Widok Uprzepuszczelnienie błony mitochondrialnej podczas stresu oksydacyjnego.

(1)

K

_{PROBLEMY NAUK BIOLOGICZNYCH}

osmos

Panu Profesorowi Lechowi Wojtczakowi z wyrazami podziwu dla osiągnięć naukowych

Ew a Le n a r t o w i c z, Jo l a n t a Wu d a r c z y k

Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN Pasteura 3, 02-093 Warszawa

Numer 1 (234) Strony 97-104

P o l s k i e T o w a r z y s t w o P r z y r o d n i k ó w i m . K o p e r n i k a

UPRZEPUSZCZALNIENIE BŁONY MITOCHONDRIALNEJ PODCZAS STRESU OKSYDACYJNEGO

WSTĘP Stres oksydacyjny jest stanem, w którym materiał biologiczny ulega uszkodzeniom przez reaktywne postacie tlenu. Nadmiar reaktyw nych postaci tlenu występuje przy podwyższo nej ich generacji (hyperoksja, niedotlenienie, reperfuzja po niedokrwieniu, napromieniowa nie) lub ograniczonego ich usuwania (obniżenie aktywności enzymów katalizujących ich meta bolizm, niedomiar biologicznych wymiataczy rodników lub glutationu).

Jednym z najgroźniejszych efektów stresu oksydacyjnego w komórce jest niespecyficzne uprzepuszczalnienie wewnętrznej błony mito chondrialnej. Nieprzepuszczalność tej błony dla kationów jest warunkiem wytwarzania gradien tu protonów po obu jej stronach. Tak wytworzo ny potencjał elektrochemiczny stanowi formę zachowania energii niezbędną dla syntezy ATP.

Podczas stresu oksydacyjnego uprzepusz czalnienie błony mitochondrialnej może nastą pić dwiema drogami, przez otworzenie specyfi cznych kanałów i przez per oksydację lipidów błonowych. Głównym mechanizmem jest otwo rzenie kanałów o średnicy około 3 nm przepusz czających cząsteczki do 1,5 kDa (Gu n t e r i Pf e

i f f e r 1990, Zo r a t t i i Sz a b o 1995). Kanały te

zostały po raz pierwszy zauważone w 1979 roku przez Hu n t e r ai Ha w o r t h a. Dziesięć lat później metodą elektrofizjologiczną (patch clamping) zaobserwowano ich ogromne przewodnictwo dochodzące do 1,5 nS i nazwano je mitochon- drialnymi megakanałami (Ki n a l l y i współaut.

1989). Budowa ich nie jest dotychczas wyjaś niona. Przypuszczalnie składają się one, podo bnie jak receptory diazepinowe, z dimerów za wierających porynę (zależny od potencjału ka nał w błonie zewnętrznej), translokazę nukleo

tydów adeninowych oraz białko o masie 18-20 kDa (prawdopodobnie cyklofilinę). Jednak prze wodnictwo charakterystyczne dla megakana- łów wykryto również u mutantów drożdży po zbawionych translokazy nukleotydów adenino wych (Lo h r e t i współaut. 1996).

Otworzenie megakanałów następuje w wy niku współdziałania szeregu czynników (tab. 1).

Niezbędne jest spełnienie trzech warunków: 1) napływ jonów wapnia do mitochondriów, 2)

obniżenie potencjału elektrochemicznego błony mitochondrialnej, 3) związanie z błoną mito chondriów cyklofiliny, białka z matriks mito chondrialnej (Zo r a t t i i Sz a b o 1995, Be r n a r d i

1996). Podczas stresu oksydacyjnego czynni kiem stymulującym otworzenie megakanałów jest utlenienie mitochondrialnych nukleotydów nikotynamidowych i grup -SH. Źródłem tych wszystkich zmian są reakcje inicjowane przez reaktywne formy tlenu (Ca s t i l h o i współaut.

1995a).

