Praca oryginalna Original paper
Grzyby z rodzaju Malassezia zaliczane s¹ do fizjo-logicznej flory skóry i b³on luzowych ludzi i zwierz¹t (1, 2). Mog¹ byæ równie¿ odpowiedzialne za ró¿nego typu powierzchniowe infekcje skóry oraz, znacznie rzadziej, za grzybice systemowe (13), a nawet funge-mie (19). Wprowadzenie technik biologii molekular-nej do badañ mikologicznych pozwoli³o, w po³¹cze-niu z charakterystyk¹ morfologiczn¹, ultrastruktural-n¹ i fizjologiczultrastruktural-n¹ grzybów (10), na reklasyfikacjê ro-dzaju Malassezia i ustanowienie jedenastu odrêbnych gatunków: M. pachydermatis, M. globosa, M. furfur, M. sympodialis, M. slooffiae, M. obtusa, M. restricta, M. dermatis, M. nana, M. japonica i M. yamatoensis. Badania na poziomie genomu pozwoli³y, w obrêbie rodzaju Malassezia, nie tylko na wyodrêbnienie po-szczególnych jednostek taksonomicznych, ale równie¿ wykaza³y ró¿nice pomiêdzy poszczególnymi szczepa-mi tego samego gatunku (7, 21). Wyniki wewn¹trz-gatunkowego typowania zale¿a³y przede wszystkim od badanego regionu DNA, co, jak nale¿y przypuszczaæ, t³umaczy rozbie¿noci uzyskiwanych wyników (14).
Ustalone genotypy szczepów Malassezia zwi¹zane by³y na ogó³ z gatunkiem gospodarza (22), nie wyka-zywa³y jednak korelacji ani z miejscem izolacji, ani z patogennoci¹ szczepu (7).
Wysoki stopieñ heterogennoci fenotypowej obser-wowany w obrêbie gatunku M. pachydermatis (16), a tak¿e niemo¿noæ wyodrêbnienia, mimo szeroko prowadzonych badañ w tym zakresie, markerów patogennoci, których obecnoæ wskazywa³aby na chorobotwórczoæ szczepu, sk³ania do poszukiwania ró¿nic na poziomie genomu.
Celem badañ by³o podjêcie próby wykazania we-wn¹trzgatunkowej heterogennoci szczepów Malas-sezia pachydermatis w aspekcie ich pochodzenia (szczepy izolowane od zwierz¹t zdrowych i z klinicz-nymi objawami otitis externa). Genotypizacja szcze-pów zosta³a przeprowadzona z zastosowaniem meto-dy PCR-REA, po uprzednim wyselekcjonowaniu lub opracowaniu optymalnej, cechuj¹cej siê wysok¹ wy-dajnoci¹ i powtarzalnoci¹ procedury uzyskiwania DNA z komórek grzyba.
Wewn¹trzgatunkowe ró¿nicowanie szczepów
Malassezia pachydermatis z wykorzystaniem PCR-REA
ANETA NOWAKIEWICZ, GRA¯YNA ZIÓ£KOWSKAZak³ad Mikrobiologii Weterynaryjnej Instytutu Biologicznych Podstaw Chorób Zwierz¹t Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UP, ul. Akademicka 12, 20-033 Lublin
Nowakiewicz A., Zió³kowska G.
Intraspecies differentiation of Malassezia pachydermatis strains with PCR-REA technique
Summary
The aim of the study was to make an attempt at showing the intraspecies heterogenecity of Malassezia pachydermatis strains with regards to their origin (strains isolated from healthy dogs and with otitis externa symptoms).
The study included 41 strains of Malassezia pachydermatis species isolated in a pure culture from dogs with clinical otitis externa symptoms (n = 20), clinically healthy dogs (n = 20) and a reference strain, M. pachydermatis (CBS7925). In order to isolate the genetic material from the fungal cells, the following four procedures were selected: mechanical, enzymatic, thermal and chemical. Considering the yield and repeatability of a method for the genomic DNA extraction, a mechanical method was applied. The genetic material research of each strain was performed according to PCR-REA technique with the amplification of three genome regions: ITS, LSU rRNA and a gene encoding beta-tubuline. The ITS and LSU rRNA regions were amplified employing the standard PCR reagents, whereas the region coding beta-tubuline with the so called touch down. The obtained amplification products were subjected to restrictive analysis by means of the following enzymes: EcoRI, Ncol, Hinfl, Alul, and Eco881 (Aval). The performed investigations made it possible to reveal the genotypic differen-tiation within M.pachydermatis species as well as some correlation between a genotypic profile and the origin of a strain (from healthy animals or with otitis externa symptoms), which may imply the existence of genetic conditioning of the Malassezia strains pathogenicity.
