Medycyna Wet. 2008, 64 (7) 918
Praca oryginalna Original paper
Wirus zakanego ronienia klaczy (Equine Herpes-virus-1, EHV-1) jest wystêpuj¹cym powszechnie na ca-³ym wiecie á-herpeswirusem (9), stanowi¹cym wa¿ny czynnik etiologiczny licznych zaka¿eñ górnych dróg oddechowych i zaburzeñ neurologicznych koni oraz powoduj¹cym ronienia u klaczy (2).
Pierwotne objawy kliniczne zaka¿eñ EHV-1 ze stro-ny uk³adu oddechowego wystêpuj¹ g³ównie u m³odych, niedojrza³ych immunologicznie rebi¹t. Zachorowal-noæ wród nich siêga nawet 100%, jednak miertel-noæ, bêd¹ca wynikiem powik³añ bakteryjnych jest nis-ka (2). Zaburzenia neurologiczne mog¹ wystêpowaæ u osobników w ró¿nym wieku. Objawiaj¹ siê one nie-chêci¹ do ruchu i ataksj¹ z towarzysz¹cym pow³ócze-niem nogami, które wynikaj¹ z uszkodzenia rdzenia krêgowego. W ciê¿szych przypadkach mieræ nastêpu-je na skutek niewydolnoci oddechowo-kr¹¿eniowej spowodowanej pora¿eniem miêni (2). Najwiêksze zna-czenie, g³ównie z przes³anek ekonomicznych, maj¹ jed-nak zaka¿enia przebiegaj¹ce z poronieniami (2). Mog¹ one wystêpowaæ jako reaktywacja latentnego wirusa lub te¿ zazwyczaj jako reinfekcja uk³adu oddechowego ciê-¿arnych klaczy, które przeby³y wczeniej zaka¿enie, zwykle w ostatnim trymestrze ci¹¿y bez uprzednich ob-jawów klinicznych (2).
Izolacja wirusa w hodowlach komórkowych jest wci¹¿ przyjêtym standardem diagnostyki zaka¿eñ EHV-1. Materia³em stosowanym do ich zaka¿ania mog¹ byæ rozmaite próbki kliniczne, jak: wymazy z b³on lu-zowych, leukocyty krwi obwodowej oraz próbki tka-nek. Diagnostyka serologiczna wykazuje wiêksz¹ czu-³oæ, wymaga jednak stosowania odpowiednich ko-niugatów (14) oraz szybkiego transportu materia³ów badanych do laboratorium. Opisywane metody ulegaj¹ stopniowemu zastêpowaniu przez ³añcuchow¹ reak-cjê polimeryzacji (Polymerase Chain Reaction, PCR). Prócz odmiany tradycyjnej (3) do diagnostyki zaka¿eñ EHV-1 stosowane s¹ tak¿e warianty nested PCR (6) czy te¿ multiplex PCR, pozwalaj¹cy na identyfikacjê i ró¿nicowanie wirusa typu 1 i 4 (7).
Zastosowanie w badaniach wirusologicznych tech-niki PCR z analiz¹ przyrostu iloci produktu w czasie rzeczywistym (real-time PCR) pozwoli³o na zwiêksze-nie czu³oci i specyficznoci detekcji w porównaniu z wariantem tradycyjnym (11, 18). Metoda ta znalaz³a zastosowanie w diagnostyce zaka¿eñ wirusami ludzi (12), a obecnie jest rozpowszechniana równie¿ w me-dycynie weterynaryjnej (10). Wyznacznikiem iloci matrycowego DNA jest w niej liczba cykli, po których kinetyka reakcji wchodzi w fazê logarytmicznego
Zastosowanie metody real-time PCR
i systemu LightCycler
®
do wykrywania DNA
wirusa zakanego ronienia klaczy (EHV-1)
TOMASZ DZIECI¥TKOWSKI, MACIEJ PRZYBYLSKI, ANNA CHMIELEWSKA*, ANNA TUCHOLSKA*, AGNIESZKA TUROWSKA*, MARCIN BANBURA*
Katedra i Zak³ad Mikrobiologii Lekarskiej AM, ul. Cha³ubiñskiego 5, 02-004 Warszawa
*Katedra Nauk Przedklinicznych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej SGGW, ul. Ciszewskiego 8, 02-786 Warszawa Dzieci¹tkowski T., Przybylski M., Chmielewska A., Tucholska A., Turowska A., Banbura M.
