Praca oryginalna Original paper
Ka¿dego roku przemys³ chemiczny i farmaceutycz-ny wprowadza na rynek tysi¹ce nowych substancji che-micznych. Wiele produktów lub ich sk³adników, które wchodz¹ w bezporedni kontakt ze skór¹ ludzi i zwie-rz¹t, mo¿e wywo³aæ reakcje niepo¿¹dane, prowadz¹ce do rozwoju ró¿nego rodzaju dermatoz. Szacuje siê, ¿e oko³o 3700 substancji chemicznych po przypadkowym lub celowym (np. leki) kontakcie ze skór¹ mo¿e pro-wadziæ do rozwoju alergii kontaktowej (1). St¹d w kra-jach Unii Europejskiej obowi¹zuj¹ kryteria klasyfika-cyjne ustalone w 1999 roku dla substancji wykazuj¹-cych w³aciwoci uczulaj¹ce dla uczuleñ kontaktowych skóry. Wed³ug OECD (17), substancjê klasyfikuje siê do grupy zwi¹zków o wysokim ryzyku powodowania niepo¿¹danych reakcji typu kontaktowego, jeli w prak-tyce dana substancja lub preparaty zawieraj¹ce dan¹ substancjê s¹ w stanie wywo³aæ uczulenie u znacznej liczby osób poprzez kontakt ze skór¹ lub na podstawie dodatnich reakcji w zalecanych badaniach dowiadczal-nych na zwierzêtach. Z oczywistych wzglêdów zakla-syfikowanie nowo zsyntetyzowanych zwi¹zków, jaki-mi s¹ ró¿ne pochodne tioajaki-midów, mo¿e odbywaæ siê na podstawie badañ dowiadczalnych na zwierzêtach.
Pochodne tioamidów s¹ zwi¹zkami wykazuj¹cymi siln¹ aktywnoæ biologiczn¹. Prowadzone z nowo zsyn-tetyzowanymi zwi¹zkami badania mikrobiologiczne (oraz przedkliniczne) wskazuj¹ na ich dzia³anie prze-ciwgrzybicze, przeciwbakteryjne oraz przeciwwiruso-we, co stwarza nowe mo¿liwoci wykorzystania ich w leczeniu zarówno ludzi, jak i zwierz¹t Wiêkszoæ z nich charakteryzuje siê aktywnoci¹ fungistatyczn¹ w stosunku do dermatofitów (Trichophyton menthagro-phytes, T. rubrum, T. interdigitale, Microsporum gyp-seum, Epidermophyton floccosum), pleni, dro¿d¿aków (Candida albicans, Trichosporon sp., Cryptococcus neo-formans). Wykazuj¹ w³aciwoci bakteriostatyczne przeciwko bakteriom G+, np. gronkowcom (7). Benza-nilidy, tiobenzanilidy oraz ich pochodne wykazuj¹ rów-nie¿ w³aciwoci przeciwnowotworowe, przeciwpaso-¿ytnicze, przeciwbólowe i przeciwzapalne w zale¿no-ci od rodzaju podstawnika w cz¹steczce (5, 6). Prowa-dzono równie¿ badania nad w³aciwociami fizykoche-micznymi, lipofilnoci¹ tych zwi¹zków chemicznych oraz zale¿noci¹ pomiêdzy lipofilnoci¹ a aktywnoci¹ przeciwgrzybicz¹ ró¿nych pochodnych 2,4-dihydro-ksytiobenzanilidów, gdzie zaobserwowano dodatni¹
Badania nad kontaktowymi w³aciwociami
uczulaj¹cymi pochodnych tioamidów
u winek morskich
PIOTR WILKO£EK
Zak³ad Diagnostyki Klinicznej i Dermatologii Weterynaryjnej AR, ul. G³êboka 30, 20-612 Lublin Wilko³ek P.
Studies of the contact sensitivity properties of thioamides derivatives in guinea pigs
Summary
Thioamides, especially thiobenzanilidies and related compounds, are characterized by a wide spectrum of biological activities (antimicrobial, anthelmintic, analgesic, anti-inflammatory) depending on the type of substitution. 2.4-dihydroxythiobenzanilides have been discovered to have interesting in vitro efficiency against dermatophytes, yeasts and moulds. The purpose of this study was to assess adverse reactions of thioamides after skin contact. The study was done on 29 guinea pigs. The guinea pig maximization test (acc. Magnusson Kligman test) was used to estimate the risk of the skin contact allergic reactions. Skin irritation of the examined substances in different concentrations was assessed after epidermal topical application. Cross--reactions between thioamides and tetramethylthiuram disulfide was also examined. The leukocyte inhibition migration test (in vitro test) was done to confirm results of skin epidermal tests.
