Praca oryginalna Original paper
Flawobakteriozy ryb wywo³ywane s¹ przez drobno-ustroje z rodzaju Flavobacterium, które wczeniej za-liczano do rodzajów Flexibacter lub Cytophaga. Uwa-¿a siê, ¿e tzw. chorobê kolumnow¹ wywo³uje Flavo-bacterium columnare (wczeniej Flexibacter colum-naris), bakteryjn¹ chorobê skrzeli (BGD bacterial gill disease) wywo³uje Fl. branchiophilum, a tzw. cho-robê zimnej wody (CWD cold water disease) wywo-³uje Fl. psychrophilum (wczeniej Flexibacter psychro-philus, Cytophaga psychrophila) (19). Ka¿da z tych chorób mo¿e mieæ ostry przebieg i, je¿eli ryby nie s¹ leczone, zachorowalnoæ dochodzi czasm do 100%, a miertelnoæ do 50% lub nawet 80%. Z chorobami ryb zwi¹zane s¹ tak¿e inne gatunki Flavobacterium, takie jak: Fl. hydatis (wczeniej Cytophaga aquati-lis), Fl. johnsoniae i Flavobacterium sp. (1, 18, 20). Ich znaczenie w patogenezie nie jest dotychczas do-k³adnie wyjanione.
Flawobakterie wystêpuj¹ naturalnie w rodowisku wodnym oraz stanowi¹ sk³adnik normalnej mikroflo-ry skrzeli u zdrowych mikroflo-ryb, a mo¿liwe, ¿e nawet ikmikroflo-ry
(2, 11, 21). Jednak rezerwuary patogennych dla ryb bakterii z tej grupy nie zosta³y cile ustalone (4). Iden-tyfikacja poszczególnych gatunków nie jest ³atwa, ale wiêkszoæ flawobakterii zwi¹zanych z chorobami ryb posiada kilka wspólnych cech pozwalaj¹cych ³atwo je odró¿niæ od innych grup bakterii. S¹ to Gram-ujemne cienkie pa³eczki, czêsto osi¹gaj¹ce d³ugoæ 4-8 µm z wystêpuj¹cymi formami nitkowatymi dochodz¹cy-mi do 100 µm. Polimorfizm komórkowy wystêpuje nawet w obrêbie tego samego gatunku i zale¿y od cza-su hodowli i u¿ytego pod³o¿a. Drobnoustroje tego rodzaju opisywane s¹ jako niezarodnikujace i nie wytwarzaj¹ce owocników. Najlepiej rozwijaj¹ siê na pod³o¿ach ubogich w substancje od¿ywcze, np. na aga-rze Cytophaga (3), a ¿ó³ta lub pomarañczowa barwa kolonii jest charakterystyczna niemal dla wszystkich flawobakterii. Inn¹ cech¹ charakterystyczn¹ dla nie-których gatunków jest zdolnoæ do wykonywania tzw. lizgowego ruchu poprzez wyginanie komórki.
Wród flawobakterioz najbardziej rozpowszechnio-na jest choroba kolumnowa, wystepuj¹ca u ró¿nych
Przypadki flawobakterioz u pstr¹gów i karpi
hodowanych w Polsce
ALICJA KOZIÑSKA, AGNIESZKA PÊKALA
Zak³ad Chorób Ryb Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego Pañstwowego Instytutu Badawczego, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy
Koziñska A., Pêkala A.
Various cases of flavobacteriosis in trout and carp cultured in Poland Summary
The aim of the paper was to present the clinical data in four cases of flavobacteria infections in fish cultured in Poland and to characterize the isolates. The cases occurred in September 2005 and in February and March 2006 in three trout farms and one carp farm. In the first case, Fl. psychrophilum and Fl. columnare were isolated from apparently healthy rainbow trout. In the second case, common carp showed clinical signs specific for columnaris disease and abundant growth of bacteria producing yellow colonies was observed in skin and gills samples. The bacteria of separated isolates were identified as Fl. columnare. In the third case, abundant growth of flavobacteria was obtained from rainbow trout fry population with haemorrhages in the yolk sac and numerous mortalities. Separated isolates were identified as Fl. psychrophilum and Fl. branchiophilum. In the fourth case, skin darkening and mortalities were observed in rainbow trout after moving to another farm. An abundant growth of bacteria from kidney and intestine samples was obtained and yellow colonies grew uniformly or predominated over other bacterial flora. Fl. psychrophilum was identified among the isolates. In total, 17 isolates were identified. All the isolates showed characteristics specific for flavobacteria: they grew on Cytophaga agar, produced yellow colonies with spreading, wrinkled or whole edges (dependend on bacteria species). Cultures comprised Gram-negatie, long cells without spores or fruiting bodies (except for three isolates). Other phenotypic properties were consistent with those of reference strains used in the studies. The isolates identified as Fl. columnare, Fl. branchiophilum or Fl. psychrophilum varied little in their range of properties with regard to data of other authors.
