Medycyna Wet. 2006, 62 (5) 560
Praca oryginalna Original paper
P³ytkowy czynnik aktywuj¹cy PAF (1-O-alkyl-2-ace-tyl-sn-glicero-3-fosfocholina) nale¿y do fosfolipidów b³o-nowych. Synteza i degradacja PAF kontrolowana jest ak-tywnoci¹ b³onowych, cytozolowych i zewn¹trzkomórko-wych enzymów, sporód których acetylohydrolaza PAF (PAF-AH; EC 3.1.1.48) pe³ni rolê zasadnicz¹ (5, 7, 8, 13). Obecnoæ PAF stwierdzono dotychczas w plemnikach bu-haja, cz³owieka, knura, królika oraz myszy (4, 12, 13). Rola plemnikowego PAF dotyczy udzia³u w mechanizmach re-gulacji g³ównych funkcji biologicznych gamety mêskiej, tj. ruchliwoci, kapacytacji oraz reakcji akrosomowej (9, 10). Wczeniejsze badania w³asne (6) wykaza³y stymulu-j¹cy wp³yw p³ytkowego czynnika aktywuj¹cego na aparat ruchu plemników knura, konserwowanych w stanie p³yn-nym. Niemniej wp³yw PAF na ruchliwoæ plemników jest uwarunkowany gatunkowo. W przypadku plemników bu-haja nie obserwowano bowiem stymuluj¹cego wp³ywu PAF na ruchliwoæ omawianych komórek (10).
Doskonalenie metod konserwacji nasienia knura jest pro-blemem ci¹gle aktualnym. Celowe jest wiêc prowadzenie badañ nad technologi¹ konserwacji oraz doborem odpo-wiednich komponentów dla rozcieñczalników nasienia. Ostatnio wykazano, ¿e dodatek frakcji lipoproteinowej izo-lowanej z ¿ó³tka jaja ptaków do rozcieñczalników dla na-sienia knura zwiêksza odpornoæ plemników na udary ch³o-dowe, zw³aszcza podczas konserwacji nasienia w tempera-turze +5°C (15).
Celem badañ by³o okrelenie wp³ywu dodatku syntetycz-nego PAF na wybrane parametry ruchu i stabilnoæ
plaz-molemy plemników knura w regionie akrosomowym i wstawkowym, konserwowanych w temperaturach +5°C i +16°C w rozcieñczalniku Kortowo 3 z dodatkiem lipo-protein (LPF) izolowanych z ¿ó³tka jaja kury domowej (LPFh) i strusia afrykañskiego (LPFo).
Materia³ i metody
Ejakulaty uzyskiwano metod¹ manualn¹ od 3 knurów, rasy wbp oraz duroc-hampshire w wieku 3 lat. Zwierzêta utrzymywano w standardowych warunkach zoohigienicznych. Knury ¿ywiono mieszank¹ pe³noporcjow¹, ze sta³ym dostêpem do wody. Po po-braniu nasienie s¹czono przez steryln¹ gazê w celu usuniêcia frak-cji ¿elowej i poddawano wstêpnej ocenie makroskopowej i mi-kroskopowej. Koncentracjê plemników okrelano metod¹ cyto-metryczn¹ (1).
Ekstrakcjê frakcji LPF prowadzono zgodnie z metod¹ opraco-wan¹ w Katedrze Biochemii i Biotechnologii Zwierz¹t UWM w Olsztynie (15). Frakcja lipoproteinowa ¿ó³tka jaja kurzego (LPFh) wykorzystywana by³a w postaci p³ynnej, natomiast frak-cjê lipoproteinow¹ z ¿ó³tka jaja strusia afrykañskiego (LPFo) pod-dawano procesowi liofilizacji, przez 24 godziny, z wykorzysta-niem liofilizatora Lyph-Lock 6 firmy Labconco.
Próbki nasienia rozrzedzano do koncentracji 20 × 106 plemni-ków/cm3 z zastosowaniem rozcieñczalnika Kortowo 3 (K3) o osmolarnoci 300 mOsm i nastêpuj¹cym sk³adzie: 64,6 mM cytrynian sodu × 2 H2O, 69,3 mM fruktoza, 8 mM EDTA (werse-nian disodowy), 14,2 mM octan potasu. Po okreleniu koncentra-cji sporz¹dzono nastêpuj¹ce warianty inkubacyjne: nasienie + K3 (próby kontrolne), nasienie + K3 + PAF (1 × 107 M) (Sigma), nasienie + K3 + LPFh, nasienie + K3 + LPFh + PAF (1 × 107 M), nasienie + K3 + LPFo, nasienie + K3 + LPFo + PAF (1 × 107 M). Próbki inkubowano w temperaturze +5°C i +16°C, a¿ do ca³ko-witego zaniku ruchu plemników. We wszystkich próbkach
nasie-Syntetyczny p³ytkowy czynnik aktywuj¹cy (PAF)
jako sk³adnik rozcieñczalnika dla nasienia knura*
)
W£ADYS£AW KORDAN, JERZY STRZE¯EK
Katedra Biochemii i Biotechnologii Zwierz¹t Wydzia³u Bioin¿ynierii Zwierz¹t UWM w Olsztynie, ul. Oczapowskiego 5, 10-718 Olsztyn
Kordan W., Strze¿ek J.