Tabela 1. Efektoiy megakanałów mitochondrialnych

Otwierające Zamykające

Deenergizacja błony potencjał elektrochemiczny

Napływ Ca2+ do matriks zakwaszenie do pH <6 ,9 Utlenianie lub

sieciowanie grup -SH ADP i ATP w matriks

Utlenianie NADPH i potencjał powierzchniowy

NADH błony

Związanie cyklofiliny z Mg2+, Mn2+, Sr2+

błoną cyklosporyna A

O tworzenie m egakanałów prowadzi do spadku mitochondrialnego potencjału elektro chemicznego (co uniemożliwia syntezę ATP)

(2)

98 Ew a Le n a r t o w ic z, Jo l a n t a Wu d a r c z y k

oraz do wypływu z mitochondriów jonów, nu kleotydów, glutationu i niektórych białek (I n o u e i współaut. 1993). Wydaje się, że zasadniczym elementem zagrażającym życiu komórek w tych warunkach jest utrata A T P ( M e h e n d a l e i współ aut. 1994).

Po uprzepuszczalnieniu błony mitochon driów w komórce, ze względu na różnicę ciśnień osmotycznych między mitochondriami i cyto- plazmą następuje napływ wody do mitochon driów, co powoduje ich pęcznienie. Izolowane mitochondria po otworzeniu megakanałów rów nież mogą pęcznieć na skutek napływu wody i drobnocząsteczkowych składników medium. Tracą one wówczas gęstość optyczną (następuje spadek rozproszenia światła), co jest wykorzy stywane do pomiaru frakcji mitochondriów ule gających uprzepuszczalnieniu (rys. 1).

W normalnych warunkach fizjologicznych megakanały pozostają zamknięte (N ie m in e n i współaut. 1995). Otworzeniu ich przeciwdziała wysoki potencjał błonowy. Uprzepuszczalnienie błony mitochondrialnej jest hamowane ponad to przez zakwaszenie matriks mitochondrialnej, ADP i jony Mg2+ ( B e r n a r d i 1996). Najsilniej szym farmakologicznym inhibitorem megaka nałów, działającym w stężeniach submikromo- larnych, jest cyklosporyna A, znany lek immu- nosupresyjny. Hamuje ona przewodnictwo me gakanałów wiążąc się z mitochondrialną cyklo- filiną ( N i c o l l i i współaut. 1996). W izolowanych

Rys. 1. Pęcznienie izolowanych mitochondriów

wy-o,

maga Ca i czynnika utleniającego. Mitochondria inkubowano z substratami oddechowymi (glutami nianem i jabłczanem) i, gdzie pokazano, z 50 ąM CaCl2 i 100 pM butylowanym nadtlenkiem wodoru.

mitochondriach megakanały otworzone pod wpływem stresu oksydacyjnego mogą być za mknięte przez dodatek EGTA (chelatującego Ca2+) i ditiotreitolu (redukującego disulfidy) ( V a l l e i współaut. 1993).

OTWIERANIE MEGAKANAŁÓW JEST PROCESEM ZALEŻNYM OD WAPNIA Warunkiem otworzenia megakanałów mito-

chondrialnych jest napływ Ca + do mitochon driów ( G u n t e r i P f e i f f e r 1990, C h e r n y a k i współaut. 1995). Jednakże izolowane mito chondria nie pęcznieją pod wpływem dodatku Ca2+ w mikromolarnych stężeniach, gdyż jest on szybko wyprowadzany na zewnątrz przy jed noczesnym napływie protonów, które zakwa szają matriks mitochondrialną, co przeciwdzia ła otwieraniu megakanałów. Dopiero zatrzyma nie Ca2+ w mitochondriach przez kilka minut prowadzi do uprzepuszczalnienia błony mito chondrialnej, co sugeruje, że megakanały są w tym czasie wytwarzane.

Przewodnictwo megakanałów zależy od po tencjału błonowego mitochondriów ( B e r n a r d i

1996). W normalnych warankach fizjologicz nych, przy potencjale 180-200 mV, kanały po zostają zamknięte (N ie m in e n i współaut. 1995). Dopiero depolaryzacja błony wprowadza wa runki sprzyjające ich otworzeniu. Wrażliwość megakanałów na spadek potencjału błonowego jest podwyższana przez wiele różnych czynni

ków, wśród których najistotniejszym jest wzrost stężenia Ca2+ w mitochondriach. Oznacza to, że przy tym samym potencjale frakcja pęcznieją cych mitochondriów wzrasta wraz ze stężeniem Ca2+ ( P e t r o n i l l i i współaut. 1993). Stymulato rem otwierania megakanałów mitochondrialnych jest jedynie Ca2+ zakumulowany w e wnątrz mitochondriów, podczas gdy jego dzia łanie od zewnętrz jest, przeciwnie, hamujące, podobnie jak innych kationów dwuwartościo- wych ( B e r n a r d i i współaut. 1993).