gatunków ryb na ca³ym wiecie (4, 24). W ostatnich 10 latach diagnozowano j¹ tak¿e w Polsce u ryb ³oso-siowatych i karpiowatych na podstawie charaktery-stycznych objawów klinicznych i badañ histopatolo-gicznych (26). Jednak ze wzglêdu na trudnoci w po-prawnej identyfikacji gatunku, przypadki zachorowañ ryb nie zosta³y opisane. Chorobê BGD stwierdzano najczêciej u ryb ³ososiowatych w Japonii i USA. W Europie choroba ta wystêpuje rzadziej, notowano j¹ w Portugalii, Szkocji i we W³oszech (16, 22). Cho-roba zimnej wody atakuje prawie wszystkie gatunki ryb ³ososiowatych, ale mo¿e wystêpowaæ tak¿e u wê-gorza, karpia i innych ryb karpiowatych (9). Zasiêg CWD pocz¹tkowo by³ ograniczony do kontynentu Ameryki Pó³nocnej, ale póniej choroba rozprzestrze-ni³a siê tak¿e w Azji i Europie (4). Wród krajów europejskich CWD stwierdzano w Danii, Anglii, Fran-cji, Niemczech i Hiszpanii (7, 10). W roku 2004 cho-roba pojawi³a siê tak¿e w jednym z gospodarstw ry-backich w Polsce (5).
Celem badañ by³o przedstawienie danych klinicz-nych o przypadkach zaka¿eñ ryb w Polsce ró¿nymi gatunkami Flavobacterium i charakterystyka izolatów. Dane te dotycz¹ badañ przeprowadzonych w Zak³a-dzie Chorób PIWet-PIB w Pu³awach.
Materia³ i metody
Badania wykonano w latach 2005-2006. Flawobakterie izolowano od ryb pochodz¹cych z czterech ró¿nych gospo-darstw rybackich, w tym z trzech pstr¹gowych i jednego karpiowego. Do badañ u¿yto po 10 ryb z ka¿dego gospo-darstwa.
W pierwszym gospodarstwie pstr¹gowym we wrzeniu 2005 r. w populacji ryb o masie 40-60 g wystêpowa³y tylko pojedyncze niêcia. Ryby nie wykazywa³y ¿adnych innych objawów chorobowych. W gospodarstwie karpiowym, na pocz¹tku lutego br. ryby o masie 160-180 g zaczê³y pod-p³ywaæ pod dop³yw i obserwowano pocz¹tkowo pojedyn-cze, a póniej coraz bardziej liczne niêcia ryb. Tempera-tura wody w stawie wynosi³a 5-6°C. Badaniem klinicznym stwierdzono na skórze zwiêkszone wydzielanie luzu, któ-rego konsystencja by³a nierównomiernie zagêszczona, a tak-¿e obrzêk i zwiêkszone wydzielanie luzu w skrzelach. Badanie sekcyjne wykaza³o prawid³owy wygl¹d miêni i narz¹dów wewnêtrznych. Ogólne straty wynios³y ponad 30% obsady ryb. Na prze³omie lutego i marca 2006 r., w drugim gospodarstwie pstr¹gowym wyst¹pi³y zaburze-nia u wylêgu pstr¹ga têczowego. Temperatura wody wyno-si³a ok. 6°C. U wylêgu obserwowano wybroczyny w wo-reczku ¿ó³tkowym i wystêpowa³y liczne niêcia. Wyniki badañ przeprowadzonych w kierunku obecnoci wirusów VHSV, IHNV i IPNV by³y ujemne. W marcu 2006 r. stwier-dzono potransportowe niêcia pstr¹ga têczowego o masie 40-60 g w trzecim gospodarstwie pstr¹gowym. Badaniem parazytologicznym wykazano obecnoæ paso¿yta Dactylo-gyrus sp. Po zastosowaniu k¹pieli leczniczej w soli kuchen-nej paso¿yta nie stwierdzono, ale niêcia zwiêkszy³y siê, powoduj¹c ogólne straty siêgaj¹ce 10% obsady. U
poszcze-gólnych sztuk obserwowano pociemnienie skóry, poza tym ryby nie wykazywa³y ¿adnych innych objawów klinicznych. Badaniem sekcyjnym wykazano zwiekszon¹ wilgotnoæ nerki i przekrwienie b³ony luzowej przewodów pokarmo-wych. Po zastosowaniu enrofloksacyny niêcia usta³y. Wyniki badañ w kierunku obecnoci wirusów VHS, IHN i IPN by³y ujemne.