Synthetic platelet activating factor (PAF) as a boar semen extender component
SummaryThe aim of this study was to investigate the effects of PAF addition on selected motility characteristics and plasmalemma integrity of boar spermatozoa following liquid storage in a boar semen extender, Kortowo-3 (K-3), supplemented with lipoprotein fractions extracted from hen egg yolk (LPFh) or lyophilized lipoprotein fractions extracted from ostrich egg yolk (LPFo), at 5°C and 16°C.
Sperm motility was evaluated using a computer system (CASA). The determination of AspAT activity in sperm extracts as well as fluorescent analysis, with a fluorochrome, Hoechst 33258, were used to assess the plasmalemma integrity overlying the middle-piece and acrosomal regions of spermatozoa, respectively.
It was confirmed that the addition of exogenous PAF to K-3 extender containing LPFh or LPFo had a beneficial effect on the sperm quality parameters during storage at 5°C or 16°C. This phenomenon was manifested by an increase in motility and survivability of spermatozoa. The use of LPFh or LPFo as a component of boar semen extender had a protective effect on the plasmalemma integrity overlying the middle-piece and acrosomal regions of PAF-treated spermatozoa.
Keywords: boar, spermatozoa, motility, PAF, LPF
*) Praca wykonana w ramach tematu badañ w³asnych UWM w Olsztynie
Medycyna Wet. 2006, 62 (5) 561
nia, w kolejnych dniach przecho-wywania, kontrolowano ruch-liwoæ oraz oceniano stabilnoæ plazmolemy plemników.
Ocenê ruchu plemników prze-prowadzono przy zastosowaniu systemu CASA (CMA-Mika-Sys-tem, Strömberg-Mika, Germany). Okrelano odsetek plemników ruchliwych, lokalnie ruchliwych oraz plemników nieruchliwych. Wród plemników ruchliwych oceniano odsetek plemników wy-kazuj¹cych ruch liniowy, nielinio-wy i cyrkulacyjny.
Stabilnoæ plazmolemy plemni-ków w regionie wstawkowym oce-niano poprzez pomiar aktywnoci aminotransferazy asparaginiano-wej (AspAT) w ekstraktach plem-nikowych, zgodnie z metod¹ po-dan¹ przez Ciereszko i wsp. (2). W tym celu plemniki poddawano udarowi ch³odowemu poprzez 1-godzinn¹ inkubacjê komórek w temperaturze +4°C (277,2 K). Próbki wirowano (10 000 × g), a nastêpnie w p³ynach nadosado-wych okrelano aktywnoæ enzy-mu, któr¹ wyra¿ano w jednostkach miêdzynarodowych (IU/109 plemników).
Zmiany integralnoci plazmolemy plemników w regionie akro-somowym oceniano metod¹ fluorescencyjn¹ (16), przy wyko-rzystaniu fluorochromu Hoechst 33258 oraz mikroskopu epi-fluorescencyjnego BX41 (Olimpus) przy u¿yciu filtru-UV. Sto-sowano powiêkszenie 100-krotne. Zliczano plemniki wykazuj¹-ce fluoreswykazuj¹-cencjê i odnoszono do ca³kowitej liczby komórek widocznych w rozmazie. Wyniki obserwacji wyra¿ano w % plem-ników z uszkodzon¹ plazmolem¹.
Analizy statystyczne przeprowadzono przy pomocy programu komputerowego Statistica 6.0 (Statsoft). Stosowano test Dun-netta.
Wyniki i omówienie
Stwierdzono, ¿e dodatek PAF, niezale¿nie od zastoso-wanego wariantu rozcieñczalnika, temperatury i czasu prze-chowywania nasienia, wp³ywa istotnie na zwiêkszenie od-setka plemników ruchliwych w porównaniu z prób¹ kon-troln¹ (p £ 0,05).