Materia³ i metody
Badaniami objêto 41 szczepów, nale¿¹cych do gatunku M. pachydermatis. Szczepy wytypowane do badañ by³y izo-lowane w czystej kulturze od psów z klinicznymi objawami zapalenia zewnêtrznego kana³u s³uchowego (n = 20), od psów zdrowych klinicznie (n = 20) oraz referencyjny szczep M. pachydermatis (CBS7925).
Izolacja genomowego DNA. Zawiesinê grzyba o gêstoci 2 × 109 cfu ml1 (0,5 ml) inokulowano na sta³e pod³o¿e
Sa-bourauda i inkubowano w temperaturze 37°C przez trzy dni. Uzyskane hodowle zbierano i zawieszano w ja³owym p³ynie fizjologicznym, nastêpnie wirowano trzykrotnie po 10 min. (8 × 1000 g). Supernatant usuwano, a komórki poddawano dalszym procesom izolacji DNA z wykorzystaniem nastêpu-j¹cych metod: metody chemicznej (11), termicznej (14), me-chanicznej (15, 16) i enzymatycznej (23), w której jako czyn-nika lizuj¹cego u¿yto litykazy (Yeast Lytic Enzyme, Arthro-bacter Species ImmunO), w stê¿eniu 8 U/500 µl buforu lizu-j¹cego. Proces ekstrakcji, precypitacji i suszenia materia³u przeprowadzono wed³ug powszechnie stosowanej procedury izolacji DNA (17). Próbki uzyskane po zastosowaniu poszcze-gólnych metod oceniono wstêpnie na obecnoæ DNA (elek-troforeza w 1% ¿elu agarozowym), a nastêpnie przechowy-wano w temperaturze 20°C do momentu wykorzystania.
Amplifikacja wytypowanych regionów genomu. Ampli-fikacji poddano trzy regiony genomu Malassezia spp.: ITS, LSU rRNA i gen koduj¹cy â-tubulinê (11, 16).
Reakcjê przeprowadzano w 50 µl mieszaniny, o sk³adzie: matryca DNA, startery (2 µl/50 µl mieszaniny), mieszanina 2 mM deoksynukleotydów (5 µl/50 µl mieszaniny), termosta-bilna polimeraza DNA delta2, bufor reakcyjny i jony magne-zu (DNA Gdañsk). Standaryzowano iloæ matrycy DNA, stê-¿enie termostabilnej polimerazy i jonów magnezu. Do reakcji stosowano wstêpnie próbkê materia³u (matrycy DNA) objê-toci 0,5, 1 lub 2 µl oraz próbkê rozcieñczon¹ w buforze TE w stosunku 1 : 10, równie¿ w iloci 0,5, 1 lub 2 µl, stê¿enie jonów magnezu w iloci 2, 3 lub 4 mM (50 mM MgCl2)/50 µl mieszaniny reakcyjnej, optymalne stê¿enie termostabilnej po-limerazy okrelono w zakresie 1-0,6 U (2 U/µl)/50 µl miesza-niny reakcyjnej.
Reakcjê PCR-REA przeprowadzono w warunkach uprzed-nio wystandaryzowanych (15).
Analizê restrykcyjn¹ przeprowadzono z zastosowaniem enzymów EcoRI, NcoI, HinfI, AluI, Eco881(AvaI). Proces przeprowadzano zgodnie z instrukcj¹ producenta. Produkty trawienia poddano elektroforezie w 2% ¿elu agarozowym. Analizê wyników i dokumentacjê ¿eli przeprowadzono z za-stosowaniem Gel Doc 2000 (Bio-Rad).
Wyniki i omówienie
Stosowane dotychczas metody fenotypowej klasyfi-kacji drobnoustrojów, obok trudnoci przy identyfiklasyfi-kacji poszczególnych gatunków, wymagaj¹ wysokiego nak³a-du pracy, s¹ czasoch³onne i kosztowne. W chwili obec-nej istotn¹ rolê w identyfikacji oraz ró¿nicowaniu grzy-bów z rodzaju Malassezia, podobnie jak innych drobno-ustrojów, spe³niaj¹ ró¿nego typu analizy DNA (6).