Dodatek Ca2+ do mitochondriów uaktywnia procesy utleniające przez stymulację produkcji reaktywnych form tlenu ( K o w a l t o w s k i i współ aut. 1996). Jednocześnie wrażliwość

mitochon-O i

drialnych megakanałów na Ca ulega addy- tywnemu podwyższeniu przez utlenienie lub sieciowanie krytycznego ditiolu, przez utlenie nie nukleotydów nikotynamidowych oraz przez przyłączenie cyklofiliny do błony mitochon drialnej (C h e r n y a k i B e r n a r d i 1996, C o n n e r n i H a l e s t r a p 1994). W obecności Ca2+ w stęże niach mikromolarnych szereg różnych związ

(3)

ków indukuje uprzepuszczalnienie błony mitochondrialnej. Pod względem fizjologicznym naj ważniejszymi z nich są fosforan i długołańcu- chowe kwasy tłuszczowe oraz ich estry z CoA (Pe t r o n i l l i i współaut. 1993, Be r n a r d i i współ

aut. 1994). Zawartość wolnych kwasów tłusz czowych w mitochondriach wzrasta podczas stresu oksydacyjnego (Br o e k e m e i e r i Pf e i f f e r

1995). Czynnikiem stymulującym otworzenie megakanałów jest ich ujemny ładunek powie rzchniowy. Wrażliwość megakanałów na Ca2+ jest obniżana przez sperminę i inne poliaminy, związki o dodatnim ładunku powierzchniowym (La p i d u s i So k o l o v e 1994).

Na szczególną uwagę zasługuje otwieranie megakanałów mitochondrialnych przez ligandy translokazy nukleotydów adeninowych stabili zujące jej konformację „c”, jak na przykład karboksyatraktylozyd. Przypuszczalnie jest to związane ze spadkiem ładunku powierzchnio wego błony mitochondrialnej przy przejściu translokazy z konformacji „m” do „c” (Be r n a r d i

i współaut. 1994). W komórce konformacja „m” zamykająca m egakanały je s t utrzymywana przez wiązanie wewnątrzmitochondrialnego ADP. Wzrost stężenia Ca2+ osłabia to wiązanie i prowadzi do wytworzenia konformacji „c” (La

p i d u s i So k o l o w e 1994). W mitochondriach

wątroby może to być związane z zahamowaniem pirofosfatazy przez Ca2+ i nagromadzeniem pirofosforanu, który reagując z translokazą po woduje wypływ ADP ( Gr i f f i t h s i Ha l e s t r a p

1993).

Od kilku lat wiadomo, że translokaza nu kleotydów adeninowych może zmieniać swoje własności przekształcając się z antyportara ATP/ADP w kanał o obniżonej specyficzności (Di e r k s i współaut. 1990). Co więcej, interakcja

Ca2+ z kardiolipiną związaną z translokazą otwiera kanał kationowy o własnościach podo bnych do megakanału (Br u s t o v e t s k y i Kl i n-

g e n b e r g 1996). Jednakże udział translokazy w

wytwarzaniu megakanałów może być udowo dniony dopiero po ich rekonstytuuj i.

UTLENIENIE GRUP -SH STYMULUJE OTWORZENIE MEGAKANAŁÓW Wrażliwość megakanałów na depolaryzację

błony w obecności Ca2+jest podwyższana przez utlenienie lub sieciowanie krytycznego ditiolu (Ch e r n y a k i Be r n a r d i 1996). Wytworzenie di-

sulfidu otwiera megakanały w 50% mitochon driów przy obniżeniu potencjału do 160 mV, podczas gdy zachowany ditiol chroni przed ich otwieraniem nawet przy potencjale obniżonym do 130 mV ( Co s t a n t i n i i współaut. 1996).