W temperaturze +5°C najkorzystniejszy okaza³ siê wa-riant: K3 + LPFh + PAF (tab. 1). W trzecim dniu przecho-wywania nasienia obserwowano ponad 80%, a w szóstym prawie 30% plemników ruchliwych. Zadawalaj¹ce rezul-taty otrzymano równie¿ przy zastosowaniu wariantu inku-bacyjnego z udzia³em frakcji LPFo i PAF (K3 + LPFo + PAF). W trzecim dniu przechowywania nasienia stwierdzo-no prawie 70% plemników ruchliwych.
Z kolei podczas inkubacji próbek nasienia w temperatu-rze +16°C zdecydowanie najwy¿sz¹ ruchliwoæ stwierdzo-no w wariancie K3 + LPFo + PAF (tab. 1). W trzecim dniu przechowywania nasienia obserwowano ponad 80% komó-rek ruchliwych. Nale¿y zaznaczyæ, ¿e w omawianym wa-riancie wysok¹, ponad 40% ruchliwoæ plemników obser-wowano jeszcze w szóstym dniu przechowywania prób, podczas gdy w próbach kontrolnych (K3), w trzecim dniu inkubacji prób stwierdzono tylko w 8% odsetek plemni-ków ruchliwych.
Niezale¿nie od czasu przechowywania nasienia i tempe-ratury inkubacji prób, w wariantach rozcieñczalników z dodatkiem LPF i PAF obserwowano istotnie statystycz-nie wy¿szy odsetek plemników wykazuj¹cych ruch linio-wy w porównaniu z prób¹ kontroln¹. Stwierdzono ponad-to, ¿e obecnoæ w sk³adzie rozcieñczalnika LPFh, LPFo i PAF powodowa³a ograniczenie wystêpowania ruchów nie-prawid³owych plemników (ruch cyrkulacyjny, ruch nieli-niowy).
Wczeniejsze badania w³asne (6) wykaza³y stymuluj¹cy wp³yw PAF na aparat ruchu plemników knura przy stê¿e-niach nieprzekraczaj¹cych 1 × 106 M. Stanowi³o to
g³ów-n¹ przes³ankê do zastosowania w niniejszej pracy optymal-nego stê¿enia tego fosfolipidu (1 × 107 M). Nale¿y dodaæ,
¿e PAF stosowany w stê¿eniach powy¿ej 1 × 104 M mo¿e
naruszaæ stabilnoæ plazmolemy plemników w regionie wstawkowym jak równie¿ akrosomowym (6).
Wartoæ biologiczna nasienia zale¿y, miêdzy innymi, od stanu b³on plazmatycznych plemników. Podczas procesu konserwacji nasienia dochodzi do procesów starzeniowych plemników, czego wynikiem mog¹ byæ uszkodzenia plaz-molemy (15). Wiarygodnym markerem biochemicznym sta-nu integralnoci plazmolemy plemników w regionie wstaw-kowym jest podatnoæ tych komórek na uwalnianie do ro-dowiska zewn¹trzkomórkowego cytoplazmatycznego AspAT po zastosowaniu kontrolowanego udaru chodowe-go (2).
Jak wynika z danych przedstawionych na ryc. 1, z up³y-wem czasu przechowywania nasienia, niezale¿nie od za-stosowanego wariantu rozcieñczalnika i temperatury inku-bacji, obserwowano stopniowe obni¿enie aktywnoci AspAT ekstrahowanego z plemników po udarze ch³odo-wym. Omawiane zjawisko dotyczy³o szczególnie wariantów rozcieñczalnika z udzia³em frakcji LPFo i PAF, co dowodzi w³aciwoci os³aniaj¹cych tych substancji wobec plazmo-lemy plemników. Obserwowana wysoka aktywnoæ AspAT