Analizê genomu grzybów z rodzaju Malassezia w celach ich klasyfikacji gatunkowej zapocz¹tkowali Simmons i Gueho (20), identyfikuj¹c na podstawie ró¿-nic w zawartoci G+C (%mol) oraz stopnia reasocjacji DNA/DNA w ró¿nych izolatach, nowy gatunek M. sym-podialis, a w latach nastêpnych M. globosa, M. restricta i M. obtusa (9). Wyniki te zosta³y potwierdzone przy za-stosowaniu takich metod, jak kariotypizacja (18), RFLP (24) czy sekwencjonowanie okrelonych regionów (21). Bez wzglêdu jednak na rodzaj u¿ytej techniki mole-kularnej, jednym z najwa¿niejszych warunków jej po-wodzenia jest dobór odpowiedniej procedury izolacji DNA z komórki. W diagnostyce mikologicznej stanowi to bardzo istotny problem, ze wzglêdu na grub¹, czêsto trudn¹ do dezintegracji (zarówno mechanicznie, jak i enzymatycznie), wielowarstwow¹, strukturê ciany ko-mórkowej, a tak¿e obecnoæ dodatkowych warstw ze-wnêtrznych (np. otoczka Cryptococcus neoformans). Ponadto komórki niektórych grzybów w trakcie procesu ekstrakcji uwalniaj¹ pewne zwi¹zki, takie jak np. poli-sacharydy, zwi¹zki polifenolowe, terpentoidowe, antra-chinony, jony jodu lub wapnia, które poprzez wi¹zanie kwasu nukleinowego mog¹ spowodowaæ zablokowanie jego funkcji biologicznych (4). Podobne dzia³anie mog¹ wykazywaæ równie¿ niektóre detergenty, np. siarczan dodecylu sodu, wykorzystywane w pro-cesie izolacji DNA (4).
W badaniach w³asnych doboru opty-malnej procedury izolacji DNA doko-nano sporód czterech metod: chemicz-nej, termiczchemicz-nej, mechanicznej i enzy-matycznej.
Ocenê poszczególnych metod prze-prowadzono na wzorcowym szczepie M. pachydermatis (CBS 7925) oraz trzech wybranych losowo izolatach tego samego gatunku pochodz¹cych z kolekcji Zak³adu Mikrobiologii Weterynaryjnej. Wstêpna ocena uzys-kanego materia³u (elektroforeza pró-bek w 1% ¿elu agarozowym) wykaza-³a obecnoæ materia³u genetycznego w próbkach uzyskanych metod¹ me-chaniczn¹ i enzymatyczn¹ (ryc. 1), na-tomiast próbki uzyskane dwoma pozo-r N u p e z c z s Gatunek ij c n e w k e s d o K S T I EcoRI NcoI Ava Bt S B C 5 2 9 7 M.pachydermaits 80A0pz 350iC450pz 350iF450pz 600Kpz M S B C 9 1 0 7 M.fufrur 80A0pz 350iC450pz 350iF450pz 400Ipz 550Lpz S B C 2 2 2 7 M.sympodiails 70B0pz 400Epz 350Hpz 400Ipz 550Lpz S B C 9 5 9 7 M.sloofifae 80A0pz 450iC5'50pz 80G0pz 400Ipz 550Lpz S B C 6 6 9 7 M.globosa 80A0pz 35D0pz 80G0pz 600Kpz M S B C 7 7 8 7 M.restircta 80A0pz 350Dpz 80G0pz 600Kpz 550Lpz S B C 6 7 8 7 M.obtusa 80A0pz 350iC450pz 800Gpz 600Kpz M
Tab. 1. Wzorzec identyfikacji gatunkowej dla rodzaju Malassezia (metoda PCR--REA)
sta³ymi metodami nie wykazywa³y obecnoci DNA w ¿adnym z wariantów przeprowadzonej inkubacji (3, 12 i 24 godziny w metodzie chemicznej oraz 5, 30 i 60 minut w metodzie termicznej).
Celem weryfikacji wyników uzyskanych w ocenie wstêpnej, próbki uzyskane przy pomocy przedstawionych metod poddano równolegle procesowi amplifikacji. W pierwszym etapie wystandaryzowano mieszaninê re-akcyjn¹ oraz warunki reakcji PCR dla poszczególnych amplifikowanych regionów genomu. Brak skutecznoci metody chemicznej i termicznej zosta³ potwierdzony równie¿ wynikami reakcji amplifikacji; w ¿adnym z tes-towanych wariantów nie uzyskano amplikonu (ryc. 2).
W przypadku metody mechanicznej powtarzalnoæ wyników uzyskano przy zastosowaniu matrycy rozcieñ-czonej w stosunku 1 : 10 w TE i u¿ytej w iloci 1 lub 2 µl na 50 µl mieszaniny reakcyjnej; wprowadzenie do reakcji nie rozcieñczonej matrycy hamowa³o powstawa-nie produktu. Optymalny sk³ad mieszaniny reakcyjnej ustalono jako: 5 µl buforu reakcyjnego, 5 µl deoksynu-kleotydów (2 mM), 2 µl MgCl2 (50 mM), 2 µl ka¿dego ze starterów oraz 0,3 µl (0,6 U/50 µl) termostabilnej polimerazy.