Wzrost wrażliwości megakanałów na spadek potencjału obserwowano w izolowanych m ito chondriach przy utlenieniu grup -SH diami- dem lub menadionem i przy wytworzeniu mer- kaptydów z arseninem lub tlenkiem fenyloar- syny (Pe t r o n i l l ii współaut. 1994). Uprzepusz-

czalnieniu błony mitochondrialnej w obecności tych związków zapobiegały ditiotreitol (reduku jący disulfidy), monobromobiman i N-etyloma-

leimid (związki reagujące z grupami -SH), trifluoperazina (inhibitor fosfolipazy o własnoś ciach przeciwdziałających utlenieniu grup -SH) oraz butylohydroksytoluen (wymiatacz rodni ków tlenowych) (Co s t a n t i n i i współaut. 1996).

Traktowanie związkami utleniającymi grupy -SH nie tylko in vitro ale również in vivo powo dowało wzrost wrażliwości mitochondriów za równo na deenergizację, jak i na Ca2+ (Sa x e n a i

współaut. 1995). Podczas stresu oksydacyjnego in vivo błona mitochondrialna może być chro niona przed uprzepuszczalnieniem przez w i taminę E oraz przez mitochondrialne białka szoku cieplnego, które są wówczas indukowa

ne (Ha r a m a k i i współaut. 1995, Po l l a i współ

aut. 1996).

o ,

Podobnie jak stężenie Ca , również reakcje grup ditiolowych translokazy nukleotydów ade ninowych wpływają na jej konformację (Di e r k s

i współaut. 1990). Co więcej, modyfikacja ditioli tego transportera jonami Hg2+ prowadzi do za hamowania antyportu ATP /ADP i wypływu tych nukleotydów.

Główną drogą utleniania komórkowych di tioli jest reakcja wymiany z utlenionym glutationem (Le n a r t o w i c z i współaut. 1996). W ba

daniach Ch e r n y a k ai Be r n a r d i e g o (1996) szyb

kość pęcznienia mitochondriów w obecności Ca2+ i nadtlenków spadała aż o 80% po usunię ciu glutationu drogą koniugacji z l-chloro-2,4- -dinitrobenzenem. Ditiole mogą być również utleniane bezpośrednio przez reaktywne formy tlenu i metale przejściowe do rodników tiylo- wych S', które asocjują wytwarzając disulfidy. Podczas stresu oksydacyjnego w komórkach szczególnie groźny jest nadtlenoazotyn, ONO2 , który reaguje z grupami -SH wytwarzając grupy -SNO i SNO2 (Pa c k e r i Mu r p h y 1995). Stymu

lacja generacji nadtlenoazotynu w mitochon driach przez podanie jego prekursorów już po kilku minutach powodowała uprzepuszczalnie nie ich błony.

In vivo mitochondrialne grupy -SH ulegające utlenieniu są redukowane przez tioredoksynę, białko o masie 12 kDa zawierające reaktywny ditiol/disulfid w centrum aktywnym (Le n a r t o

(4)

w i c z i współaut. 1996). Zachowanie normalnej

objętości izolowanych mitochondriów w warun kach utleniających jest skorelowane z utrzyma- aniem redukcji białkowych grup -SH i z aktyw

nością redukującą disulfidy ( Wu d a r c z y k i

współaut. 1996). Wskazuje to na udział tioredo- ksyny w ochronie mitochondriów przed otwo rzeniem megakanałów.

UTLENIENIE NUKLEOTYDÓW NIKOTYNAMIDOWYCH JEST OSOBNYM STYMULATOREM OTWIERANIA MEGAKANAŁÓW

Uprzepuszczalnienie błony mitochondrial nej jest związane z jej deenergizacją, która po woduje utlenienie nukleotydów nikotynamidowych w mitochondriach. Jednakże utlenienie tych nukleotydów jest nie tylko konsekwencją ale również czynnikiem indukującym otworze nie megakanałów niezależnie od utlenienia kry tycznego ditiolu i glutationu ( Co s t a n t i n i i

współaut. 1996).

