reduction test for blood leukocytes were performed.
Results. The obtained results showed a decrease in the ability of mononuclear cells to form RS and in the ability of
granulo-cytes to reduce nitroblue tetrazolium – NBT, but an increase in their phagocytic activity.
Conclusions. Temporary contact of gelatin-alginian matrixes with blood did not cause any morphological changes in the
leukocytes. However, changes of their reactivity were observed (Polim. Med. 2013, 43, 3, 153–158.
Key words: gelatin-alginian matrixes, radial segmentation of nucleus (RS), phagocytosis, reduction of nitroblue tetrazolium.
Tabela 1. Skład gąbek żelatynowo-alginianowych Table 1. Composition of the gelatin-alginate sponge
Typ matrycy
(Matrix type) Żelatyna(Gelatin) Alginian sodu(Sodium alginate) Glicerol(Glycerol)
3A 8 cz. 20% roztworu 2 cz. 2% roztworu 0,3 cz.
5A 8 cz. 20% roztworu 2 cz. 2% roztworu 0,5 cz.
3B 8 cz. 20% roztworu 2 cz. 4% roztworu 0,3 cz.
część, bez szczawianów stanowiła kontrolę (RS spon-taniczna). obie części inkubowano przez 3 h w temp. 21 ± 2°C. Następnie krew odwirowano (1500 g/10 min.), a z uzyskanego kożuszka białokrwinkowego sporządzo-no rozmazy, które barwiosporządzo-no metodą pasporządzo-noptyczną Pap-penheima. W rozmazach analizowano po 200 komórek jednojądrzastych (limfocyty i monocyty), różnicując je na RS-dodatnie (RS+) i RS-ujemne (RS–). Za RS+ przy-jęto te komórki, których jądra miały szczeliny o głębo-kości przynajmniej 1/3 jego średnicy (ryc. 1).
Następnie wykonano test fagocytozy według me-tody Slapničkowej et al. [8]. Do 1 cm3 krwi z każdej
próbki dodano po 100 µl zawiesiny komórek droż-dży Saccharomyces cerevisiae, następnie inkubowano ją przez 15 min w temp. 37°C. Po inkubacji z każdej próbki krwi wykonano po 2 rozmazy, które wysuszono i barwiono metodą panoptyczną Pappenheima. W roz-mazach analizowano po 200 granulocytów, różnicując je na Fag-dodatnie (Fag+) i na Fag-ujemne (Fag–). Za Fag+ przyjęto te komórki, w których stwierdzono obec-ność komórek drożdży (ryc. 2)
Test redukcji błękitu nitrotetrazoliowego wykonano według zmodyfikowanej metody Ramana i Polanda [9]. Do 0,2 cm3 krwi z każdej próbki dodano po 0,2 cm3 1%
roztworu błękitu nitrotetrazoliowego (NBT). Rów-nolegle wykonano próby „ślepe”, do których zamiast roztworu NBT dodano zbuforowany roztwór soli fizjo-logicznej (PBS). Tak przygotowaną krew inkubowano 30 min w temperaturze 37°C i 30 min w temperaturze pokojowej (21°C). Następnie w 0,05 cm3 krwi z każdej
próbki ekstrahowano powstały formazan w obecności 1 ml DMF, a następnie odwirowano i mierzono absor-bancję przy długości fali 525 nm na spektrofotometrze Marcel F 330.
Wyniki
Średnia gęstość teoretyczna ocenianych matryc wy-nosiła 0,14–0,18 g/cm3 (tab. 2). Matryce z 3% glicerolem
charakteryzowały się mniejszą gęstością i silniejszymi właściwościami sorpcyjnymi. Największą ilość wody na 1 g swojej masy pochłaniała matryca 3% A,
zwiększa-Ryc. 1. Krew kontaktowana z matrycą
żelatynowo-alginia-nową. od lewej: limfocyt niezmieniony, od prawej: limfocyt z jądrem segmentowanym – RS
Fig. 1. Blood contacted with gelatin-alginian matix. From
the left: normal lymphocyte, from the right: lymphocyte with segmented nucleus – RS
Ryc. 2. Krew kontaktowana z matrycą
żelatynowo-algi-nianową. Neutrocyt segmentowany z 4 sfagocytowanymi komórkami drożdży Saccharomyces cerevisiae
Fig. 2. Blood contacted with gelatin-alginian matix.