a r u t a r e p m e T ij c a b u k n i inWkuabairacnyjtny ) % ( w ó k i n m e l p æ o w il h c u R a i n a w y w o h c e z r p i n D 0 D D1 D3 D6 * 1 2* 1 2 1 2 1 2 5°C ) a l o rt n o k ( 3 K 70,3a 6,5 33,3a 6,0 16,3a 3,0 0,0a 0,0 F A P + 3 K 94,0b 2,3 71,0b 6,7 64,0b 10,41 10,0a 2,0 o F P L + 3 K 85,0b 2,5 72,0b 4,2 59,0b 3,2 0,0a 0,0 F A P + o F P L + 3 K 88,3b 6,0 88,3c 5,0 68,3b 6,7 21,5b 8,0 h F P L + 3 K 87,7b 3,7 80,7c 3,0 70,7c 6,5 17,5b 3,0 F A P + h F P L + 3 K 94,0b 4,0 90,3d 5,0 82,4d 9,0 28,8b,c 7,0 6 1 °C ) a l o rt n o k ( 3 K 70,3a 6,5 40,0a 2,0 18,0a 6,0 0,0a 0,0 F A P + 3 K 94,0b 2,8 75,4b 8,2 60,0b 20,21 8,0a 3,3 o F P L + 3 K 85,0b 2,6 76,7b 5,8 65,0b 4,9 5,0a 3,0 F A P + o F P L + 3 K 88,6b 6,6 82,7b 8,8 83,6c 8,1 42,3c1 3,2 h F P L + 3 K 84,6b 5,6 74,9b 4,4 61,0b 4,7 6,0a 2,8 F A P + h F P L + 3 K 92,0b 4,6 76,2b 10,01 58,8b 6,2 12,0b1 9,0
Tab. 1. Wp³yw dodatku PAF na ruchliwoæ plemników knura przechowywanych w ró¿nych wariantach rozcieñczalników w temperaturach +5°C i +16°C (n = 18)
Objanienia: 1* plemniki ruchliwe; 2* plemniki lokalnie ruchliwe; a, b, c, d wartoci ozna-czone ró¿nymi literami ró¿ni¹ siê statystycznie istotnie (p £ 0,05)
Medycyna Wet. 2006, 62 (5) 562
ekstrahowanego z plemników bezpored-nio po rozrzedzeniu nasienia (Do) spo-wodowana by³a zapewne tzw. efektem rozcieñczenia próbek nasienia.
Otrzymane rezultaty badañ podkrela-j¹ udzia³ frakcji LPF i PAF w stabilizacji plazmolemy plemników w regionie wstawkowym. Wczeniejsze badania wykaza³y, ¿e dodatek frakcji LPF do roz-cieñczalnika Kortowo 3 polepsza jego w³aciwoci os³aniaj¹ce wobec plemni-ków knura przechowywanych w stanie p³ynnym (3).
Prawid³owy przebieg procesu zap³od-nienia u ssaków uzale¿niony jest, miê-dzy innymi, od stanu b³on plazmatycz-nych w regionie akrosomowym (14). Jak wynika z danych przedstawionych w tab. 2, zastosowanie dodatku LPFo, LPFh oraz PAF, powodowa³o obni¿enie odsetka plemników z uszkodzon¹ plaz-molem¹ w omawianym regionie. Zjawis-ko to przejawia³o siê spadkiem liczby plemników wykazuj¹cych fluorescencjê, niezale¿nie od temperatury inkubacji i za-stosowanego wariantu rozcieñczalnika.
W posumowaniu nale¿y stwierdziæ, ¿e zastosowanie w sk³adzie rozcieñczalni-ka Kortowo 3 dodatku egzogennego PAF w kombinacji z frakcj¹ lipoprotein (LPFo
i LPFh) wp³ywa³o pozytywnie na parametry jakoci nasie-nia knura konserwowanego w stanie p³ynnym w tempera-turach +5°C i +16°C. Omawiane zjawisko przejawia³o siê znacznym wzrostem ruchliwoci i prze¿ywalnoci plemni-ków, jak równie¿ podwy¿szon¹ stabilnoci¹ plazmolemy omawianych komórek.
Pimiennictwo
1.Bielañski W.: Rozród zwierz¹t. PWN, Warszawa 1974.
2.Ciereszko A., Glogowski J., Demianowicz W., Strze¿ek J.: Stimulation of aspartate aminotransferase from animal semen by pyridoxal 5-phosphate. Anim. Reprod. Sci. 1994, 34, 327-341.
3.Fraser L., Lecewicz M., Strze¿ek J.: Effect of extender composition and storage temperatures on motility of preserved boar semen. J. Anim. Feed Sci. 2002, 11, 661-669.
4.Hough S. H., Parks J. E.: Platelet-activating factor acetylhydrolase activity in seminal plasma from the bull, stallion, rabbit, and rooster. Biol. Reprod. 1994, 50, 912-916.
5.Kordan W.: W³aciwoci acetylohdrolazy p³ytkowego czynnika aktywuj¹cego (PAF-AH) z plazmy nasienia knura. Praca hab. Rozprawy i monografie nr 44, 2001, 1-53, Wyd. Uniwersytetu Warmiñsko-Mazurskiego w Olsztynie. 6.Kordan W., Strze¿ek J.: Effect of platelet-activating factor (PAF) on motility
para-meters and plasmalemma integrity of boar spermatozoa. Anim. Sci. Pap. Rep. 2002, 20, 37-45.