Stê¿enie matrycy DNA uzyskanego metod¹ enzyma-tycznej lizy komórki ustalono na 2 µl (matryca nie wy-maga³a rozcieñczania). Natomiast w mieszaninie reak-cyjnej dwukrotnie podwy¿szono stê¿enie jonów MgCl2, dodaj¹c 4 µl na 50 µl koñcowej objêtoci; stê¿enie po-zosta³ych sk³adników mieszaniny by³o takie, jak w re-akcji z matryc¹ uzyskan¹ przez mechaniczn¹ dezinte-gracjê komórki.
Celem optymalizacji warunków reakcji PCR wystan-daryzowano temperaturê przy³¹czania starterów oraz iloæ powtarzanych cykli reakcji (15). Dla starterów Bt zastosowano tzw. touch dawn, ze wzglêdu na powsta-wanie niespecyficznych produktów amplifikacji w wa-runkach standardowych (11, 15). Wyniki uzyskane dla
poszczególnych metod izolacji przedstawia ryc. 2. W pierwszej z metod wykorzystano bufor lizuj¹cy, któ-rego g³ównym sk³adnikiem by³ mocznik charakteryzu-j¹cy siê silnymi w³aciwociami denaturucharakteryzu-j¹cymi w sto-sunku do bia³ek (destrukcja ciany komórkowej grzy-ba). Mimo pozytywnych wyników, uzyskiwanych przez innych autorów, (11) w badaniach w³asnych nie otrzy-mano wizualizacji DNA bezporednio po izolacji, jak i po amplifikacji próbek przy udziale starterów ITS i 26S. W metodzie termicznej komórki poddano dzia³aniu wysokiej temperatury, a nastêpnie szybko sch³odzono, co powinno wywo³aæ zniszczenie struktur powierzch-niowych i uwolnienie materia³u genetycznego (14). Za-stosowanie tej metody w badaniach w³asnych równie¿ nie przynios³o pozytywnego rezultatu; brak amplifikacji próbki w przeprowadzonych badaniach wykluczy³ j¹ jako przydatn¹ w uzyskiwaniu genomowego DNA. Byæ mo¿e, po³¹czenie metody termicznej z chemiczn¹ mog³oby przynieæ zadowalaj¹ce rezultaty, jednak¿e metody sto-sowane oddzielnie, prawdopodobnie ze wzglêdu na struk-turê ciany komórki Malassezia (3) nie da³y pozytywne-go wyniku.
Metoda mechaniczna polega³a na mechanicznej dez-integracji komórek grzyba w homogenizerze orbitalnym; wszystkie etapy izolacji przeprowadzano w temperatu-rze oko³o 4°C, co zapobiega³o ewentualnej aktywacji enzymów uszkadzaj¹cych DNA (DNA-azy). Natomiast w metodzie enzymatycznej wykorzystano w³aciwoci lityczne enzymu â-glukanazy, wobec jednego z g³ów-nych sk³adników ciany komórkowej. W wyniku hydro-lizy enzymatycznej powstaj¹ sferoplasty, pozbawione bariery osmotycznej, jak¹ stanowi ciana komórkowa, co w konsekwencji u³atwia uwolnienie DNA z komórki (23).
Ekstrakcja DNA przy udziale lizy enzymatycznej zabiera³a nieco wiêcej czasu (3-godzinna inkubacja ma-teria³u w temperaturze 37°C), ponadto podczas etapu inkubacji mog³o dochodziæ do aktywacji DNAaz, uwal-nianych w trakcie lizy komórki, co znacznie obni¿a³o wydajnoæ metody (17).
Jako kryteria doboru metody brano pod uwagê wy-dajnoæ, jakoæ materia³u genetycznego, powtarzalnoæ uzyskiwanych wyników oraz czas potrzebny na izolacjê DNA. Bior¹c pod uwagê fakt, i¿ metoda mechaniczna cechowa³a siê najwy¿sz¹ wydajnoci¹ (z jednej 50 µl próbki mo¿na wykonaæ ponad 200 reakcji amplifikacji), powtarzalnoci¹ (wszystkie badane próbki dawa³y spo-dziewany produkt reakcji przy trzykrotnym powtarza-niu procedury izolacji w ró¿nym czasie), zastosowano j¹ w badaniach w³asnych.
W drugim etapie pracy do badania materia³u gene-tycznego pochodz¹cego z terenowych szczepów M. pa-chydermatis zastosowano test PCR-REA. Do zalet tej techniki nale¿y zaliczyæ wysok¹ powtarzalnoæ uzyski-wanych wyników, zwi¹zan¹ ze standaryzacj¹ specyfiki dzia³ania enzymów restrykcyjnych oraz skutecznoæ w klasyfikacji grzybów na poziomie gatunku (8, 11). Gupta i wsp. (11) stosuj¹c tê metodê, wyodrêbnili w ra-mach gatunków M. sympodialis i M. furfur niezale¿ne genotypy.