Segmented neutrophil with four phagocytized cells of yeast
Saccharomyces cerevisiae
Tabela 2. Właściwości farmaceutyczne gąbek żelatynowo-alginianowych Table 2. Pharmaceutical properties of the gelatin-alginate sponges
Typ matrycy
(Matrix type) Średnia gęstość(Mean density) g/cm3 Zdolność sorpcyjna g wody/g gąbki (Sorption capacity g of water/g of matrix) Rozmywanie (% ubytku) (Degeneration % of loss) 3A 0,142 ± 0,007 4,740 ± 0,444 65,89 ± 20,04 5A 0,181 ± 0,013 3,825 ± 0,397 46,90 ± 6,25 3B 0,151 ± 0,015 4,597 ± 0,200 59,89 ± 14,56 5B 0,165 ± 0,007 4,152 ± 0,229 49,77 ± 8,29
jąc swoją masę pięciokrotnie. Najsłabsze właściwości sorpcyjne wykazywała matryca 5% A (tab. 2). Dobrą odporność na rozmywanie wykazywały gąbki zawie-rające większą ilość alginianu sodu (typ B). Rozmycie najszybciej charakteryzowało gąbkę 3% A, najwolniej natomiast gąbkę 5% A (tab. 2).
Po kontakcie krwi z gąbkami nie stwierdzono zmian w obrazie morfologicznym komórek krwi. Leukocyty oraz pozostałe komórki (erytrocyty i płytki krwi) pozo-stały niezmienione.
odsetek komórek wykazujących RS przedstawiono na ryc. 3. Po inkubacji krwi z matrycami stwierdzono zmniejszoną zdolność komórek jednojądrzastych krwi (limfocytów i monocytów) do tworzenia radialnej seg-mentacji jąder, wyrażającą się zmniejszonym odsetkiem
komórek RS+. Najmniejsze wartości RS notowano po inkubacji z krwią matrycy 3B.
odsetek granulocytów fagocytujących komórki
Sac-charomyces cerevisiae (Fag+) przedstawiono na ryc. 4.
W próbce kontrolnej odsetek neutrofili Fag+ wynosił 48%. Wyraźne nasilenie zdolności pochłaniania komó-rek drożdży (do 60%) zaobserwowano po kontakcie krwi tylko z matrycą 5 A. Kontakt z pozostałymi matry-cami nie miał natomiast wpływu na badane zjawisko.
Wartości absorbancji (ekstynkcji) dla poszcze-gólnych matryc podano na ryc. 5. W porównaniu do kontroli zmniejszone wartości absorbancji: o ok. 50% zaobserwowano dla matryc typu 5 A, a o ok. 63% dla matryc typu 3 A.
Omówienie
obserwacja cech farmaceutycznych badanych ma-tryc żelatynowo-alginianowych sugeruje, iż bardziej optymalne cechy wykazują matryce zawierające w swoim składzie większą ilość alginianu sodu – matryce typu B. Wykazują one większą odporność na rozmywanie, a także dobre właściwości sorpcyjne, co przemawia za ich lepszą trwałością i zachęca do stosowania w warun-kach in vivo.
Wszystkie typy matryc ulegały rozpuszczeniu we krwi w czasie do 15 min, tworzyły postać płynną. Nie miało to jednak wpływu na ewentualne pojawienie się zmian morfologicznych w komórkach krwi. Zmiany morfologii mogą być jednak wywołane m.in. reorgani-zacją cytoszkieletu komórkowego. Cytoszkielet komór-kowy, trójwymiarowa sieć włókien, nadaje nie tylko kształt komórce, ale uczestniczy także w wielu jej proce-sach życiowych, np.: transdukcji sygnałów z błony ko-mórkowej do jądra i indukcji odpowiedzi na otrzyma-ne bodźce, transporcie i kompartymentacji enzymów.