Evaluation of a real-time PCR assay using the LightCycler® system for detection
of equine herpesvirus type 1 DNA Summary
Equine herpesvirus type 1 (EHV-1) is one of the major horse diseases, causing considerable worldwide losses. A variety of techniques, including nested PCR, have been used to diagnose EHV-1 infections. In this paper, a real-time PCR assay that uses non-specific SYBR Green I® fluorochrome for the detection of EHV-1
DNA is described. This method does not require post-amplification manipulations, thereby reducing the risk of cross-contamination. The assay was sensitive enough to detect EHV-1 sequences in neuronal cell cultures and also different clinical samples. The technique is specific: it was not reactive with other herpesviruses or opportunistic bacterial pathogens such as Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis and Enterococcus faecium. In comparison to virus isolation or the nested PCR used previously, the test was more sensitive and should be useful for the common diagnosis based on its specificity and rapidity.
Medycyna Wet. 2008, 64 (7) 919 wzrostu iloci produktu. Jednym z pierwszych
warian-tów techniki real-time PCR jest analiza przyrostu iloci amplikonów poprzez znakowanie DNA fluorochromem SYBR Green I, który emituje wiat³o tylko w przypad-ku zwi¹zania siê z dwuniciowym DNA. Technika ta jest prosta w zastosowaniu, lecz ze wzglêdu na brak specyficznoci wi¹zania fluorochrom-DNA bardziej podatna na b³êdy (13). Z tego te¿ powodu wymaga ana-lizy krzywych topnienia produktów (melting curves analysis), w celu okrelenia specyficznoci amplifika-cji. Wariantem real-time PCR o wiêkszej swoistoci jest reakcja z sondami typu TaqMan lub Molecular Beacon, które na koñcu 5 maj¹ fluorescencyjny znacznik (R), a na koñcu 3 wygaszacz (Q). Podczas wyd³u¿ania pro-duktu reakcji sonda ulega degradacji przez Taq poli-merazê o w³asnociach 5-egzonukleazy, w wyniku czego fluorochrom zostaje oddzielony od wygaszacza. Proces ten powoduje emisjê fluorescencji, której natê-¿enie mierzone jest w ka¿dym cyklu reakcji (8).
Celem badañ by³o opracowanie metody real-time PCR do diagnostyki zaka¿eñ koñskim herpeswirusem typu 1, okrelenie jej specyficznoci oraz porównanie jej czu³oci z tradycyjn¹ metod¹ nested PCR (6).
Materia³ i metody
Do badañ u¿yto dwóch szczepów standardowych EHV-1 (Rac-H oraz A IV) oraz izolatu terenowego Jan-E, pocho-dz¹cych z kolekcji szczepów Pracowni Wirusologii Katedry Nauk Przedklinicznych Wydzia³u Medycyny Weterynaryj-nej SGGW. Szczepy namna¿ane by³y w komórkach linii ED utrzymywanych w pod³o¿u Eaglea (WSiS Lublin) z dodat-kiem 10% p³odowej surowicy bydlêcej (Gibco). DNA eks-trahowano standardow¹ metod¹ (17), przy pomocy miesza-niny fenol : chloroform : alkohol izoamylowy, a nastêpnie precypitowano 100% etanolem. Uzyskany wysuszony osad DNA rozpuszczano w 20 µl buforu TE o pH = 8,0.