Badania bakteriologiczne. Próbki do badañ bakterio-logicznych pobierano z nerki i ledziony od ryb nie wyka-zuj¹cych objawów klinicznych oraz wówczas, kiedy jedy-nym objawem by³y niêcia ryb lub ze zmienionych tkanek zewnêtrznych (skóra, skrzela) i organów wewnêtrznych (nerka, ledziona, w¹troba). Wylêg z woreczkiem pobiera-no w ca³oci. Próbki rozcieñczapobiera-no w ja³owym p³ynie fizjo-logicznym (PBS) w stosunku 1 : 1 (wag./obj.), homogeni-zowano i posiewano równoczenie na dwa pod³o¿a: agar tryptozowo-sojowy (TSA) i Cytophaga agar (CA). Ka¿do-razowo materia³ posiewano na 2 p³ytki zawieraj¹ce okre-lony rodzaj pod³o¿a; jedn¹ z nich inkubowano w temp. 17°C ± 1, drug¹ w temp. 27°C ± 1. Inkubacjê prowadzono przez 10 dni. Po tym czasie oceniano proporcje ¿ó³tych lub po-marañczowych kolonii w stosunku do ca³kowitej flory bak-teryjnej oraz ich morfologiczne zró¿nicowanie. Nastêpnie izolowano po 3-4 kolonie ró¿nego typu i przeprowadzono dok³adn¹ identyfikacjê fenotypow¹ wg danych z pimien-nictwa (4, 9, 12, 24), a tak¿e porównywano badane izolaty ze szczepami referencyjnymi: NCIMB 2248 (Fl. columna-re), NCIMB 2219 (Fl. branchiophilum) i NCIMB 2247 (Fl. psychrophilum). Badano w³aciwoci morfologiczne, zdol-noæ ruchu, zdolzdol-noæ wytwarzania barwnika fleksirubino-wego oraz w³aciwoci biochemiczne i enzymatyczne. W³aciwoci morfologiczne komórek badano w prepara-tach wie¿ych i barwionych metod¹ Grama. Przy obserwa-cji mikroskopowej wie¿ych preparatów okrelano jedno-czenie zdolnoæ ruchu. Wytwarzanie barwnika fleksirubi-nowego badano poprzez nakroplenie na kolonie 20% KOH i obserwacjê zmiany ich barwy (17). Test na oksydazê cy-tochromow¹ wykonano przy u¿yciu gotowego odczynnika Oxidase reagent (bioMérieux), a test na katalazê przy u¿y-ciu wie¿o przygotowanej 3% wody utlenionej. Typ meta-bolizmu glukozy (O/F test), zdolnoæ wytwarzania kwasu z arabinozy, celobiozy, glukozy, D-ksylozy, laktozy, malto-zy, mannitolu, mannomalto-zy, rafinozy i salicyny oznaczano przy zastosowaniu klasycznych metod probówkowych, stosuj¹c pod³o¿e o nastêpuj¹cym sk³adzie (9): trypton (0,05%), wyci¹g dro¿d¿owy (0,05%), czerwieñ fenolowa (0,0018%) oraz odpowiedni cukier lub alkohol w koñcowej koncen-tracji 0,2%. Hydrolizê ¿elatyny badano na p³ytkach z pod-³o¿em o nastêpuj¹cym sk³adzie: trypton (0,05%), wyci¹g dro¿d¿owy (0,05%), agar (2%), ¿elatyna (4%). Inne w³a-ciwoci biochemiczne oraz enzymatyczne izolatów bada-no przy u¿yciu zestawów odpowiednio API 20 E i API Zym (bioMérieux).
Wyniki i omówienie
Wed³ug danych pimiennictwa, przy zaka¿eniach ryb przez flawobakterie mog¹ wystêpowaæ objawy choro-bowe, charakterystyczne dla okrelonego patogenu na-le¿¹cego do tej grupy bakterii (4, 12, 22, 24). Jednak zarówno objawy kliniczne, jak te¿ przebieg choroby
zale¿¹ w du¿ym stopniu od zjadliwoci szcze-pu oraz gatunku i wieku ryby (4, cyt.12). W badaniach w³asnych, objawy kliniczne da³y podstawê do podejrzenia flawobakteriozy tyl-ko u ryb w gospodarstwie karpiowym. Zwiêk-szone wydzielanie i zagêszczona konsystencja luzu na skórze i w skrzelach s¹ charakterys-tyczne dla choroby kolumnowej, chocia¿ po-dobne objawy wystêpuj¹ tak¿e przy niektórych egzoparazytozach. W badanym przypadku paso¿ytów jednak nie stwierdzono. W drugim gospodarstwie pstr¹gowym objawy kliniczne wskazywa³y raczej na chorobê wirusow¹ wy-lêgu pstr¹ga têczowego. Przeprowadzone ba-dania nie wykaza³y obecnoci wirusów choro-botwórczych dla tego gatunku ryb. W gospo-darstwach pstr¹gowych, pierwszym i czwar-tym, ryby nie wykazywa³y ¿adnych objawów klinicznych lub ma³o charakterystyczne po-ciemnienie skóry i niêcia.