Ryc. 1. Elektroforeza próbek materia³u genetycznego uzyska-nych przy pomocy metod: chemicznej (1-3), termicznej (4-6), enzymatycznej (7-9) i mechanicznej (10-12)
Ryc. 2. Amplifikacja matryc DNA uzyskanych przy pomocy metod: termicznej (1-4), mechanicznej (5-8), enzymatycznej (9-12), chemicznej (13-14)
Tab. 2. Cechy genotypowe szczepów M. pachydermatis izolowanych od zwierz¹t zdrowych i z objawami otitis externa
Objanienia: * szczepy izolowane od chorych zwierz¹t; ** 7925 referencyjny szczep M. pachydermatis. Oznaczenia wielkoci produktów amplifikacji i analizy restrykcyjnej regionów ITS, 26S LSU rRNA oraz regionu koduj¹cego â-tubulinê: A 800 pz, C 450, 350 pz, C 800, 450, 350 pz, F 450, 350 pz, T 800 pz, N 500, 300 pz, R 700 pz, K 600 pz, Z 450, 350 pz, W 200 pz, U 400 pz, L 550 pz, M brak amplikonu u p e z c z s r N ITS ITS 26S 26S Bt I R o c E NcoI Ava Hinf Alu Ava EcoRI NcoI Hinf Alu *14A* A C F T N R K K K Z W U M A 6 1 A C F T N R K K K Z W U M A 3 2 A C F T N R K K K Z W U L * 6 2 A C'' F T N R K K K Z W U L A 6 2 A C F T N R K K K Z W U M 7 2 * A C F T N R K K K Z W U L * 8 2 A C'' F T N R K K K Z W U L * 2 3 A C'' F T N R K K K Z W U M * 6 3 A C'' F T N R K K K Z W U L * 7 3 A C F T N R K K K Z W U L * 8 3 A C'' F T N R K K K Z W U L 0 4 * A C F T N R K K K Z W U M * 3 4 A C F T N R K K K Z W U L 4 4 * A C F T N R K K K Z W U M * 6 4 A C F T N R K K K Z W U L *47A* A C'' F T N R K K K Z W U L * 5 5 A C F T N R K K K Z W U M 9 5 * A C F T N R K K K Z W U M 3 6 * A C'' F T N R K K K Z W U L 4 6 * A C F T N R K K K Z W U M 5 6 * A C'' F T N R K K K Z W U M 6 6 * A C'' F T N R K K K Z W U L 3 7 * A C'' F T N R K K K Z W U M * 4 7 A C'' F T N R K K K Z W U L 5 7 * A C F T N R K K K Z W U M 6 7 * A C F T N R K K K Z W U M * 7 7 A C'' F T N R K K K Z W U M * 8 7 A C'' F T N R K K K Z W U L * 1 8 A C F T N R K K K Z W U M 6 8 * A C'' F T N R K K K Z W U L * 9 8 A C'' F T N R K K K Z W U L 0 9 * A C F T N R K K K Z W U L 4 9 * A C F T N R K K K Z W U M * 3 0 1 * A C'' F T N R K K K Z W U M * 4 0 1 * A C'' F T N R K K K Z W U L 4 2 1 ** A C F T N R K K K Z W U L * 3 3 1 * A C'' F T N R K K K Z W U L 8 3 1 ** A C F T N R K K K Z W U M 1 4 1 ** A C F T N R K K K Z W U M * 7 4 1 * A C'' F T N R K K K Z W U L * * 5 2 9 7 * A C F T N R K K K Z W U M
Bardzo du¿¹ przydatnoæ metody PCR-REA wykaza-no równie¿ w badaniach w³asnych do klasyfikacji ga-tunkowej i weryfikacji klasycznej identyfikacji mikolo-gicznej lipidozale¿nych izolatów Malassezia spp. (25). Celem uzyskania wy¿szej wartoci dyskryminuj¹cej metody PCR-REA w obecnych badaniach, jako enzymy restrykcyjne zastosowano, obok EcoRI, NcoI i Eco881, enzymy dodatkowe: HinfI i AluI. Otrzymane wyniki ilu-struje tab. 2. Jak wykazano, badane szczepy charaktery-zuje identyczny profil w zakresie produktów amplifika-cji regionów ITS i LSU rRNA oraz produktów analizy restrykcyjnej dla enzymów NcoI, Eco881, Hinf i Alu dla regionu ITS oraz Eco881, EcoRI, NcoI, Hinf i Alu dla regionu 26S. Genotypowe zró¿nicowanie odnotowano dla produktów amplifikacji regionu ITS, poddanych re-strykcji enzymem EcoRI (tab. 2, ryc. 4 i 5).