Thioamides derivatives have very weak irritant properties and using these compounds in therapeutic concentrations (0.5-3%) has no risk of irritant adverse reaction after coming into contact with skin. Cross-reactivity was noticed among 2.4-dihydroksytiobenzamid and tetramethylthiuram disulfide. 2.4-dihydroksytiobenzamid is characterized by a weak sensitizing capacity (only 20% of animals were sensitized in GPMT) and according to OECD guidelines it may not be classified as a skin sensitizer (R43), but in special circumstances it may cause allergic contact dermatitis.
korelacjê pomiêdzy tymi w³aciwociami (8, 9, 14). Oceniano równie¿ ich toksycznoæ z ró¿nymi podstaw-nikami w piercieniu N-aromatycznym i wykazano ich nisk¹ toksycznoæ w porównaniu z powszechnie stoso-wanymi zwi¹zkami przeciwgrzybiczymi (5). Jako ewen-tualne przysz³e leki, zwi¹zki te wymagaj¹ przeprowa-dzenia wszechstronnej oceny. Jednym z nich jest ko-niecznoæ oceny ryzyka wywo³ywania skórnych reak-cji kontaktowych typu podra¿nieniowego b¹d alergicz-nego, jak te¿ mo¿liwoci wywo³ywania ewentualnych reakcji krzy¿owych z innymi substancjami o zbli¿onej budowie chemicznej. Pewne podobieñstwo w budowie chemicznej do dwusiarczku czterometylotiuramu (zwi¹zku o znanych silnych w³aciwociach uczulaj¹-cych) mo¿e nasuwaæ podejrzenie, ¿e tioamidy mog¹ równie¿ charakteryzowaæ siê w³aciwociami uczula-j¹cymi. Uzyskanie odpowiedzi na powy¿sze pytania bêdzie mia³o istotne znaczenie, co do dalszego ich losu jako substancji leczniczych, przyczyniaj¹c siê do spre-cyzowania wskazañ o ewentualnych reakcjach niepo-¿¹danych czy te¿ sformu³owania niezbêdnych ostrze-¿eñ. Brak jest jednak danych literaturowych na temat w³aciwoci uczulaj¹cych zwi¹zków chemicznych o bu-dowie tiobenzanilidów oraz stosownych badañ alergo-logicznych.
Cel podstawowy badañ dotyczy³ wykazania i prze-ledzenia niepo¿¹danego oddzia³ywania tioamidów w aspekcie przysz³ych leków poprzez udowodnienie wywo³ania przez cztery nowo zsyntetyzowane zwi¹zki (2-b-rezorcylo-5,6-dichloro-1,3-benzotiazol, N-1--(benz)-2,4-dihydroksytiobenzamid, N-1-[2-(4-fenylo--6-metylo-benzotiazolo)]-2,4-dihydroksytiobenzamid oraz N-1-(3,5dibenztriflorometylo)-2,4-dihydro-ksytiobenzamid) reakcji krzy¿owych z dwusiarczkiem czterometylotiuramu u dowiadczalnie uczulonych na tiuram winek morskich. Ponadto postanowiono prze-analizowaæ w³aciwoci dra¿ni¹ce tych zwi¹zków po naskórnym podaniu, jak te¿ przeledziæ zdolnoci zwi¹zków reaktywnych w reakcjach krzy¿owych do sa-modzielnego wywo³ania u winek morskich uczule-nia kontaktowego.
Materia³ i metody
Substancje badane to benzotiazol, (A) 2-b-rezorcylo-5,6--dichloro-1,3-benzotiazol oraz tioamidy (B) (benz)-2,4--dihydroksytiobenzamid (dihydroksybenztioanilid), (C) N-1- -[2-(4-fenylo-6-metylo-benzotiazolo)]-2,4-dihydroksytio-benzamid, (D) N-1-(3,5dibenztriflorometylo)-2,4-dihydro-ksytiobenzamid, a tak¿e dwusiarczek czterometylotiuramu (TMTD), których wzory strukturalne przedstawiono na ryc. 1. Do sporz¹dzenia formu³ roztworów i mieszanin (zaróbek) zosta³y u¿yte: aceton (Polskie Odczynniki Chemiczne) do iniekcji ródskórnych, adjuwant Freunda (Sigma) oraz waze-lina bia³a (Vaselinum Album FP IV, Aflofarm Farmacja Pol-ska) w próbach naskórnych.