W celu amplifikacji DNA EHV-1 zastosowano parê star-terów specyficznych do genu glikoproteiny B (gB) wirusa zakanego ronienia klaczy, o sekwencji P1: 5-TCT ATT GAG TTT GCT ATG CT-3 oraz P2: 5-TCC TGG TTG TTA TTG GGT AT-3 (6). Do reakcji real-time PCR u¿yto mieszaniny amplifikacyjnej FastStart DNA Master SYBR Green Kit® (Roche Diagnostics) w objêtoci koñcowej 20 µl,
na któr¹ sk³ada³o siê po 0,5 µl ka¿dego ze starterów, 3 mM MgCl2 oraz 5 µl badanego DNA. Pierwszy etap rozpoczy-na³a denaturacja przez 10 min. w 95°C. Po cyklu wstêpnym nastêpowa³o 45 cykli obejmuj¹cych: denaturacjê 95°C 10 s, przy³¹czanie starterów 58°C 5 s i wyd³u¿anie ³añcuchów 72°C 27 s oraz analiza krzywych topnienia w temp. 65--95°C. Ca³oæ badania trwa³a ok. 55 min. i by³a prowadzona w aparacie LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics). W trakcie trwania reakcji stale analizowany by³ poziom fluorescencji wynik³y z wi¹zania siê fluorochromu SYBR Green I do am-plifikowanego dwuniciowego DNA. Nastêpnie przeprowa-dzono analizê krzywych topnienia produktów, co pozwala³o dodatkowo na ustalenie specyficznoci amplifikacji.
Do okrelenia swoistoci reakcji u¿yto DNA EHV-1 szcze-pów Rac-H, A IV oraz Jan-E. Jako kontrole ujemne wyko-rzystano DNA wyekstrahowane z niezaka¿onych linii ED oraz Vero, za za kontrole specyficznoci reakcji pos³u¿y³o
DNA izolowane z koñskiego herpeswirusa typu 2 (EHV-2), ludzkich herpeswirusów typu 1, 2, 3 i 5 oraz DNA pocho-dz¹ce z bakterii Escherichia coli, Staphylococcus epidermi-dis i Enterococcus faecium.
W celu pó³ilociowego okrelenia czu³oci metody real--time PCR przeprowadzono reakcjê z wykorzystaniem se-ryjnych rozcieñczeñ DNA wyekstrahowanego ze szczepu Rac-H w ja³owej wodzie dejonizowanej. Rozcieñczenia wyko-nano w zakresie od 100 do 105 (od 2,3 µg do 0,26 ng DNA).
Badania materia³u klinicznego przeprowadzono na gru-pie 26 próbek 6 izolatów wirusa z hodowli komórkowych (w tym 4 z hodowli neuronów mysich), 5 wymazów z b³on luzowych oraz 15 próbek leukocytów krwi obwodowej. DNA izolowano w sposób opisany powy¿ej i u¿ywano do amplifikacji metod¹ real-time PCR.
Wszystkie opisane badania prowadzono w dwukrotnych, niezale¿nych powtórzeniach.
Wyniki i omówienie
Wynik dodatni, wyra¿ony wyk³adniczym przyrostem fluorescencji, osi¹gniêto we wszystkich próbkach za-wieraj¹cych DNA szczepów standardowych EHV-1 (ryc. 1). Analiza krzywych topnienia produktów PCR wykaza³a specyficznoæ reakcji we wszystkich przypad-kach (ryc. 2). Amplifikacji nie zaobserwowano nato-miast w próbkach stanowi¹cych kontrole ujemne oraz w materia³ach pochodz¹cych z innych herpeswirusów i bakterii.
Podczas okrelania zakresu czu³oci wariant real-time PCR wykrywa³ wszystkie u¿yte rozcieñczenia wiruso-wego DNA w zakresie od 100 do 105 (ryc. 3). Jest to
przedzia³ oko³o dziesiêciokrotnie wiêkszy od uprzed-nio stosowanej metody.
W badaniu materia³ów klinicznych test real-time PCR wykry³ specyficzne sekwencje EHV-1 w 18 próbkach, które da³y tak¿e wynik dodatni w nested PCR. Dwa preparaty pochodz¹ce z warstwy leukocytarnej, okre-lone metod¹ tradycyjn¹ jako pozytywne, da³y tak¿e dodatni odczyt fluorescencji w aparacie LightCycler 2.0, lecz analiza krzywych topnienia produktów sugerowa-³a niespecyficzn¹ amplifikacjê (tab. 1).