Sporód terenowych szczepów M. pachydermatis 21 dawa³o produkt wielkoci 450 i 350 pz, zgodnie z wzor-cem szczepu referencyjnego, podczas gdy 19 szczepów charakteryzowa³ produkt wielkoci 800, 450 i 350 pz (tab. 2). Na uwagê zas³uguje fakt, ¿e wród tych szczepów, 14 pochodzi³o od zwierz¹t z objawami otitis externa.
Drugim regionem w genomie M. pachydermatis, cha-rakteryzuj¹cym siê zmiennoci¹, by³ gen koduj¹cy â-tu-bulinê. W tym przypadku 18 szczepów na 40 badanych, wykaza³o zgodnoæ profilu ze szczepem referencyjnym (brak produktu amplifikacji), pozosta³e izolaty amplifi-kowa³y powy¿szy region, daj¹c produkt wielkoci 550 pz (tab. 2, ryc. 6 i 7). Ponadto czêæ szczepów wykazywa³a niejednoznaczny obraz wizualizacji produktów reakcji, cechuj¹cy siê licznymi, s³abo wyra¿onymi pr¹¿kami umiejscowionymi od wysokoci 600 do 100 pz (ryc. 6). Analiza uzyskanych wyników pozwala przypuszczaæ, ¿e badane szczepy M. pachydermatis mo¿na sklasyfiko-waæ w nastêpuj¹cych grupach: typ I charakteryzuje siê brakiem amplifikacji genu â-tubuliny oraz produktem restrykcji EcoRI: 450 i 350 pz, typ II wykazuje amplifi-kacjê regionu â-tubuliny i daje produkt restrykcji EcoRI 450 i 350 pz, typ III nie wykazuje amplifikacji genu â-tubuliny, a produkt restrykcji EcoRI typu C wynosi 800, 450 i 350 pz, typ IV charakteryzuje amplifikacja regionu â-tubuliny (550 pz), a produkt restrykcji EcoRI charakteryzuje siê 800, 450 i 350 pz. Uwzglêdniaj¹c rów-noczenie genotyp szczepu oraz jego pochodzenie (od zwierz¹t zdrowych lub z objawami otits externa) nale¿y stwierdziæ, ¿e genotyp IV grupuje na ogó³ szczepy pato-genne, genotyp I szczepy komensaliczne (w wiêkszo-ci), a genotyp II i III ma zró¿nicowany rozk³ad szcze-pów M. pachydermatis (tab. 3).
Uzyskane wyniki wiadcz¹, ¿e pomimo stosunkowo wysokiej wiarygodnoci metod klasycznych, techniki biologii molekularnej znajduj¹ zastosowanie jako me-tody rozstrzygaj¹ce, g³ównie w dochodzeniu epidemio-logicznym, ponadto znacznie skracaj¹ czas niezbêdny do identyfikacji poszczególnych izolatów. Wobec zró¿-nicowanego i labilnego profilu biochemicznego szcze-pów M. pachydermatis (lipidozale¿ne szczepy) wprowa-dzenie wysoce precyzyjnych i specyficznych metod bio-logii molekularnej do diagnostyki mikologicznej wyda-je siê konieczne (8).
Ryc. 3. Standaryzacja temperatury przy³¹czania (annelingu) starterów ITS; cie¿ki oznaczone numerami od 1 do 14 obra-zuj¹ reakcjê przy spadaj¹cej temperaturze przy³¹czania od 45 do 55,4°C
Ryc. 4. Analiza restrykcyjna fragmentu ITS enzymem EcoRI szczepów M. pachydermatis pochodz¹cych od chorych zwie-rz¹t; C 450 i 350 pz, C 800, 450 i 350 pz
Ryc. 5. Analiza restrykcyjna fragmentu ITS enzymem EcoRI szczepów M. pachydermatis pochodz¹cych od chorych zwie-rz¹t; C 450 i 350 pz, C 800, 450 i 350 pz
Ryc. 6. Amplifikacja regionu Bt szczepów M. pachydermatis izolowanych od chorych zwierz¹t; L 550 pz, M brak am-plifikacji
Ryc. 7. Amplifikacja regionu Bt szczepów M. pachydermatis izolowanych od zdrowych zwierz¹t; L 550 pz, M brak amplifikacji
p y t o n e G Szczepynale¿¹cedozwierz¹t h c y w o r d z chorych ) M , C ( I p y T , 5 7 , 4 6 , 9 5 , 4 4 , 0 4 , * A 6 1 1 4 1 , 8 3 1 , 4 9 , 6 7 14a,55,81 5 2 9 7 S B C * * ) L , C ( II p y T 23A,27,90,124 37,43,46 ) M ," C ( II I p y T 26A,65,73 32,77,103 ) L ," C ( V I p y T 63,66,86 267,8,288,9,316,043,8,13437,A,14774,
Tab. 3. Genotypy badanych szczepów M. pachydermatis
Objanienia: * nr szczepu; ** szczep referencyjny
Równoczesne zastosowanie a¿ trzech regionów do genetycznej identyfikacji dro¿d¿aków pozwoli³o nie tyl-ko na zró¿nicowanie miêdzygatuntyl-kowe, co potwierdza-j¹ wyniki uzyskane w badaniach wczeniejszych (11), ale te¿ dziêki wprowadzeniu dwóch dodatkowych enzy-mów (5) zwiêkszy³o szansê na wykazanie ró¿nic w ob-rêbie heterogennego fenotypowo gatunku M. pachyder-matis.