Grupa zwierz¹t u¿ytych w badaniach liczy³a 29 winek morskich, z czego grupê dowiadczaln¹ stanowi³o 21 winek morskich. W chwili rozpoczêcia dowiadczenia wiek zwie-rz¹t waha³ siê od 4 do 5 miesiêcy, a masa od 300 do 400 g.
winki morskie przebywa³y w klatkach o wymiarach 70 × 40 × 35 cm, w iloci od 3 do 5 osobników w jednej klatce, w pomieszczeniu ze redni¹ wilgotnoci¹ 80%, w cyklu do-bowym 12 h owietlenie, 12 h bez owietlenia. Przed rozpo-czêciem dowiadczenia zwierzêta przechodzi³y tygodniow¹ aklimatyzacjê, gdzie by³y poddawane ocenie klinicznej stanu zdrowia. Grupê I stanowi³o 5 winek morskich uczulanych na dwusiarczek czterometylotiuramu. Grupa II liczy³a 10 wi-nek morskich uczulanych na N-1-(benz)-2,4-dihydroksytio-benzamid (tiobenzanilid). Ocena w³aciwoci dra¿ni¹cych substancji badanych zosta³a wykonana u 6 winek morskich, u trzech z nich dokonano oceny dwusiarczku tetrametyltiu-ramu (TMTD), u trzech pozosta³ych zwi¹zków pochodnych tioamidów. Grupê zwierz¹t kontrolnych stanowi³o 8 winek morskich, u których wykonano test maksymalizacji z TMTD oraz N-1-(benz)-2,4-dihydroksytiobenzamidem jako kontroli ujemnej. Badania na zwierzêtach zosta³y zatwierdzone przez lokaln¹ komisjê etyczn¹ do spraw badañ na zwierzêtach (nr opini 48/2003, 7.10.2003).
Ocena w³aciwoci dra¿ni¹cych substancji badanych zo-sta³a przeprowadzona na podstawie reakcji skórnych, poja-wiaj¹cych siê w wyniku ekspozycji skóry na mieszaniny ba-danych zwi¹zków chemicznych, zastosowanych w ró¿nych stê¿eniach, w tecie naskórnym. Poprzez tê metodê wyzna-czono najwy¿sze stê¿enia niedra¿ni¹ce dla skóry zdrowej. W przypadku substancji A, B, C, i D testowano je w stê¿e-niach 1%, 10%, 25%. Z uwagi na koniecznoæ wykonywania Ryc. 1. Wzory strukturalne substancji u¿ytych w dowiad-czeniu: A 2-b-rezorcylo-5,6-dichloro-1,3-benzotiazol, B N-1-(benz)-2,4-dihydroksytiobenzamid (dihydroksybenztio-anilid), C N-1-[2-(4-fenylo-6-metylo-benzotiazolo)]-2,4-di-hydroksytiobenzamid, D N-1-(3,5dibenztriflorometylo)--2,4-dihydroksytiobenzamid OH S N Cl Cl O H N OH C S H OH OH O H C N S N H S CH3 O H OH C S N C C H F F F F F F N C C H3 CH3 S S S C S N C H3 C H3 A B C D TMTD
dowiadczalnych uczuleñ oraz wykonywania prób naskórko-wych, analogiczne badania wykonano tak¿e z TMTD. W przy-padku TMTD wykonano test naskórny ze stê¿eniami 0,1%, 1%, 3%, 5%. U zwierz¹t stosowano okluzjê (plaster opatrun-kowy, banda¿) przez okres 24 h w celu zapobiegniêcia usu-niêcia przez zwierzê substancji badanych. Wykwity skórne oceniono po 1 h i po 24 h. Zwierzêta, u których wykonano ww. testy nigdy wczeniej nie mia³y kontaktu z substancjami badanymi.