Badaniem bakteriologicznym w ka¿dym z opisanych przypadków wykazano wzrost charakterystycznych, ¿ó³to zabarwionych ko-lonii bakteryjnych w próbkach inkubowanych na pod³o¿u CA w temperaturze 17°C, a tylko czêæ z nich rozwija³a siê podczas równolegle prowadzonej inkubacji w temperaturze 27°C na tym samym pod³o¿u. Z wiêkszoci tych sa-mych próbek nie uzyskano wzrostu podobnych kolonii na pod³o¿u TSA.
U pstr¹gów z gospodarstwa pierwszwgo mi-kroflora próbek nerki i ledziony by³a
nielicz-na i urozmaiconielicz-na. Stwierdzono obecnoæ dwóch ty-pów ¿ó³tych kolonii, które stanowi³y ok. 30% ogólnej flory bakteryjnej. Oba typy charakterystycznych kolo-nii rozwija³y siê na CA, a tylko jeden z nich równie¿ na pod³o¿u TSA. Zaistnia³o wiêc podejrzenie nosiciel-stwa bakterii z rodzaju Flavobacterium. Sporód 5 wy-osobnionych izolatów, 3 zidentyfikowano jako Fl. psy-chrophilum i 2 jako Fl. columnare.
W próbkach zmienionej skóry i skrzeli karpia stwier-dzono obfity wzrost charakterystycznych rozpe³zaj¹-cych po pod³o¿u ¿ó³tych kolonii, stanowi¹rozpe³zaj¹-cych ponad 90% ca³kowitej flory bakteryjnej w tych próbkach. Bakterie rozwija³y siê na obu u¿ytych w badaniach pod-³o¿ach, TSA i CA, w temperaturze 17°C i 27°C. Trzy wyosobnione izolaty zidentyfikowano jako Fl. colum-nare. W narz¹dach wewnêtrznych ryb nie stwierdzo-no obecstwierdzo-noci bakterii.
W posiewach wylêgu pstr¹ga têczowego stwierdzo-no charakterystyczne ¿ó³te kolonie. Kolonie rozwija³y siê tylko na CA, przy czym wzrost by³ znacznie bar-dziej obfity w temperaturze 17°C ni¿ 27°C. Bakterie te stanowi³y 70-95% flory bakteryjnej w poszczegól-nych próbkach. Sporód 4 wyosobnioposzczegól-nych izolatów, po 2 zidentyfikowano jako Fl. psychrophilum i Fl. branchiophilum. Trudno by³o ustaliæ, który z tych ga-tunków wywo³a³ zmiany chorobowe.
Prawdopodob-nie wiêksz¹ rolê w patogenezie mia³y Fl. psychrophi-lum, poniewa¿ Fl. branchiophipsychrophi-lum, jak wynika z do-tychczasowej wiedzy, wywo³uje bakteryjn¹ chorobê skrzeli. Zwraca jednak uwagê fakt obecnoci Fl. bran-chiophilum u wylêgu, u którego skrzela jeszcze siê nie rozwinê³y.
Obfity wzrost ¿ó³tych kolonii stwierdzono w prób-kach nerki i przewodu pokarmowego u ryb z czwarte-go czwarte-gospodarstwa pstr¹czwarte-goweczwarte-go. Bakterie wzrasta³y tyl-ko na CA w temperaturze 17°C i zdecydowanie domi-nowa³y nad pozosta³¹ flor¹ bakteryjn¹. Nawet w prób-kach luzówki przewodów pokarmowych stanowi³y do 95% flory bakteryjnej, co wskazuje, ¿e bakterie te maj¹ zdolnoæ redukcji lub niemal ca³kowitej eliminacji fiz-jologicznej, zwykle zró¿nicowanej flory przewodów pokarmowych. Kolonie uzyskane z próbek nerki i prze-wodów pokarmowych nie wykazywa³y znacz¹cych ró¿nic morfologicznych. Sporód 5 wyosobnionych izolatów tylko 2 zidentyfikowano jako Fl. psychrophi-lum. Trzy pozosta³e izolaty, chocia¿ by³y podobne do tego gatunku tak¿e w szerokim zakresie w³aciwoci biochemicznych, nie zosta³y sklasyfikowane do rodza-ju Flavobacterium. U 3 wspomnianych wy¿ej izola-tów stwierdzono obecnoæ owocników, umieszczonych na koñcach komórek uk³adaj¹cych siê w ³añcuchy. Owocniki nie posiada³y szypu³ek ani rozga³êzieñ
i c o w i c a ³ W Bada(nne=5zio)laty FN.lCcIoMlBum2n2a48re Wagutroór¿ónwyc*h y w o g zi l h c u R + + + e c ¹ j a z ³ e p z o r e i n o l o K + + + y w o n i b u ri s k e lf k i n w r a B + + + 5 . p m e t w t s o r z W °C,17° ,C 7 2 °C + + + A S T a n t s o r z W + +(s) a z a d y s k O +3 + + y z o i b o l e c , y z o n i b a r a :z s a w K , y z o n n a m , u l o ti n n a m , y z o t k a l y n y c il a s , y z o n if a r y z o tl a m z s a w K + y z o k u l g z s a w K +(s) +(s) y z o l y s k -D z s a w K r : E 0 2 I P A b-galaktozydaza(ONPG) +(4;)(1) r H2S + a n y t a l e ¯ + + + ,l o t y z o n i ,l o ti n n a m , a z o k u l G , a z o r a h c a s , a z o n m a r ,l o ti b r o s , a n il a d g i m a , a z o i b il e m a z o n i b a r a O N a j c k u d e R 3 + + +
Tab. 1. W³aciwoci morfologiczne, hodowlane i biochemiczne izolatów sklasyfikowanych jako Fl. columnare
Objanienia: * wg 4, 9; (s) reakcja s³aba; r reakcje ró¿ne zale¿nie od szczepu; liczba w nawiasie liczba izolatów dodatnich/ujemnych
(ryc. 1). Xu (25) opisa³ bakterie z podobnymi owocni-kami i zidentyfikowa³ je jako Myxococcus piscicola nale¿¹ce do rodziny Myxobacteriaceae. Interesuj¹ce jest, ¿e bakterie te by³y zwi¹zane z chorob¹
skrzeli u amura, co wskazuje, ¿e mog¹ byæ tak-¿e patogenem ryb.