W komórce utlenienie mitochondrialnych nukleotydów nikotynamidowych jest nastę pstwem wzrostu stężeń reaktywnych postaci tlenu. Stan ten jest inicjowany przez podwy ższoną generację anionorodnika ponadtlenko- wego, O", produkowanego głównie w mitochon- drialnym łańcuchu oddechowym (Ba r t o s z

1995). Generacja tego rodnika zależy od stęże nia tlenu i od redukcji związków reagujących z nim. Dlatego wzrasta ona przy redukcji kompo nent łańcucha oddechowego i hyperoksji, a zwłaszcza przy natlenieniu po niedotlenieniu. Aniono rodnik ponadtlenkowy ulega dysmutacji do nadtlenku wodoru, H2O2, który jest reduko wany przez peroksydazę glutationową w reakcji z glutationem:

2 GSH + H2O2- 4 GSSG + 2 H2O

Utleniony glutation jest redukowany ko sztem NADPH w reakcji reduktazy glutationo- wej przy jednoczesnej alkalizacji środowiska:

GSSG + H+ + NADPH -> 2 GSH + NADP+ W mitochondriach NADP+ jest redukowany głównie przez NADH w reakcji zależnej od ener gii transhydrogenacji nukleotydów nikotynami dowych. Jednakże utleniony glutation hamuje tę reakcję i, w konsekwencji, podczas stresu oksydacyjnego NADPH nie może zostać odtwo rzony (Pe r s s o n i Ry d s t r ó m 1987). Wpływa to na

utlenienie NADH drogą transhydrogenacji nie zależnej od energii, która wówczas funkcjonuje normalnie. Reakcje prowadzące do utlenienia nukleotydów nikotynamidowych i białkowych ditioli są przedstawione na rysunku 2.

W izolowanych mitochondriach możliwe jest utlenienie nukleotydów nikotynam idowych przy zachowaniu pełnej redukcji glutationu. Stan ten wprowadzano stosując acetooctan, który utlenia NADH w reakcji dehydrogenazy p-hydroksymaślanowej, albo deenergizując

mi-Rys. 2. Reakcje prowadzące do utle nienia mitochondrialnych nukleoty dów nikotynamidowych i białko wych ditioli.

(5)

tochondria protonoforem ( Co s t a n t i n i i współ

aut. 1996). W obu przypadkach następowało podwyższenie progowego potencjału błonowego dla uprzepuszczalnienia błony mitochondrial nej. W obecności protonoforu zmianie tej prze ciwdziałał rotenon, inhibitor dehydrogenazy NADH, zapobiegający utlenieniu tego nukleoty- du. Otworzenie megakanałów przez utlenienie nukleotydów nikotynamidowych nie było ha mowane przez czynniki redukujące disulfidy, a zatem nie było rezultatem utlenienia grup -SH.

Utrzymanie redukcji nukleotydów niko tynamidowych podczas stresu oksydacyjnego zależy od utlenianych substratów. Redukcja tych nukleotydów jest znacznie wyższa pod czas utleniania bursztynianu redukującego NAD+ przez odwrotny transport elektronów niż przy substratach redukujących NAD+ bez pośrednio (Go g w a d z e i współaut. 1996). W ten

sposób substraty oddechowe mogą wpływać na własności błony mitochondrialnej podczas stresu oksydacyjnego w komórce.

UPRZEPUSZCZALNIENIE SPECYFICZNE DLA KATIONÓW Utlenienie nukleotydów nikotynamidowych

początkowo prowadzi do uprzepuszczalnienia błony mitochondrialnej specyficznego dla katio nów, mierzonego najczęściej przez wypływ Ca2+. Nie dochodzi wówczas do deenergizacji mito- chondriów ani do ich pęcznienia (Sc h l e g e l i

współaut. 1992). Wypływ Ca2+ jest hamowany przez cyklosporynę A, podobnie jak megakanały i również przez ditiotreitol, co sugeruje udział utlenienia grup -SH w tym procesie. Sc h w e i z e r

i Ri c h t e r (1996) zaobserwowali, że NAD+ ulega

hydrolizie stymulowanej przez nadtlenoazotyn, rodnik aktywnie reagujący z grupami -SH. Hy droliza NAD+ jest hamowana przez cyklospoiy- nę A, ATP i ditiotreitol. Powstała ADP-iyboza jest wiązana przez specyficzną transferazę z białkami błony mitochondrialnej, co indukuje jej uprzepuszczalnienie dla Ca2+ (Sc h w e i z e r i

współaut. 1993). Wypływ Ca2+ z mitochondriów jest hamowany przez witaminę E, biologiczny antyoksydant (Gu i d o u x i współaut. 1993). Na

stępnym kationem po Ca2+, który wypływa z mitochondriów w okresie poprzedzającym pęcz

nienie jest Mg2+ (Ri l e y i Pf e i f f e r 1985). Cykli-

zacja Ca2+ przez błonę mitochondrialną powo duje jej deenergizację, ponieważ Ca2+ wchodzi do mitochondriów elektroforetycznie a wycho dzi przez elektroneutralną wymianę z Na+ lub H+. Deenergizacja błony w obecności kilku- mikromolarnego stężenia Ca2+ prowadzi do otworzenia megakanałów.