Dowiadczalne uczulenie winek morskich na tiuram zo-sta³o przeprowadzone na podstawie standardowej procedury testu maksymalizacji na winkach morskich wg Magnussona Kligmana zgodnie z wytycznymi OECD (19) w celu wykaza-nia w kolejnym etapie dowiadczewykaza-nia reakcji krzy¿owych tiu-ramu z substancjami badanymi. Podczas fazy indukcji uczu-lenia 0. dnia podano 6 iniekcji ródskórnych w okolicy obu ³opatek: 2 iniekcje po 0,1 cm3 kompletnego adiuwantu Freunda
(FCA) w wodzie destylowanej (FCA/woda 1 : 1 v/v), 2 iniek-cje 0,1 ml 5% roztworu TMTD w acetonie oraz 2 iniekiniek-cje po 0,1 ml 5% roztworu TMTD w FCA/aceton (1 : 1 v/v). Szóste-go dnia w okolicy poprzednich iniekcji wydepilowano sieræ na powierzchni 2 × 4 cm i przemyto 5% wodnym roztworem siarczanu laurylosodowego, natomiast 7 dnia naniesiono miej-scowo na skórê, 0,2 cm3 25% mieszaninê TMTD w wazelinie
bia³ej. Za³o¿ono opatrunek na okres 48 h. W fazie wzbudze-nia uczulewzbudze-nia (FWU I) dwzbudze-nia 21. wydepilowano sieræ na klat-ce piersiowej po stronie lewej na powierzchni 2 × 4 cm, prze-myto 5% wodnym roztworem siarczanu laurylosodowego, na-stêpnego dnia miejscowo na skórê naniesiono na obszarze 2 × 4 cm 3% TMTD w wazelinie bia³ej (test naskórkowy). Zosta³a zastosowana okluzja opatrunkiem przez okres 24 h. W celu potwierdzenia wyników badania próbê naskórkow¹ (FWU II) powtórzono po 2 tygodniach od pierwszego odczy-tu tesodczy-tu. Ocenê wykwitów (rumieñ) i innych zamian skórnych (obrzêk) przeprowadzono po 24 h, 48 h, 72 h i 96 h od mo-mentu aplikacji testu naskórnego, na podstawie czteropunk-towej skali Magnussona Kligmana: /0/ brak jakichkolwiek widocznych zmian, /1/ s³aby rumieñ bez obrzêku, /2/ red-nio nasilony rumieñ, rozprzestrzeniaj¹cy siê poza okolice apli-kacji substancji badanej bez obrzêku, /3/ silny rumieñ i obrzêk. Za pozytywny wynik testu naskórnego uznano reak-cje skórne /2/ i /3/. W grupie kontrolnej wykonano test mak-symalizacji Magnussona Kligmana, podobnie jak u zwierz¹t dowiadczalnych, lecz bez zastosowania TMTD w fazie in-dukcji uczulenia.
Do badania reakcji krzy¿owych u¿yto 3 winek morskich, które zosta³y uczulone w tecie maksymalizacji z TMTD. U tych zwierz¹t wykonano test naskórny z substancjami A, B, C i D w stê¿eniu 3%. Oceny reakcji skórnych dokonano analogicznie, jak w przypadku FWU w tecie maksymaliza-cji z u¿yciem tiuramu.
Do dalszych badañ, sporód 4 substancji, wybrano N-1--(benz)-2,4-dihydroksytiobenzamid (substancja B), zwi¹zek, który w reakcjach krzy¿owych z TMTD wykazywa³ odczyny dodatnie. Badania przeprowadzono metod¹ maksymalizacji Magnussona Kligmana wg protoko³u standardowego. W fa-zie indukcji uczulenia do iniekcji ródskórnych u¿yto 5% roz-tworu acetonowego substancji badanej, natomiast do aplika-cji miejscowej jej 25% mieszaniny w wazelinie bia³ej. Próbê naskórn¹ w FWU I i FWU II przeprowadzono z 3% miesza-nin¹ N-1-(benz)-2,4-dihydroksytiobenzamidu w wazelinie bia³ej. Ocenê reakcji skórnych przeprowadzono wg skali Magnussona Kligmana, analogicznie jak w przypadku do-wiadczalnego uczulania winek morskich na TMTD.
Badania in vitro przeprowadzono z zastosowaniem testu zahamowania migracji leukocytów met. kapilarow¹ (TZML) w celu potwierdzenia stanu nadwra¿liwoci u dowiadczal-nie uczulonych winek morskich oraz u zwierz¹t, u których wystêpowa³y reakcje krzy¿owe. Po pobraniu krwi wstêpnie wystandaryzowano alergen, uzyskuj¹c nietoksyczne stê¿enia TMTD oraz N-1-(benz)-2,4-dihydroksytiobenzamidu w sto-sunku do leukocytów, przeprowadzaj¹c TZML w roztworach o ró¿nym stê¿eniu substancji badanych. Wybrano te stê¿enia, które nie powodowa³y nieswoistego (toksycznego) hamowa-nia migracji leukocytów. Za wynik ujemny (brak hamowahamowa-nia migracji leukocytów) przyjêto wskanik indeksu I ³ 0,8, na-tomiast za wynik dodatni I < 0,8 (hamowanie migracji leuko-cytów).
Istotnoæ ró¿nic pomiêdzy grupami oceniano testem rang U Manna-Whitneya, natomiast korelacje testem Ko³mo-gorowa. Poziom b³êdu dla wszystkich obliczeñ wynosi³ p < 0,05. Wszystkie obliczenia zosta³y wykonane przy u¿yciu programu Statistica 6.0.