£¹cznie ze wszystkich opisanych przypad-ków wyosobniono 17 izolatów. Wszystkie wzrasta³y na CA w postaci ¿ó³to zabarwionych kolonii w temp. 5 i 17°C. Kolonie zawiera³y Gram-ujemne, d³ugie pa³eczki (ryc. 1), wytwa-rzaj¹ce katalazê i hydrolizuj¹ce ¿elatynê (w testach p³ytkowych). W testach przeprowa-dzonych przy u¿yciu zestawów API 20E wszystkie izolaty by³y ujemne w nastêpuj¹cych reakcjach: dwuhydrolaza argininy, dekarbo-ksylaza lizyny i ornityny, wykorzystanie cytry-nianu, wytwarzanie H2S, ureazy, deaminazy tryptofanu, indolu, reakcja Voges-Proskauera, wytwarzanie kwasu z glukozy, mannitolu, ino-zytolu, ramnozy, sacharozy, melibiozy, amyg-daliny i arabinozy. Identyczne reakcje wyka-zywa³y u¿yte w badaniach szczepy referencyj-ne. Inne w³aciwoci izolatów, zmienne dla po-szczególnych gatunków lub w obrêbie gatun-ku, przedstawione s¹ w tabelach 1, 2, 3 i 4. Fl. columnare i Fl. psychrophilum wykazuj¹ ruch lizgowy i oba gatunki mog¹ wytwarzaæ kolo-nie rozpe³zaj¹ce. Jednak w przypadku Fl. psy-chrophilum obserwowano dwa typy kolonii na agarze Cytophaga: kolonie pofa³dowane roz-pe³zaj¹ce lub g³adkie z nierozpe³zajacymi krawêdziami (12). Izolaty zidentyfikowane w obecnej pracy jako Fl. columnare tworzy³y ¿ó³te kolonie rozpe³zaj¹ce po pod³o¿u, kolo-nie izolatów Fl. branchiophilum by³y pofa³do-wane na krawêdziach, natomiast kolonie izo-latów Fl. psychrophilum mia³y krawêdzie
g³ad-kie (ryc. 2). Barwnik fleksirubinowy jest charaktery-styczny dla wielu szczepów flawobakterii chorobo-twórczych dla ryb (12, 22, 24). Obecnoæ tego barw-nika stwierdzono u 12 izolatów zidentyfikowanych jako Fl. columnare lub Fl. psychrophilum (ryc. 3) oraz u 3 izolatów wytwarzajacych owocniki.