Uprzepuszczalnianie błony mitochondrialnej dla Ca2+ drogą hydrolizy NAD+ było obserwowa ne w kilku pracowniach, jednakże mechanizm ten nie jest powszechnie akceptowany. Ya m a m o

t oi Fa r b e r (1992) nie zauważyli hydrolizy NAD+

podczas stresu oksydacyjnego w hepatocytach a No v g o r o d o v i Gu d z (1996) przypisują specy

ficzne uprzepuszczalnienie błony mitochon drialnej dla Ca2+ specjalnemu stanowi megaka nałów, w którym są one przepuszczalne jedynie dla H+, co deenergizuje błonę i pozwala na wypływ Ca2+. Co więcej, Re e d i Sa v a g e (1995)

zauważyli, że również glutation, podobnie jak Ca2+, może wypływać z mitochondriów w czasie poprzedzającym ich intensywne pęcznienie.

OTWIERANIE MEGAKANAŁÓW WYMAGA INTERAKCJI Z CYKLOFILINĄ Cyklofilina jest izomerazą cis-trans pepty-

dyloprolinową. Aktywność ta jest hamowana przez cyklosporynę A. Mitochondria zawierają specyficzną izoformę cyklofiliny o masie 18,5 kDa w stężeniu około 50 pmoli/mg białka (Con-

n e r n i Ha l e s t r a p 1996). Pod wpływem czynni

ków utleniających lub sieciujących grupy -SH białko to wiąże się do translokazy nukleotydów adeninowych w wewnętrznej błonie mitochon

drialnej tracąc jednocześnie swoją aktywność enzymatyczną (Co n n e r n i Ha l e s t r a p 1994). To

wiązanie stymuluje otworzenie megakanałów przez podwyższenie ich wrażliwości na Ca2+. Odłączenie cyklofiliny od błony mitochondrial nej zamyka megakanały. Cyklofilina oddysocjo- wuje od błony pod wpływem zakwaszenia i w wyniku interakcji z cyklosporyną A (Ni c o l l i i

współaut. 1996).

MEGAKANAŁY MITOCHONDRIALNE BADANE W Uprzepuszczalnienie błony mitochondrial nej w pojedynczych hepatocytach było obserwo wane przez Ni e m i n e n i współautorów (1995) z

zastosowaniem sond fluorescencyjnych

(kalcei-KOMÓRKACH I PERFUNDOWANYCH ORGANACH ny i metylowanej rodaminy) i mikroskopu kon- fokalnego. W normalnych warunkach fizjologi cznych kalceina znakowała jedynie cytoplazmę. Po wprowadzeniu stresu oksydacyjnego przez

(6)

dodatek nadtlenku wodoru kalceina wypełniała szybko mitochondria, co było dowodem uprzepuszczalnienia ich błony. Rodamina znakowała mitochondria zależnie od polaryzacji ich błony. Wypływała ona z mitochondriów podczas napły wu kalceiny, co wskazywało na depolaryzację błony mitochondrialnej po otworzeniu megaka- nałów. Uprzepuszczalnienie błony mitochon drialnej w hepatocytach pod wpływem stresu oksydacyjnego prowadziło do śmierci tych ko mórek. Zarówno uprzepuszczalnieniu błony mitochondrialnej, jak i śmierci hepatocytów w tych warunkach zapobiegała trifluoperazina, inhibitor fosfolipazy o własnościach przeciw działających utlenianiu grup -SH (Pe r e i r a i

współaut. 1992).