Wyniki i omówienie
Przystêpuj¹c do omówienia wyników badañ podkre-liæ nale¿y ich ukierunkowanie na ocenê potencjalnego ryzyka powodowania okrelonych dzia³añ niepo¿¹da-nych tioamidów i benzotiazolu (zwi¹zki A, B, C, i D), jako przysz³ych substancji terapeutycznych. Badania te mia³y na celu ocenê ich tolerancji miejscowej, poprzez okrelenie w³aciwoci dra¿ni¹cych dla skóry zdrowej, jak i obejmowa³y ocenê ich zdolnoci do powodowa-nia reakcji alergicznych. W badaniu tolerancji miejsco-wej, tj. porównawczej ocenie w³aciwoci dra¿ni¹cych dla zdrowej skóry winek morskich, wykazano istotne ró¿nice, co do tolerancji miejscowej pomiêdzy substan-cjami A, B, C, D a TMTD. Wyniki badania w³aciwo-ci dra¿ni¹cych zosta³y zilustrowane na ryc. 2. Okazuje siê, ¿e tiuram ju¿ w 5% stê¿eniu dra¿ni³ skórê wszyst-kich badanych zwierz¹t. U jednego z nich pierwsze wykwity pojawi³y siê ju¿ po 1 godz. od aplikacji sub-stancji. Natomiast w grupie tioamidów tylko po aplika-cji substanaplika-cji B (N-1-(benz)-2,4-dihydroksytiobenza-midu) w stê¿eniu piêciokrotnie wy¿szym, czyli 25%
Ryc. 2. Odsetek winek morskich w tecie podra¿nieniowym, u których wystêpowa³y reakcje podra¿nieniowe dla poszcze-gólnych substancji badanych po 1 i 24 godzinach. Reakcje dodatnie dla substancji B wystêpowa³y przy stê¿eniu 25%, dla T 5% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% A B C D T 1h 24h
uzyskano reakcjê dodatni¹ w postaci podra¿nienia, po 1 h. Pozosta³e substancje nawet w stê¿eniu 25% nie powodowa³y podra¿nienia, co wiadczy o ich dosko-na³ej tolerancji miejscowej i wydaje siê wi¹zaæ z ma³¹ toksycznoci¹ naskórn¹ zwi¹zków A, C i D. Wynika z tego, ¿e prawdopodobieñstwo wystêpowania podra¿-nieniowego kontaktowego zapalenia skóry po np. tera-peutycznym jej kontakcie z badanymi zwi¹zkami jest niewielkie. Rokuje to dobrze, co do ewentualnych mo¿-liwoci miejscowego stosowania tych¿e rodków, w ta-kich postaciach leków, jak np. maci, kremy, ¿ele czy lotiony. Ustosunkowuj¹c siê do miejscowej reaktyw-noci podra¿nieniowej powodowanej przez 25% stê¿e-nie substancji B zaznaczyæ trzeba, ¿e wynik ten tak¿e nie dyskwalifikuje jej w aspekcie miejscowego stoso-wania. Opieraj¹c siê bowiem na danych dotycz¹cych wysokiej aktywnoci przeciwgrzybiczej tiobenzanili-dów w wielokrotnie ni¿szych stê¿eniach (4, 13, 15), za³o¿yæ mo¿na, i¿ zwyczajowe 0,5 do 3% terapeutycz-ne stê¿enia, a nawet i 10% koncentracja nie przynio-s³oby niepo¿¹danego efektu w postaci skórnych reakcji podra¿nieniowych. Mo¿na przypuszczaæ, i¿ fakt dosko-na³ej tolerancji tiobenzanilidów, po jednorazowym na-skórnym podaniu, kilkudziesiêciokrotnie wy¿szych od zwykle przyjêtych terapeutycznych stê¿eñ, wydaje siê tak¿e przemawiaæ korzystnie za ich dobr¹ tolerancj¹ miejscow¹ w wielokrotnych aplikacjach miejscowych np. w trakcie d³ugotrwa³ego leczenia zaka¿eñ grzybi-czych. Odniesienie wyników badañ w³asnych dotycz¹-cych tolerancji miejscowej do danych pimiennictwa jest z oczywistych wzglêdów niemo¿liwe, jako ¿e do-tycz¹ one nowo zsyntetyzowanych zwi¹zków i s¹ pierw-szymi danymi z tego zakresu. Stosowne dane na temat tolerancji miejscowej tiuramu pokrywaj¹ siê z danymi pimiennictwa (11).