W³aciwoci 5 izolatów zidentyfikowanych jako Fl. columnare by³y identyczne jak szczepu referencyjne-go tereferencyjne-go gatunku NCIMB 2248, za wyj¹tkiem wytwa-rzania kwasu z celobiozy i maltozy. Badane izolaty by³y w tych testach dodatnie, natomiast szczep
refe-i c o w i c a ³ W Bada(nne=2zio)laty F.lNbrCaInMcBhi2o2ph19lium Wagutroór¿ónwyc*h y w o g zi l h c u R e c ¹ j a z ³ e p z o r e i n o l o K R y w o n i b u ri s k e lf k i n w r a B R 5 . p m e t w t s o r z W °C,17° ,C 7 2 °C + + + A S T a n t s o r z W +(s)(1;)(1) +(s) ** a z a d y s k O , y z o k u l g , y z o i b o l e c :z s a w K y z o r a h c a s , y z o tl a m + + + , y z o l y s k -D , y z o n i b a r a :z s a w K y n y c il a s , u l o ti n n a m , y z o t k a l y z o n n a m z s a w K + + r y z o n if a r z s a w K + y z o l a h e rt z s a w K + : E 0 2 I P A b-galaktozydaza(ONPG) H2S + a n y t a l e ¯ + + , a z o r a h c a s , a z o k u l G a z o i b il e m + ,l o ti b r o s ,l o t y z o n i ,l o ti n n a m , a n il a d g i m a , a z o n m a r a z o n i b a r a O N a j c k u d e R 3
Tab. 2. W³aciwoci morfologiczne, hodowlane i biochemiczne izolatów sklasyfikowanych jako Fl. branchiophilum
Objanienia: * wg 4, 8, 9, 15, 23; ** bakterie rozwijaj¹ siê na TSA rozcieñczonym 1 : 20; (s) reakcja s³aba; r reakcje ró¿ne zale¿nie od szczepu; liczba w nawiasie liczba izolatów dodatnich/ujemnych
Ryc. 1. Preparaty z hodowli izolatów na CA barwione meto-d¹ Grama: morfologia komórek Fl. columnare (A), Fl. bran-chiophilum (B), Fl. psychrophilum (C) oraz izolatów wytwa-rzaj¹cych owocniki (D)
Ryc. 2. Morfologia kolonii izolatów Fl. columnare (A), Fl. branchiophilum (B) i Fl. psychrophilum (C)
rencyjny ujemny. W przeciwieñstwie do da-nych z pimiennictwa (4, 9) badane izolaty i szczep referencyjny rozwija³y siê one na pod-³o¿u TSA, wykazywa³y s³ab¹ reakcjê rozk³a-du glukozy, a w testach API nie wytwarza³y
H2S (tab. 1). W³aciwoci dwóch izolatów Fl. bran-chiophilum odpowiada³y w³aciwociom referencyj-nego szczepu tego gatunku NCIMB 2219 i by³y zgod-ne z danymi z pimiennictwa (4, 8, 9, 15, 23) za wy-j¹tkiem wytwarzania kwasu z rafinozy i trehalozy. Izo-laty i badany szczep referencyjny by³y w tych reak-cjach ujemne (tab. 2). W³aciwoci wiêkszoci izola-tów Fl. psychrophilum odpowiada³y cechom referen-cyjnego szczepu tego gatunku NCIMB 2247 i by³y zgodne z danymi z pimiennictwa (4, 7, 8, 9). Jedynie 3 izolaty by³y ujemne w reakcji hydrolizy ¿elatyny (w tecie API 20E) w przeciwieñstwie do szczepu re-ferencyjnego i danych pimiennictwa (tab. 3). Powy¿-sze niezgodnoci wynikaj¹ prawdopodobnie z ró¿nic dotycz¹cych stosowanych pod³o¿y, temperatury inku-bacji, gêstoci zawiesiny bakteryjnej stosowanej do na-pe³niania pasków API itp. Identyfikacjê poszczegól-nych gatunków potwierdzi³y wyniki w³aciwoci enzymatycznych uzyskanych w zestawach API Zym (tab. 4). Na uwagê zas³uguje fakt, ¿e 3 izolaty zawie-rajace owocniki wykazywa³y w³aciwoci hodowlane, biochemiczne, enzymatyczne niemal identyczne z izo-latami Fl. psychrophilum, co wskazuje na bliskie po-krewieñstwo obu gatunków. Morfologicznie ró¿ni³y siê tylko obecnoci¹ owocników. Jest wiêc bardzo praw-dopodobne, ¿e bakterie te s¹, podobnie jak Fl. psy-chrophilum, chorobotwórcze dla ryb, tym bardziej, ¿e
czynnikami zjadliwoci flawobakterii s¹ prawdopo-dobnie zewn¹trzkomórkowe enzymy (14).
Pojawienie siê ró¿nych gatunków Flavobacterium w ostatnim czasie mo¿e byæ zwi¹zane zarówno z nie-korzystnym wp³ywem anomalii pogodowych, jak te¿ wzrostem zanieczyszczeñ rodowiska wodnego. Trud-no jest jednak oceniæ dok³adn¹ przyczynê wyst¹pienia zwiazanych z tymi bakteriami zaburzeñ zdrowotnych u ryb oraz ród³o zaka¿eñ, poniewa¿ badania nad t¹ grup¹ drobnoustrojów prowadzone s¹ w Polsce w ogra-niczonym zakresie. Opisane przypadki flawobakterioz, jak te¿ nieco wczeniej opisany przypadek wyst¹pie-nia choroby zimnej wody w Polsce (5) wskazuj¹ na potrzebê podjêcia szerszych badañ diagnostycznych i epizootycznych obejmuj¹cych chorobotwórcze i gro-ne dla zdrowia ryb flawobakterie.
Pimiennictwo
1.Acuigrup A.: Flavobacteriosis in coho salmon (Oncorhynchus kisutch), [w:] Ahne W.: Fish Diseases. Springer-Verlag, Berlin 1980, 212-217.
2.Allen D. A., Austin B., Colwell R. R.: Numerical taxonomy of bacterial isolates associated with a freshwater fishery. J. Gen. Microbiol. 1983, 129, 2043--2062.