Badania molekularne gatunku M. pachydermatis po-twierdzi³y do pewnego stopnia fenotypow¹ heterogen-noæ szczepów, charakterystyczn¹ równie¿ dla innych gatunków Malassezia (11); wykazano zmiennoæ dwóch cech w profilu genotypowym dotycz¹c¹ produktu tra-wienia enzymem EcoRI amplikonu ITS oraz zmienn¹ amplifikacjê regionu koduj¹cego â-tubulinê. Zaobserwo-wana prawid³owoæ rozk³adu tych dwu cech w obrêbie grup szczepów pochodz¹cych od zdrowych i chorych psów (typ I i IV) pozwala przypuszczaæ, ¿e mo¿e ist-nieæ, podobnie jak w przypadku bakterii (12) genetycz-ne uwarunkowania patogennoci szczepów M. pachy-dermatis. Prowadzone w tym zakresie badania nie przy-nios³y, jak dot¹d, zadowalaj¹cych wyników. Guillot (7), sekwencjonuj¹c fragment genu koduj¹cego LSU rRNA, uzyska³ jedynie podzia³ tego gatunku na 7 typów, jed-nak¿e przynale¿noæ do nich z regu³y wi¹za³a siê z ga-tunkiem gospodarza, od którego pochodzi³ izolat, a nie z patogennoci¹ szczepu. Podobnie przy sekwencjono-waniu regionu IGS (intergenic spacer I region) nie zaob-serwowano korelacji z wirulencj¹ szczepu (22), chocia¿ w przypadku tego samego regionu u gatunku M. globo-sa wykazano ró¿nice pomiêdzy szczepami pochodz¹cy-mi ze zdrowej skóry a izolatapochodz¹cy-mi z przypadków chorobo-wych (21).
Wydaje siê, ¿e znalezienie genetycznych markerów patogennoci wymaga bardzo rozleg³ych i wnikliwych badañ, dotycz¹cych prawdopodobnie równie¿ innych regionów genomu i obejmuj¹cych wiêksz¹ pulê szcze-pów.
Wnioski
1. Opracowana metodyka w³asna izolacji DNA z ko-mórek Malassezia spp., charakteryzuj¹ca siê wysok¹ wydajnoci¹ i powtarzalnoci¹, a przy tym prosta i szyb-ka w wykonaniu, mo¿e znaleæ zastosowanie w badaniu materia³u genetycznego grzybów.
2. Technika PCR-REA multilocus, ze wzglêdu na rów-noczesn¹ analizê restrykcyjn¹ trzech regionów genomo-wego DNA, umo¿liwia nie tylko wysoce specyficzn¹ klasyfikacjê szczepów Malassezia na poziomie gatun-ku, ale równie¿ ich genotypowanie.
Pimiennictwo
1.Ashbee H. R., Evans E. G. V.: Immunology of diseases associated with Malas-sezia species. Clin. Microbiol. Rev. 2002, 15, 21-57.
2.Bond R., Howell S. A., Haywood P. J., Lloyd D. H.: Isolation of Malassezia sympodialis and M. globosa from healthy pet cats. Vet. Rec. 1997, 141, 200--201.
3.David M., Gabriel M., Kopecka M.: Unusual ultrastructural characteristic of yeast Malassezia pachydermatis. Scripta Medicina 2003, 76, 173-186. 4.Ekman S.: PCR optimization and troubleshooting with special reference to the
amplification of ribosomal DNA in lichenized fungi. Lichenologist 1999, 31, 517-531.
5.Gaitanis G., Velegraki A., Frangoulis E., Mitroussia A., Tsigonia A., Tzimo-gianni A., Katsambas A., Legakis N. J.: Identification of Malassezia species from patient skin scales by PCR-RFLP. Eur. Soc. Clin. Microbiol. Inf. Dis. 2002, 8, 162-173.