Ryc. 3. Spontaniczna i indukowana radialna segmentacja
jąder (RS) komórek jednojądrzastych krwi kontaktowanej z matrycami żelatynowo-alginianowymi
Fig. 3. Spontaneous and inducted Radial Segmentation of
nuclei (RS) in mononuclear cells of the blood contacted with gelatin-alginian matrixes 0 10 20 30 40 odsetek komórek RS + RS spontaniczna RS indukowana K 3A 3B 5A 5B
Ryc. 4. Zdolność granulocytów krwi kontaktowanej z
matry-cami żelatynowo-alginianowymi do fagocytozy komórek
Saccharomyces cerevisiae
Fig. 4. The ability of neutrophils of the blood contacted with
gelatin-alginian matrixes to phagocytosis of Saccharomyces
cerevisiae cells
Ryc. 5. Redukcja błękitu nitrotetrazoliowego przez
neutro-cyty krwi kontaktowanej z matrycami żelatynowo-alginia-nowymi
Fig. 5. The reduction of Nitroblue Tetrazolium (NBT) by
neutrophils 0 10 20 30 40 50 60 70
odsetek granulocytów Fag+
3B 5A 5B 0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035 0,04 ab so rb an cj a K 3A 3B 5A 5B
Zapewnia odpowiednie rozmieszczenie organelli w ko-mórce [10–12]. o zmianach jego organizacji świadczy pośrednio pojawienie się w jądrze komórek jednoją-drzastych krwi (w monocytch i limfocytach) głębokich szczelin, zbiegających się koncentrycznie w centrum – zjawisko radialnej segmentacji (RS) [6, 7, 13, 14]. Po-jawiają się one w wyniku zwiększonej depolimeryzacji mikrotubuli cytoszkieletu [7]. Za bardziej miarodajny wskaźnik zdolności komórek do tworzenia jąder seg-mentowanych przyjmuje się RS indukowaną (z użyciem związków wiążących jony Ca+2). Wydaje się bowiem, że
RS dotyczy tych komórek, które w związku ze zmianą własnej aktywności gromadzą większe niż zwykle ilości Ca+2 i na jego utratę są bardziej wrażliwe [7]. Zmiany
organizacji cytoszkieletu, powodowane naruszeniem równowagi między polimeryzacją a depolimeryzacją je-go włókien, mogą mieć wpływ na zdolność limfocytów do odbierania bodźców płynących z zewnątrz (rozpo-znawania obcych antygenów) i generowania odpowie-dzi na nie, przez co mogą modyfikować reaktywność całego układu immunologicznego [12]. osłabienie zdolności komórek jednojądrzastych do tworzenia RS (po kontakcie z matrycami żelatynowo-alginianowymi) może być związane ze stabilizacją mikrotubul warun-kowaną spowolnieniem lub czasowym zatrzymaniem ich depolimeryzacji. W związku z powyższym wydaje się, że kontakt z matrycami ma „ochronny wpływ” na komórki jednojądrzaste krwi.
Wynikające ze zmian morfologicznych zmiany czynnościowe często wiążą się z kolei ze zmienionym metabolizmem komórek. Nasilenie procesów tleno-wych prowadzi np. do zwiększonego wytwarzania ak-tywnych związków tlenu (RoS) [15]. Ze względu na ich dużą toksyczność komórki krwi (głównie granulocyty) wykorzystują je w tlenozależnym układzie niszczenia w przebiegu fagocytozy [15, 16]. Przez fagocytozę są usuwane z organizmu czynniki potencjalnie chorobo-twórcze pochodzenia zewnętrznego oraz endogenne substancje toksyczne i uszkodzone lub martwe komór-ki własne [7, 8, 16, 17]. Aktywne związkomór-ki tlenu nasilają
jednak procesy starzenia komórek i mogą się przyczy-niać do ich uszkodzenia (stres oksydacyjny) [15, 16].
Jedną z metod monitorowania procesów tlenowych (oksydoredukcyjnych) w komórkach jest test redukcji błękitu nitrotetrazoliowego (NBT) do formazanu. Wia-domo, że zwiększona zdolność redukcji NBT przez ko-mórki (np. granulocyty) bezpośrednio koreluje z więk-szą aktywnością przemian tlenowych związanych m.in. z nasileniem procesu fagocytozy [9, 16, 17]. Po kontak-cie z matrycami stwierdzono nieznacznie zwiększony odsetek granulocytówbadanej krwi fagocytujących ko-mórki Saccharomyces cerevisiae. Z jednej strony obni-żenie zdolności tych komórek do redukcji NBT, a więc osłabienie procesów tworzenia aktywnych, toksycznych związków tlenu może jednak sugerować mniejszą jej wydajność, z drugiej natomiast prawdopodobne ograni-czenie przez kontakt z matrycami możliwości indukcji stresu oksydacyjnego wydaje się korzystne, jeśli przyj-mie się, że wspomniany stres w komórkach krwi leży u podstaw inicjacji procesu zapalnego [15, 16]. Proces zapalny z kolei nie byłby pożądaną reakcją przy zasto-sowaniu którejkolwiek z matryc.
Na podstawie zebranych wyników zaobserwowano, że kontakt krwi z matrycami żelatynowo-alginiano-wymi nie wywołał zmian morfologicznych w leukocy-tach. ograniczył także możliwość ich powstawania na skutek zastosowania indukcji chemicznej. Sugeruje to „ochronne” oddziaływanie matryc. Argumentem prze-mawiającym za takim oddziaływaniem może być także notowane osłabienie przemian tlenowych w badanych komórkach. Kontakt powodował jednak nieznaczne zwiększenie aktywności czynnościowej granulocytów będącej rezultatem kontaktu z ciałem obcym, jakim by-ły matryce.