3.Anacker R. L., Ordal E. J.: Studies on the myxobacterium Chondrococcus columnaris. 1. Serological typing. J. Bacteriol. 1959, 78, 25-32.
4.Austin B., Austin D. A.: Bacterial Fish Pathogens. Springer, London 1999. 5.Bernad A., Terech-Majewska E., Siwicki A. K.: Choroba zimnej wody
przypa-dek w jednym z gospodarstw rybackich na terenie województwa warmiñsko--mazurskiego, [w:] Ochrona zdrowia ryb aktualne problemy. IRS, Olsztyn 2004, s. 168. i c o w i c a ³ W Bad(anne=7zio)laty F.lNpCsyIMchBro2p2h47lium Wagutroór¿ónwyc*h y w o g zi l h c u R + + + e c ¹ j a z ³ e p z o r e i n o l o K r y w o n i b u ri s k e lf k i n w r a B + + + 5 . p m e t w t s o r z W °Ci17°C + + + _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 2 °C7 A S T a n t s o r z W a z a d y s k O + + + y z o i b o l e c z s a w K bd , y z o k u l g , y z o n i b a r a :z s a w K , y z o tl a m , y z o t k a l , y z o l y s k -D y n y c il a s , y z o n n a m , u l o ti n n a m y z o n if a r z s a w K bd : E 0 2 I P A b-galaktozydaza(ONPG) H2S + a n y t a l e ¯ +(4;)(3) + + ,l o t y z o n i ,l o ti n n a m , a z o k u l G , a z o r a h c a s , a z o n m a r ,l o ti b r o s , a n il a d g y m a , a z o i b il e m a z o n i b a r a O N a j c k u d e R 3
Tab. 3. W³aciwoci morfologiczne, hodowlane i biochemiczne izolatów sklasyfikowanych jako Fl. psychrophilum
Objanienia: * wg 4, 7, 8, 9; r reakcje ró¿ne zale¿nie od szczepu; bd brak danych; liczba w nawiasie liczba izolatów dodatnich/ujemnych Ryc. 3. Kolonie izolatu Fl. columnare (A) i Fl.
psy-chrophilum (B): Po nakropleniu 20% KOH na kolo-niê z lewej (A) i trzy kolonie na dole ryciny (B) zmie-nia³y one barwê z ¿ó³to-pomarañczowej na czerwon¹
Tab. 4. W³aciwoci enzymatyczne izolatów Fl. columnare, Fl. branchiophilum i Fl. psychrophilum
Objanienia: * wg 6, 8, 13, 15; ** wg 8, 15, 23; *** wg 6, 8, 15; **** niektóre szczepy wykazuj¹ reakcjê s³ab¹ (2 lub poni¿ej w skali 1-5) interpretowan¹ jako ujemna wg Ostland i wsp. (15); (s) reakcja s³aba (2 lub poni¿ej w skali 1-5); r reakcja ró¿na zale¿nie od szczepu; liczba w nawiasie liczba izolatów dodatnich/ujemnych
y m y z n E teNsrtu F.lcozIolulamtynare ) 5 = n ( h c y n ¿ ó r g W * w ó r o t u a y t a l o zI m u li h p o i h c n a r b .l F ) 2 = n ( h c y n ¿ ó r g W * * w ó r o t u a y t a l o zI m u li h p o r h c y s p .l F ) 7 = n ( h c y n ¿ ó r g W * * * w ó r o t u a a l o rt n o K 1 a n z c il a k l a a z a t a f s o F 2 + + + + + + ) 4 C ( a z a r e t s E 3 +(2;)(3) r + + + r ) 8 C ( a z a p i L a z a r e t s E 4 + + + + + + ) 4 1 C ( a z a p i L 5 y n y c u e l a z a d i m a l y r A 6 + + + + + + y n il a w a z a d i m a l y r A 7 +(4;)(1) +**** + + +(s)(5;)(2) r y n y t s y c a z a d i m a l y r A 8 +(3;)(2) +**** + + a n y s p y r T 9 r r a-chymortypsyna 10 a n a w k a z a t a f s o F 11 + +**** + + + + I B -S A -o l y tf a n a z a l o r d y h o f s o F 12 + + + + + + a-galaktozydaza 13 b-galaktozydaza 14 b-glukoronidaza 15 a-glukozydaza 16 +(2;)(3) r + r b-glukozydaza 17 r -o l y t e c a -N b-glukozaminidaza 18 +(s)(2;)(3) a-mannozydaza 19 af-ukozydaza 20
6.Bernardet J.-F.: Flexibacter columnaris: first description in France and compa-rison with bacterial strains from other origins. Dis. Aquat. Org. 1989, 6, 37-44. 7.Bernardet J.-F., Grimont P.: Deoxiribonucleic acid relatedness and phenotypic characterization of Flexibacter columnaris sp. nov., nom. rev., Flexibacter psychrophilus sp. nov., nom. rev., and Flexibacter maritimus Wakabayashi, Hikida and Masumura 1986. Int. J. Syst. Bacteriol. 1989, 39, 346-354. 8.Bernardet J.-F., Swegers P., Vancanneyt M., Berthe F., Kersters K.,
Vandam-me P.: Cutting a Gordian knot: emended clasification and description of the gGenus Flavobacterium, emended description of the Family Flavobacteriaceae, and proposal of Flavobacterium hydatis nom. nov. (Basonym, Cytophaga aquatilis Strohl and Tait 1978). Int. J. Syst. Bacteriol. 1996, 46, 128-148. 9.Buller N. B.: Bacteria from fish and other aquatic animals: a practical
identifica-tion manual. CABI Publishing, Wallingford, UK 2004.