7.Kordan W., Strze¿ek J., Fraser L.: Functions of platelet activating factor (PAF) in mammalian reproductive processes: a review. Pol. J. Vet. Sci. 2003, 6, 55-60. 8.Kordan W., Wysocki P., Strze¿ek J.: A polypeptide from protein complex of
plate-let activating factor acetylhydrolase (PAF-AH) of boar seminal plasma belongs to a family of adhesion proteins. Anim. Sci. Pap. Rep. 2004, 22, 341-346. 9.Odeh A. I., Dascanio J. J., Caceci T., Bowen J., Eng L. A.: Effect of platelet
acti-vating factor (PAF) on stallion sperm motility, capacitation and acrosome reac-tion. Reproduction 2003, 126, 605-613.
10.Parks J. E., Hough S. R.: Effect of platelet activating factor on the motility and acrosome reaction of bovie spermatozoa. Theriogenology 1990, 34, 903-912. 11.Reinhardt J. C., Xiaoying Cui, Roudebush W. E.: Immunofluorescent evidence of
the platelet-activating factor receptor on human spermatozoa. Fertil. Steril. 1999, 71, 941-942.
12.Roudebush W. E., Diehl J. R.: Platelet-activating factor content in boar spermato-zoa correlates with fertility. Theriogenology 2001, 55, 1633-1638.
13.Soubeyrand S., Lazure C., Manjunath P.: Phospholipase A2 from bovine seminal
plasma is a platelet-activating factor acetylhydrolase. Biochem. J. 1998, 329, 41-47.
14.Snell W. J., White J. M.: The molecules of mammalinan fertilization. Cell 1996, 85, 629-637.
15.Strze¿ek J., Lecewicz M., Dziekoñska A., Fraser L.: A simple metod of extraction of lipoprotein fraction from avian egg yolk-protective effect on cooled boar semen. Theriogenology 2005, 63, 496-497.
16.Wolders H.: A novel technique for differential live-dead staining using
fluores-cence microscopy and fluorimetry. Proc. 11th Congress Anim. Reprod. Art. Insem.
Dublin 1988, 4, 579.
Adres aurora: dr hab. W³adys³aw Kordan, prof. nadzw., ul. Oczapow-skiego 5, 10-718 Olsztyn; e-mail: wladyslaw.kordan@uwm.edu.pl
Ryc. 1. Wp³yw dodatku PAF na aktywnoæ AspAT ekstrahowanego z plemników knura (IU/109 plemników) przechowywanych w ró¿nych wariantach rozcieñczal-ników w temperaturach +5°C i +16°C (n = 18)
Objanienie: a, b, c wartoci oznaczone ró¿nymi literami ró¿ni¹ siê statystycznie istotnie (p £ 0,05) 0 100 200 300 400 500 600 D0 D3 D6 D0 D3 D6 a a a a b a a a a b b a a a b a b a a b a c a a a a a a b b a b b a a a Temperatura +5°C Temperatura +16°C K3 + LPFo K3 + LPFo + PAF K3 (kontrola) K3 + PAF K3 + LPFhK3 + LPFh + PAF a r u t a r e p m e T ij c a b u k n i inWkuabairacnytjny ) % ( ¹ m e l o m z a l p ¹ n o z d o k z s u z i k i n m e l P a i n a w y w o h c e z r p i n D 0 D D1 D3 D6 5°C ) a l o rt n o k ( 3 K 11,2a 13,0aa 15,8a 30,5a F A P + 3 K 10,3a 11,2ab 12,8a 20,0b o F P L + 3 K 19,3a 10,3ab 15,8a 22,3b F A P + o F P L + 3 K 10,0a 19,7ab 12,8a 19,2b h F P L + 3 K 19,3a 19,8ab 11,2a 18,2b F A P + h F P L + 3 K 18,8a 18,2ba 11,5a 19,4b 6 1 °C ) a l o rt n o k ( 3 K 11,2a 16,3aa 16,0a 35,0a F A P + 3 K 10,3a 12,7ab 15,6a 24,3b o F P L + 3 K 19,3a 10,6ba 10,5b a20,0bc F A P + o F P L + 3 K 10,0a 19,0ba 19,5b 18,8c h F P L + 3 K 19,3a 10,0ba a11,5ab 18,8c F A P + h F P L + 3 K 18,8a 10,0ba 19,8b 16,0c
Tab. 2. Wp³yw dodatku PAF na stabilnoæ plazmolemy w re-gionie g³ówki plemników knura przechowywanych w ró¿nych wariantach rozcieñczalników w temperaturach +5°C i +16°C (n = 18)
Objanienie: a, b, c wartoci oznaczone ró¿nymi literami ró¿-ni¹ siê statystycznie istotnie (p £ 0,05)