W wyniku dowiadczalnego uczulania winek mor-skich w tecie maksymalizacji reakcje skórne w fazie wzbudzenia uczulenia (FWU I), jak i po powtórnym kontakcie z alergenem (FWU II) po 2 tygodniach od pierwszej próby, wyst¹pi³y u 3 sporód 5 zwierz¹t (60%), które zosta³y uznane za uczulone. U wszystkich trzech winek morskich po 48 h pojawi³y siê reakcje o ró¿nym nasileniu od s³abej reakcji rumieniowej /1/ do intensywnego rumienia z obrzêkiem skóry /3/. Intensyfikacja zmian skórnych w ka¿dym przypadku mia³a miejsce oko³o 72 h od momentu kontaktu alerge-nu ze skór¹. Oprócz obrzêku i rumienia, reakcji, które by³y podstaw¹ oceny zmian skórnych, obecne by³y rów-nie¿ wykwity wtórne, tj. strupy oraz nad¿erki, które po-jawi³y siê u dwóch osobników. Dwie winki morskie nie wykazywa³y ¿adnych objawów klinicznych zarów-no po pierwszej, jak i po drugiej próbie wzbudzenia uczulenia. Zwierzêta te uznano za nieuczulone. Uzys-kane wyniki po raz kolejny udowadniaj¹, ¿e dwusiar-czek czterometylotiuramu w tecie maksymalizacji wy-kazywa³ redni stopieñ si³y uczulania (III st.), co jest zgodne ze stwierdzeniami innych autorów (15) oraz
po-wszechn¹ opini¹ o czêstoci wystêpowania uczuleñ na ten zwi¹zek u ludzi i zwierz¹t (16, 18).
W badaniu reakcji krzy¿owych wród 3 wczeniej uczulonych winek morskich na TMTD, w wyniku prze-prowadzonych testów naskórnych z substancjami A, B, C, D wykazano wystêpowanie skórnej reaktywnoci krzy¿owej jedynie z substancj¹ B, natomiast substan-cje A, C oraz D pozostawa³y w testach naskórkowych areaktywne. Reakcja dodatnia obserwowana by³a u wszystkich 3 zwierz¹t. W jednym przypadku reakcja rumieniowa widoczna by³a ju¿ po 48 godzinach od jej aplikacji, natomiast po trzech dobach od kontaktu z ni¹, dodatni wynik mo¿na by³o stwierdziæ u trzech winek morskich. Zmiany skórne utrzymywa³y siê przynajmniej do 96. godziny, która by³a momentem granicznym ob-serwacji zwierz¹t. Nasilenie reakcji by³o zmienne i prze-biega³o od redniego stopnia rumienia do silnej reakcji obrzêkowej skóry z tworzeniem strupa. Substancje A, C i D nie wykazywa³y reakcji krzy¿owych z TMTD. Jedynie w przypadku zwi¹zków A i D widoczny by³ s³aby rumieñ /1/ i nie uwzglêdniono tego odczynu jako reakcji dodatniej. Z powy¿szego nasuwa siê wniosek, ¿e terapeutyczne zastosowanie substancji B (N-1--(benz)-2,4-dihydroksytiobenzamidu) powinno byæ wy-kluczone u osobników uczulonych na tiuram, za sto-sowanie substancji A, C, oraz D nie wymaga powy¿-szego zastrze¿enia. Co wiêcej, w przypadku, gdyby w³aciwoci biologiczne substancji B predysponowa³y j¹ do rejestracji jako okrelonego leku, to w materia-³ach informacyjnych, dotycz¹cych dzia³añ niepo¿¹da-nych winno znaleæ siê sformu³owanie nie stosowaæ u osób uczulonych na tiuram.
Fakt wystêpowania reakcji krzy¿owych w przypad-ku substancji B, ukierunkowywa³ dalszy tok pracy ba-dawczej na sprawdzenie mo¿liwoci powodowania przez ni¹ uczulania. Wstêpne badania N-1-(benz)-2,4--dihydroksytiobenzamidu (tiobenzanilidu) w tecie maksymalizacji wykaza³y s³abe w³aciwoci uczulaj¹-ce i zgodnie z warunkami OECD dla substancji uczula-j¹cych, nie mo¿na jej zaklasyfikowaæ do grupy zwi¹z-ków o wysokim ryzyku powodowania uczulenia po kontakcie ze skór¹, ze wzglêdu na ni¿szy ni¿ 30% od-setek zwierz¹t uczulonych w tecie maksymalizacji. Pomimo tego, u 20% uczulanych winek morskich, mo¿na by³o stwierdziæ pozytywne reakcje w tecie maksymalizacji. wiadczy to o tym, ¿e zwi¹zek ten, w szczególnych warunkach (w tym przypadku w obec-noci adjuwantu, aplikacji ródskórnej), jest w stanie samoistnie wywo³aæ uczulenie kontaktowe. Z pimien-nictwa wiadomo, ¿e wystêpowanie alergii kontaktowej nie tylko uzale¿nione jest od si³y uczulaj¹cej zwi¹zku, co wykazuje test maksymalizacji, lecz równie¿ wi¹¿e siê z powszechnoci¹ kontaktu z ni¹ ludzi i zwierz¹t w rodowisku (3). W badanich w³asnych zarówno w FWU I, jak i FWU II, sporód 10 winek morskich uczulanych na substancjê B, dodatnie reakcje w tecie maksymalizacji, wiadcz¹ce o uczuleniu, stwierdzono u 2 zwierz¹t (20%). Reakcje dodatnie u obu zwierz¹t
wystêpowa³y ju¿ po 48 godzinach po aplikacji badane-go zwi¹zku w próbie II, natomiast w próbie I u jednebadane-go zwierzêcia. Nasilenie reakcji skórnych u jednego zwie-rzêcia w obu próbach by³o podobne, u drugiego za po ponownym kontakcie z alergenem nasilenie reakcji aler-gicznej mia³o o wiele ³agodniejszy przebieg. Z powy¿-szego wynika, ¿e pomimo s³abych w³aciwoci uczula-j¹cych N-1-(benz)-2,4-dihydroksytiobenzamidu, nale-¿y braæ pod uwagê potencjalne ryzyko pojawienia siê uczuleniowych reakcji kontaktowych, szczególnie przy parenteralnym stosowaniu u osobników predysponowa-nych do rozwoju kontaktowego zapalenia skóry w przy-padku powszechnego u¿ycia jej w preparatach leczni-czych.