Interpretacja uzyskanych wyników jest wyjątkowo trudna, bowiem w literaturze nie napotkano danych, które mogłyby stanowić punkt odniesienia do dysku-sji. Wobec powyższego przedstawione badania należy potraktować jako badania wstępne, które powinny być kontynuowane.
Piśmiennictwo
[1] Pluta J., Haznar D.: The effect of composition upon the physical and chemical properties of biodegradable gelatin polimer matrixes. Polim. Med. 2002, 32, 3–4, 11–19.
[2] Pluta J., Haznar D.: Resorbable polymeric sponges as drug carriers. Part 1. Gelatin sponges. Polim. Med. 2001, 31, 1–2, 18–26. [3] Pluta J., Haznar D.: Resorbable polymeric sponges as drug carriers. Part 2. Gelatin sponges. Polim. Med. 2001, 31, 3–4, 16–24. [4] SzymonowiczM., Marcinkowska A., Żywicka B., Pielka S., Gamian A., Haznar D., Pluta J.: Cellular response after
stim-ulation of the gelatin-alginate matrixes. Macromol. Symp. 2008, 272, 1, 58–62.
[5] SzymonowiczM., PielkaS., OwczarekA., HaznarD., Pluta D.: Study on influence of gelatin-alginate matrixes on the
co-agulation system and morphotic blood elements. Macromol. Symp. 2007, 253, 71–76.
[6] Pliszczak-Król A.: Wpływ ACTH na RS jąder i aktywność fosfatazy kwaśnej w aktywowanych antygenem limfocytach krwi ptaków. Med. Wet. 2001, 57, 9, 676–679.
[7] Söderström U.B., Norberg B., Brandt L.: The oxalate-induced radial segmentation of the nuclei in peripheral blood lym-phocytes of different size. Scan. J. Hematol. 1976, 17, 57–61.
[8] Slapnickova M., Berger J.: Rat neutophil phagocytosis following feed restriction. Comp. Cli. Path. 2002, 11, 172–177. [9] Czernomysy-Furowicz D., Furowicz A.J.: Porównanie testu redukcji błękitu nitrotetrazoliowego przez obojętnochłonne
pression of fibroblasts by alteration of the cytoskeleton. Cell Biochem. Funct. 1995, 13, 41–52.
[11] Min Ding, Robinson J.M., Behrens B.C., Vandre D.D.: The microtubule cytoskeleton in human phagocytic leucocytes is a highly dynamic structure. Eur. J. Cell Biol. 1995, 66, 234–245.
[12] Vicente-Manzanares M., Sánchez-Madrid F.: Role of the cytoskeleton during leukocyte responses. Nat. Rev. Immunol. 2004, 4, 110–122.
[13] Graczyk S., Pliszczak-Król A.: Wstępne badania radialnej segmentacji (RS) jąder limfocytów krwi kur. Zeszyty Naukowe Akademii Rolniczej we Wrocławiu 1996, 282, 15–24.
[14] Pliszczak-Król A., Graczyk S., Król J., Janczyk B.: ocena reaktywności leukocytów krwi obwodowej u szczurów anemizo-wanych. Med. Wet. 2006, 62, 12, 1435–1438.
[15] Jaźwińska-Kuliś J.: Rola reaktywnych form tlenu. Laboratorium 2007, 4, 47–51.
[16] Zilinskas J., Zekonis J., Zekonis G., Valantiejiene A., Periokaite R.: The reduction of nitroblu tetrazolium by total blood in periodontitis patents and the aged. Stomatologija 2007, 9, 105–108.
[17] Foster N., Hulme S., Lovell M., Reed K., Barrow P.: Stimulation of gp91 phagocytic oxidase and reactive oxygen species in neutrophils by an avirulent Salmonella enteritica serovar infantis strain protects gnotobiotic piglets from lethal challenge with serovar Typhimurium strain F98 without inducing intestinal pathology.Infect. Immun. 2005, 37, 4539–4547.
Adres do korespodencji:
Aleksandra Pliszczak-Król
Katedra Immunologii, Patofizjologii i Prewencji Weterynaryjnej Wydział Medycyny Weterynaryjnej
Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu ul. C.K. Norwida 31
50-375 Wrocław
e-mail: aleksandra.krol@up.wroc.pl Konflikt interesów: nie występuje. Praca wpłynęła do Redakcji: 1.06.2013 r. Po recenzji: 5.09.2013 r.
Zaakceptowano do druku: 5.09.2013 r. Received: 1.06.2013
Revised: 5.09.2013 Accepted: 5.09.2013