Koñskie herpeswirusy ze wzglêdu na swe rozpo-wszechnienie i patogennoæ od dawna stanowi³y istot-ny problem w praktyce weterynaryjnej. W latach 1996-1999 dokonano w Pracowni Wirusologii Wydzia³u Me-dycyny Weterynaryjnej SGGW pierwszych identyfika-cji herpeswirusów za pomoc¹ techniki PCR (4). Czêæ sporód izolowanych wirusów okrelono wówczas jako EHV-1, przynale¿noæ innych pozostawa³a nadal nie-okrelona (4, 5). Dopiero dalsze badania z zastosowa-niem starterów specyficznych dla sekwencji EHV-2 i EHV-5 pozwoli³y na zaliczenie ich do typu 2 oraz 5 (15, 16).
Zastosowanie w diagnostyce wirusologicznej real--time PCR pozwala na istotne skrócenie czasu oczeki-wania na wynik oraz podwy¿szenie progu czu³oci me-tody (11, 18). Technika ta staje siê obecnie testem z wyboru w medycynie ludzkiej, zw³aszcza w przypad-kach neurologicznych (1).
Medycyna Wet. 2008, 64 (7) 920
Przedstawiona metoda real-time PCR do wykrywa-nia wirusa zaka-nego ronienia kla-czy jest szybsza do wykonania i bar-dziej czu³a ni¿ ty-powa reakcja ³añ-cuchowej polime-ryzacji po³¹czona z elektroforez¹ ¿elow¹. Mniejsze jest równie¿ ry-zyko przypadko-wego zanieczysz-czenia próbek ze wzglêdu na brak obróbki poampli-fikacyjnej. Jest tak¿e wysoce po-wtarzalna i wy-kazuje liniowy przedzia³ detekcji w zakresie roz-cieñczeñ od 100 do 105, co mo¿e po-móc w pó³ilocio-wym okrelaniu kopijnoci wirusa. Czu³oæ jest na tyle wysoka, ¿e pozwala na wy-krywanie DNA EHV-1 w hodow-lach zaka¿onych neuronów mysich, co by³o nie mo¿-liwe przy zasto-sowaniu nested PCR. Pewn¹ roz-bie¿noæ z meto-d¹ tradycyjn¹ sta-nowi¹ dwie prób-ki DNA izolowa-ne z leukocytów krwi obwodowej, w których real--time PCR wyka-za³ niespecyficzn¹ amplifikacjê. Re-zultat ten móg³ byæ spowodowany przez obecnoæ w wyekstrahowa-nym DNA inhibi-torów reakcji real--time PCR (lado-wych iloci
alko-Ryc. 1. Wynik reakcji real-time PCR w kierunku wykrywania wirusa zakanego ronienia klaczy. Poszczególne krzywe oznaczaj¹ DNA szczepów standardowych EHV-1 (Rac-H i A IV) oraz izolatu terenowego (Jan-E). K () kontrola ujemna reakcji: DNA izolowane z niezaka¿onej linii ED
Ryc. 2. Analiza krzywych topnienia produktów, bêd¹ca pomiarem specyficznoci reakcji, w reakcji real-time PCR wykrywaj¹cej EHV-1. Poszczególne krzywe oznaczaj¹ DNA szczepów Rac-H, A IV oraz Jan-E. K () kontrola ujemna reakcji
Ryc. 3. Badanie czu³oci metody real-time PCR w kierunku wykrywania wirusa zakanego ronienia klaczy. Poszczególne krzywe oznaczaj¹ seryjne rozcieñczenia DNA EHV-1 (szczepu Rac-H) w zakre-sie od 100 do 105. K () kontrola ujemna reakcji