Test zahamowania migracji leukocytów od szeregu lat uznawany jest za jedn¹ z metod wykazywania nad-wra¿liwoci kontaktowej na substancje chemiczne u lu-dzi i zwierz¹t (2). W przeprowadzonych badaniach wykazano ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy war-tociami strefy migracji leukocytów pomiêdzy kontrol¹ nie zawieraj¹c¹ antygenów T i B a wartociami strefy mi-gracji zarówno w obecnoci tiuramu, jak i N-1-(benz)--2,4-dihydroksytiobenzamidu w grupach zwierz¹t uczu-lonych na T i uczuuczu-lonych na B. Nie wykazano ró¿nic statystycznie istotnych pomiêdzy wartociami strefy migracji leukocytów w obecnoci T a wartociami stre-fy migracji w obecnoci B zarówno w grupie zwierz¹t uczulonych na T, jak i na B. Istotnoæ ró¿nic pomiêdzy poszczególnymi grupami zosta³a wykazana dla p < 0,05. Wystêpowa³a wysoka korelacja pomiêdzy dodatnimi reakcjami w testach naskórkowych u zwierz¹t uczula-nych na tiuram oraz wartociami indeksu migracji leu-kocytów w TZM zarówno w obecnoci T (r = 0,67), jak i subst. B (r = 0,76). Wyniki w³asne testu dodatko-wo potwierdzaj¹ zaistnienie stanu nadwra¿lidodatko-woci typu komórkowego u winek morskich uczulonych na tiu-ram oraz substancjê B, za wysoka korelacja pomiêdzy testami naskórnymi a testem zahamowania migracji jednoznacznie rozstrzyga o rzeczywistym powstaniu dowiadczalnego uczulenia.
Wnioski
1. Zwi¹zki o budowie tioamidów i benzotiazolu ce-chuje doskona³a skórna tolerancja miejscowa, zatem prawdopodobieñstwo powodowania przez nie niepo-¿¹danych oddzia³ywañ podra¿nieniowych, np. po tera-peutycznym naskórnym zastosowaniu, jest znikome.
2. 2,4-dihydroksytiobenzamid cechuje reaktywnoæ krzy¿owa z tiuramem, podczas gdy N-1-[2-(4-fenylo-6-metylo-benzotiazolo)]-2,4-dihydroksytiobenzamid i N-1-(3,5dibenztriflorometylo)-2,4-dihydroksytio-benzamid oraz benzotiazol nie wykazuj¹ powy¿szej w³aciwoci.
3. 2,4-dihydroksytiobenzamid charakteryzuje siê s³a-bymi w³aciwociami uczulaj¹cymi, zatem, zgodnie z klasyfikacj¹ OECD, nie mo¿na zaklasyfikowaæ go do grupy zwi¹zków o wysokim ryzyku powodowania uczu-leñ kontaktowych.
4. Wydaje siê, i¿ w warunkach szczególnych, np. parenteralnego stosowania 2,4-dihydroksytiobenzami-du u osobników predysponowanych do rozwoju alergii kontaktowej, mo¿na liczyæ siê z potencjalnym ryzykiem powstania uczuleniowych reakcji kontaktowych.
5. Wysoka korelacja pomiêdzy testami naskórnymi a testem zahamowania migracji jednoznacznie rozstrzy-ga o rzeczywistym powstaniu dowiadczalnego uczu-lenia, a zatem o wysokiej przydatnoci powy¿szych metod w badaniu uczuleñ kontaktowych.