6.Gil-Lamaigniere C., Roilidies E., Hacher J., Muller F. M. C.: Molecular typing for fungi a critical review of the possibilities and limitations of currently and future methods. Eur. Soc. Clin. Microbiol. Inf. Dis. 2003, 9, 172-185. 7.Guillot J.: Epidemiological analysis of Malassezia pachydermatis isolates by
partial sequencing of the large subunit ribosomal RNA. Res. Vet. Sci. 1997, 62, 22-25.
8.Guillot J., Deville M., Berthelemy M., Provost F., Gueho E.: A single PCR--restriction endonuclease analysis for rapid identification of Malassezia species. Lett. Appl. Microbiol. 2000, 31, 400-403.
9.Guillot J., Gueho E.: The diversity of Malassezia yeasts confirmed by rRNA sequence and nuclear DNA comparisons. Antonie van Leeuwenhoek. 1995, 67, 297-314.
10.Guillot J., Gueho E., Lesourd M., Midgley G., Chevrier G., Dupont B.: Identifi-cation of Malassezia species: A practical approach. J. Mycol. Med. 1996, 6, 133-110.
11.Gupta A. K., Kohli Y., Summerbell R. C.: Molecular differentiation of seven Malassezia species. J. Clin. Microbiol. 2000, 38, 1869-1875.
12.Gursharan S., Walker M. J., Yan H., Timnis K. N., Guzman C. A.: Temperature dependent expession of an acid phosphatase by Bordetella bronchiseptica: role in intracellular survival. Microb. Pathogenesis 1997, 22, 257-164.
13.Inamader A. C., Palit A.: The genus Malassezia and human disease. Indian J. Dermatol. 2003, 69, 265-270.
14.Makimura K., Tamura Y., Kudo M., Uchida K., Saito H., Yamaguchi H.: Species identification and strain typing of Malassezia species stock strains and clinical isolates based on the DNA sequences of nuclear ribosomal internal transcribed spacer 1 regions. J. Med. Microbiol. 2000, 49, 29-35.
15.Nowakiewicz A.: Wspó³czesne metody ró¿nicowania diagnostycznego szcze-pów z rodzaju Malassezia izolowanych z przypadków klinicznych. Rozprawa dokt. Wydz. Medycyny Weterynaryjnej, AR Lublin 2005.
16.Nowakiewicz A., Zió³kowska G.: Fenotypowy profil patogennoci szczepów Malassezia pachydermatis. Medycyna Wet. 2007, 63, 721-727.
17.Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T.: Molecular Cloning (A laboratory manual). Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1989.
18.Senczek D., Siesenop U., Bohm K. H.: Characterization of Malassezia species by means of phenotypic characteristics and detection of electrophoretic karyo-types by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). Mycoses 1999, 42, 409-414. 19.Shattuck K. E., Cochran C. K., Zabrausky R. J., Pasarell L., Davis J. C., Malloy M. H.: Colonization and infection associated with Malassezia and Candida species in a neonatal unit. J. Hosp. Infect. 1996, 34, 123-129. 20.Simmons R. B., Gueho E.: A new species of Malassezia. Mycol. Res. 1990, 94,
1146-1149.
21.Sugita T., Takashima M., Shinoda T., Suto H., Unno T., Tsuboi R., Ogawa H., Nishikawa A.: New yeast species, Malassezia dermatis isolated from patients with atopic dermatitis. J. Clin. Microbiol. 2002, 40, 1363-1367.
22.Sugita T., Takeo K., Hama K., Virtudazo E., Takashima M., Nishikawa A., Kucsera J., Dorogi J., Komori S., Nakagaki K., Vollekova A., Slavikova E., Farka F.: DNA sequence diversity of intergenic spacer I region in the non-lipid--dependent species Malassezia pachydermatis isolated from animals. Med. Mycol. 2005, 43, 21-26.
23.Van Burik J., Myerson D., Schreckhise R. W., Bowden R. A.: Panfungal PCR assay for detection of fungal infection in human blood specimens. J. Clin. Microbiol. 1998, 36, 1169-1175.
24.Velegraki A., Kambouris M., Kostourou A., Chalevelakis G., Legakis N. J.: Rapid extraction of fungal DNA from clinical samples for PCR amplification. Med. Mycol. 1999, 37, 69-73.
25.Zió³kowska G., Nowakiewicz A.: Izolacja lipidozale¿nych szczepów Malassezia od psów i kotów. Medycyna Wet. 2006, 62, 913-917.
Adres autora: dr hab. Gra¿yna Zió³kowska prof. nadzw. UP, ul. Akade-micka 12, 20-033 Lublin; e-mail: grazyna.ziolkowska@ar.lublin.pl