Medycyna Wet. 2008, 64 (7) 921 i k b ó r p a w z a N Wynik (° )TmC Ct Nazwapróbki Wynik (° )TmC Ct o r e V Hod.neuronów3 + 92,55 34 D E Hod.neuronów4 + 92,43 35 V I A + 92,48 11 Wymaz17 + 92,21 20 E -n a J + 92,34 11 Wymaz19 + 92,33 24 H -c a R + 92,21 11 Wymaz23 + 92,41 23 H -c a R 1 + 92,31 15 Wymaz24 + 92,34 28 H -c a R 2 + 92,45 19 Wymaz8 H -c a R 3 + 92,26 23 Leukocyty7 + 92,23 36 H -c a R 4 + 92,51 27 Leukocyty402 + 92,42 22 H -c a R 5 + 92,38 31 Leukocyty404 (niesp). 88,19 o p o p m i L 2 -V H E Leukocyty407 + 92,37 29 e r y t n I c M 1 -V H H Leukocyty408 (niesp). 86,21 8 6 3 T P 2 -V H H Leukocyty420 + 92,44 31 n e ll E 3 -V H H Leukocyty422 + 92,57 30 9 6 1 D A 5 -V H H Leukocyty423 + 92,29 27 il o c . E Leukocyty430 + 92,20 29 s i d i m r e d i p e . S Leukocyty433 + 92,45 28 m u i c e a f . E Leukocyty434 + 92,47 27 1 D E a l w o d o H + 92,35 21 Leukocyty436 + 92,43 30 2 D E a l w o d o H + 92,28 25 Leukocyty437 1 w ó n o r u e n . d o H + 92,47 36 Leukocyty438 + 92,31 31 2 w ó n o r u e n . d o H + 92,42 35 Leukocyty439 + 92,48 30
Tab. 1. Zestawienie materia³ów badanych technik¹ real-time PCR w kierunku EHV-1 oraz uzyskanych wyników
Objanienia: Tm temperatura topnienia produktów reakcji; Ct numer cyklu reakcji, przy którym fluorescencja próbki osi¹gnê³a fazê logarytmicznego wzrostu; niesp. amplifikacja niespecyficzna
holu etylowego) lub te¿ przez punktow¹ mutacjê w obrêbie sekwencji docelowej. Wariant detekcji z niespecyficznym fluo-rochromem SYBR Green I jest tani i ³atwy do optymalizacji, lecz wymaga analizy krzywych top-nienia produktu jako elementu gwarantuj¹cego specyficznoæ badania. Specyficznoæ i czu³oæ metody mo¿na dodatkowo zwiêk-szyæ, wykorzystuj¹c znakowane fluorescencyjnie sondy typu TaqMan, co wi¹¿e siê jednak z dodatkowymi kosztami.
Wraz z opracowaniem testu real-time PCR do wykrywania zaka¿eñ EHV-1 medycyna wete-rynaryjna zyskuje now¹ metodê, która mo¿e znaleæ zastosowanie w diagnostyce niskokopijnych zaka¿eñ herpeswirusami koni oraz w badaniu patogenezy ich chorób. Wskazane s¹ dalsze ba-dania, które zmierzaæ bêd¹ do opracowania podobnych testów do wykrywania infekcji koñski-mi herpeswirusakoñski-mi, zw³aszcza tymi wywo³ywanymi przez EHV-2.
Pimiennictwo
1.Aberle S. W., Aberle J. H., Steininger C., Puchhammer-Stöckl E.: Quantitative real time PCR detection of varicella-zoster virus DNA in cerebrospinal fluid in patients with neurological disease. Med. Microbiol. Immu-nol. (Berl). 2005, 94, 7-12.
2.Allen G. P., Bryans J. T.: Molecular epizootiology, pathogenesis, and pro-phylaxis of equine herpesvirus-1 infections. Prog. Vet. Microbiol. Immunol. 1986, 2, 78-144.
3.Ballagi-Pordany A., Klingeborn B., Flensburg J., Belak S.: Equine herpes-virus type 1: detection of viral DNA sequences in aborted fetuses with the polymerase chain reaction. Vet. Microbiol. 1990, 22, 373-381.