Pimiennictwo
1.Andersen K. E., Frankild S.: Allergic Contact Dermatitis. Clin. Derm. 1997, 15, 645-654.
2.Hallab N., Jacobs J. J., Jonathan B.: Hypersensitivity to metallic biomate-rials: review of leukocyte migration inhibition assays. Biomaterials 2000, 21, 1301-1314.
3.Ikarachi Y., Kaniwa M., Tsuchiya T.: Sensitization potential of gold sodium thiosulfate in mice and guinea pigs. Biomaterials 2002, 23, 4907-4914. 4.Jówiak K., Szumi³o H.: Correlation of fungostatic activity with log P and
sigma parameters in the group of thiobenzanilides. Acta Pol. Pharm. 2000, 57, 82-84 Supl.
5.Kowalska-Py³ka H., Majer-Dziedzic B., Niewiadomy A., Matysiak J.: Evalu-ation of the toxity of substituted benzthioanilides by using in vitro tests. ATLA-Alternatives to Laboratory Animals. 2001, 5, 547-556.
6.Kunes J., Balsanek V., Pour M., Waisser K., Kaustowa J.: On relationship between the substitution pattern of thiobenzanilides and their antimycobac-terial activity. Farmaco 2002, 9, 777-782.
7.Matysiak J., Niewiadomy A., Krajewska Ku³ak E., M¹cik-Niewiadomy G.: Synthesis of some 1-(2,4-dihydroxythiobenzoyl)imidazoles, -imidazolines and -tetrazoles and their potent activity against Candida species. Farmaco 2003, 58, 455-461.
8.Matysiak J., Niewiadomy A., M¹cik-Niewiadomy G., Korni³³owicz T.: De-pendence of fungistatic activity of 2,4-dihydroxythiobenzanilides on the struc-ture and lipophilic nastruc-ture of the compounds. Eur. J. Med. Chem. 2000a, 35, 393-404.
9.Matysiak J., Niewiadomy A., M¹cik-Niewiadomy G.: In vitro inhibition pro-perties of a new group of thiobenzanilidies in relation to yeasts. Eur. J. Phar-maceut. Sci. 2000 b, 10, 119-123.
10.Modzelewska-Banachiewicz B., Matysiak J., Niewiadomy A.: Synthesis and mycological activity of the compounds obtaind in the reaction of N3-substi-tuted amidrazones with sulphinyl-bis-2,4-dihydroxybenzenethioyl Eur. J. Med. Chem. 2001, 36, 75-80.
11.Nielsen N.: Allergic contact sensitization in adult Danish population: two cross-sectional surveys eight years apart (the Copenhagen Allergy study). Acta Derm. Venereol. 2001, 81, 31-34.
12.Niewiadomy A., Matysiak J., M¹cik-Niewiadomy G.: In vitro evaluation of 2,4-dihydroxythiobenzanilides against various moulds. Eur. J. Pharmac. Sci. 2001, 13, 243-248.
13.Niewiadomy A., Matysiak J., ¯abiñska A., Ró¿y³o J. K., Senczyna B., Jówik K.: Reversed-phase high-performence liquid chromatography in quan-titative structure-activity relationship studies of new fungicides. J. Chroma-togr. 1998, 828, 431-438.
14.Niewiadomy A., ¯abiñska A., Matysiak J., Ró¿y³o J. K.: Influence of modi-fier and molecular structure of some dihydroxythiobenzanilides on retention in reversed-phase highperformance thin-layer chromatography. J. Chroma-togr. 1997, 791, 237-243.
15.Och van F. M. M., Vandebriel R. J., Prinsen M. K., De Jong W. H., Slob W., Loveren van H.: Comparison of dose-responses of contact allergens using the guinea pig maximization test and the local lymph node assay. Toxicology 2001, 167, 207-215.
16.Olivry T., Prelaud P., Heripret P., Atlee B. A.: Contact dermatitis in the dog: principles and diagnosis. Vet. Clin. N. Amer. 1990, 20, 1433-1456. 17.OECD. Organization for Economic Cooperation and Development.
Guideli-ne 406: Skin sensitization. 1992.
18.Rudzki E., Rebandel P.: Allergy to tetramethylthiuram disulfide, a compo-nent of pesticides and rubber. Ann. Agric. Environ. Med. 1998, 5, 21-23. 19.Schlede E., Eppler R.: Testing for skin sensitization according to the
notifi-cation procedure for new chemicals: The Magnusson and Kligman test. Con-tact Dermatitis 1995, 32, 1-4.
Adres autora: dr Piotr Wilko³ek, ul. G³êboka 30, 20-612 Lublin; e-mail: pwilku@poczta.onet.pl