10.Cipriano R., Schill W. B., Teska J. D. Ford L. A.: Epizootiological study of bacterial cold-water disease in Pacific salmon and further characterization of the etiological agent, Flexibacter psychrophila. J. Aqu. Anim. Health 1996, 8, 28-36.
11.Hansen G. H., Bergh Ø., Michaelsen J., Knappskog D.: Flexibacter ovolyticus sp. nov., a pathogen of eggs and larvae of Atlantic halibut, Hippoglossus hippo-glossus L. Int. J. Syst. Bacteriol. 1992, 42, 451-458.
12.Holt R. A., Rohovec J. S., Fryer J. L.: Bacterial cold-water disease, [w:] Inglis V., Roberts R. J., Bromage N. R.: Bacterial diseases of fish. Blackwell Science Ltd, Oxford 1993, 3-22.
13.Humphry D., George A., Black G., Cummings S.: Flavobacterium frigidarium sp. nov., an aerobic, psychrophilic, xylanolytic and laminarinolytic bacterium from Antarctica. Int. J. Syst. Evolut. Microbiol. 2001, 51, 1235-1243. 14.Newton J. C., Wood T. M., Hartley M. M.: Isolation and partial characterization
of extracellular proteases produced by isolates Flavobacterium columnare derived from channel catfish. J. Aqu. Anim. Health 1997, 9, 75-85.
15.Ostland V. E., Lumsden J. S., MacPhee D. D., Ferguson H. W.: Characteristics of Flavobacterium branchiophilum, the cause of salmonid gill disease in Ontario. J. Aqu. Anim. Health 1994, 6, 13-26.
16.Prost M.: Choroby ryb. PTNW, Lublin 1994, 124-132.
17.Reichenbach H., Behrans H., Hirsch Z.: The clasifications of the Cytophaga--like bacteria, [w:] Reichenbach H., Weeks O. B.: The Flavobacterium Cyto-phaga Group. Verlag Chemie, Deerfield Beech, Florida 1981, 7-15.
18.Rintamäki-Kinnunen P., Bernadet J. F., Bloigu A.: Yellow pigmented filamen-tous bacteria connected with farmed salmonid fish mortality. Aquacult. 1997, 149, 1-14.
19.Shotts E. B. Jr, Starliper C. E.: Flavobacterial diseases: columnaris disease, cold--water disease and bacterial gill disease, [w:] Woo P. T. K., Bruno D. W.: Fish diseases and disorders, t. 3 viral, bacterial and fungal infections. CABI Publi-shing, Wallingford, UK, 559-576.
20.Strohl W. R., Tait L. R.: Cytophaga aquatilis sp. nov., a facultative anaerobe isolated from the gills of freshwater fish. Int. J. Syst. Bacteriol. 1978, 28, 293-303.
21.Trust T. J.: Bacteria associated with the gills of salmonid fishes in freshwater. J. Appl. Bacteriol. 1975, 38, 225-233.
22.Turnbull J. F.: Bacterial gill disease and fin rot, [w:] Inglis V., Roberts R. J., Bromage N. R.: Bacterial Diseases of Fish. Blackwell Science Ltd, Oxford 1993, 23-39.
23.Wakabayashi H., Huh G., Kimura N.: Flavobacterium branchiophila sp. nov., a causative agent of bacterial gill disease of freshwater fishes. Int. J. Syst. Bac-teriol. 1989, 39, 213-216.
24.Wakabayashi H.: Columnaris disease, [w:] Inglis V., Roberts R. J., Brom-age N. R.: Bacterial Diseases of Fish. Blackwell Science Ltd, Oxford 1993, 23-39.
25.Xu: Studies on the gill diseases of the grass carp (Ctenopharynogodon idellus). 1. Isolation of the myxobacterial pathogen. Acta Hydrobiol. Sinica 1975, 5, 315--329
26.¯elazny J.: Mo¿liwoci rozpoznawania i zwalczania fleksibakteriozy nowej choroby karpia, [w:] ¯elazny J.: Ochrona zdrowia karpia w hodowli stawowej. PIWet. Pu³awy 2001, 99-104.
Adres autora: dr Alicja Koziñska, ul. Kusociñskiego 1/25, 24-100 Pu³a-wy; e-mail: koala@piwet.pulawy.pl