4.Bañbura M., Chmielewska A., Tucholska A., Malicki K.: Test PCR w diag-nostyce wirusowego zakanego ronienia klaczy. Medycyna Wet. 1998, 54, 772-774.
5.Bañbura M., Chmielewska A., Tucholska A., Malicki K.: Wystêpowanie wi-rusa zakanego ronienia klaczy w leukocytach krwi obwodowej koni. Medy-cyna Wet. 2000, 56, 521-523.
6.Borchers K., Slater J.: A nested PCR for the detection and differentiation of EHV-1 and EHV-4. J. Virol. Methods 1993, 45, 331-336.
7.Carvalho R., Passos L. M., Martins A. S.: Development of a differential multiplex PCR assay for equine herpesvirus 1 and 4 as a diagnostic tool. J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health 2000, 47, 351-359. 8.Clementi M.: Quantitative Molecular Analysis of Virus Expression and
Re-plication. J. Clin. Mic. 2000, 38, 2030-2036.
9.Davison A., Eberle R., Hayward G. S., McGeoch D. J., Minson A. C., Pel-let P. E.: Herpesviruses, [w:] Faquet C. M., Mayo M. A., Maniloff J., Dessel-berger U., Ball L. A. (red.): Virus taxonomy classification and nomencla-ture of viruses. Eighth report of ICTV. Elsevier Academic Press, San Diego 2005, 193-212.
10.Diallo I. S., Hewitson G., Wright L. L., Kelly M. A., Rodwell B. J., Cor-ney B. G.: Multiplex real-time PCR for the detection and differentiation of equid herpesvirus 1 (EHV-1) and equid herpesvirus 4 (EHV-4). Vet. Micro-biol. 2007, 123, 93-103.
11.Dzieci¹tkowski T., Przybylski M., Tomaszewska A., Rokicka M., £uczak M.: Comparison of two methods used for monitoring low-copy cytomegalovirus infection in a patient with chronic myeloid leukemia after unrelated umbili-cal cord blood transplantation. Arch. Immunol. Ther. Exp. 2007, 55, 199--203.
12.Espy M. J., Uhl J. R., Mitchell P. S., Thorvilson J. N., Svien K. A., Wold A. D., Smith T. F.: Diagnosis of herpes simplex virus infections in the clinical labo-ratory by LightCycler PCR. J. Clin. Microbiol. 2000, 38, 795-799. 13.Mackay I. M., Arden K. E., Nitsche A.: Real-time PCR in virology. Nucl.
Acids Res. 2002, 30, 1292-1305.
14.Rola J., ¯mudziñski J.: Herpeswirus koñski typ 1 (EHV-1) przyczyn¹ poro-nieñ u klaczy w Polsce. Medycyna Wet. 1997, 53, 268-269.
15.Ruszczyk A.: Genetyczna zmiennoæ szczepów EHV-2 wyizolowanych od koni w Polsce. Medycyna Wet. 2003, 59, 620-622.
16.Ruszczyk A., Chmielewska A., Tucholska A., Bañbura M. W.: Izolacja i iden-tyfikacja herpeswirusa koni typu 2 (EHV-2). Medycyna Wet. 2001, 57, 603--606.
17.Strauss W. M.: Preparation of genomic DNA fom mammalian tissue, [w:] Ausubel F. M., Brent R., Kingston R. E., Moore D. D., Seidman J. G., Smith J. A., Struhl K. (red.): Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York 1992, 2.2.1-2.2.3. 18.Watzinger F., Suda M., Preuner S., Baumgartinger R., Ebner K., Baskova L., Niesters H. G., Lawitschka A., Lion T.: Real-time quantitative PCR assays for detection and monitoring of pathogenic human viruses in immunosup-pressed pediatric patients. J. Clin. Microbiol. 2004, 42, 5189-5198. Adres autora: dr Tomasz Dzieci¹tkowski, ul. Cha³ubiñskiego 5, 02-004 Warszawa; e-mail: dzieciatkowski@wp.pl