W perfundowanym sercu uprzepuszczalnie nie błony mitochondrialnej badano przez po

miar napływu do mitochondriów znakowanej izotopowo dezoksyglukozy (Gr i f f i t h s i Ha l e-

STRAP 1995). Zaobserwowano, że dezoksygluko-

za nie wnikała do mitochondriów podczas is- chemii, natomiast wnikała w czasie następują cej po niej reoksygenacji. Przy reperfuzji serca mitochondria pęczniały, ulegały deenergizacji i następował wypływ z nich glutationu, co świad czyło o otwieraniu megakanałów. Zmianom tym przeciwdziałały witamina E (antyoksydant bio logiczny), kwas dihydroliponowy (redukujący tioredoksynę) oraz cynk w stężeniach ponad- fizjologicznych (przeciwdziałający utlenieniu grup -SH) (Po w e l l i współaut. 1994, Ha r a m a k i

i współaut. 1995). Dane te sugerują, że czynni kiem decydującym o uprzepuszczalnieniu bło ny mitochondrialnej podczas stresu oksydacyj nego w komórce jest utlenienie grup -SH.

ZNACZENIE FIZJOLOGICZNE MEGAKANAŁÓW Fizjologiczna rola megakanałów mitochon-

drialnych nie jest dotychczas wyjaśniona. W y suwane dotychczas hipotezy wiąż^ funkcję me gakanałów z regulacj ą poziomu Ca + w komórce (Gu n t e ri Pf e i f f e r 1990, Be r n a r d ii Pe t r o n i l l i

1996) oraz z eliminacją komórek produkują cych nadmiar reaktywnych postaci tlenu (Sk u-

LACHEV 1996).

Podczas stresu oksydacyjnego w wyniku ut lenienia komórkowych grup -SH dochodzi do znacznego wzrostu stężenia Ca2+ w cytopla- zmie, co powoduje różne zaburzenia metabo liczne. Są one łagodzone przez mitochondria, których uniporter wprowadzający Ca2+ do ma triks jest aktywowany przy podwyższeniu stęże nia tego kationu (Ka s p a r i n s k y i Vin o g r a d o v

1996). W mitochondriach Ca2+ jest wiązany z białkami i anionami i dopiero po wysyceniu miejsc wiążących następuje wzrost jego stęże nia. Po obniżeniu stężenia Ca2+ wypływ je^o z mitochondriów na antyporterach Na+/Ca + i H+/Ca2+jest powolny i wymaga dużego nakła

du energii. W tej sytuacji uprzepuszczalnienie błony mitochondrialnej dla Ca + pozwala na szybki jego wypływ bez wydatku energetyczne go. Otworzenie megakanałów znosi potencjał błonowy, co zapobiega dalszemu napływowi Ca2+ do matriks. Po usunięciu Ca2+ następuje zamknięcie megakanałów i repolaryzacja błony mitochondrialnej.

Ostatnio Sk u l a c h e v (1996) wysunął intere

sującą hipotezę o roli megakanałów w usuwa niu komórek produkujących nadmiar reaktyw nych postaci tlenu. Otworzenie megakanałów obniża produkcję anionorodnika ponadtlenko- wego przez wzrost zużycia tlenu i utlenienie komponent łańcucha oddechowego. Mitochon dria gromadzące reaktywne postacie tlenu mo gą ulegać degradacji, gdyż synteza i import białek zależą od potencjału błonowego. Pęcznie nie mitochondriów prowadzi do rozerwania ich zewnętrznej błony i wypływu z przestrzeni mię- dzybłonowej do cytoplazmy białka indukujące go apoptozę komórki.

u p r z e p u s z c z a l n i e n i e p o w o d o w a n e p r z e z p e r o k s y d a c j ę b ł o n y

W obecności metali przejściowych, takich jak Fe2+ i Cu1+, lipidy i białka błony mitochon

drialnej mogą ulegać peroksydacji. Proces ten nie wymaga obecności Ca2+, ale jest przez ten kation stymulowany ze względu na wzrost pro dukcji rodników tlenowych (Ca r i n i i współaut.

1992). Na skutek peroksydacji błona mitochondrialna traci część białek i lipidów co wpływa na destabilizację jej struktury i wzrost przepusz czalności. Zależnie od stopnia peroksydacji, błona staje się przepuszczalna tylko dla katio

nów lub również dla metabolitów i niektórych białek (Ca r i n i i współaut. 1992, He r m e s- Li m a i

współaut. 1995).

Uprzepuszczalnienie błony mitochondrial nej wywołane przez peroksydację i otworzenie megakanałów może być łatwo rozróżnione, gdyż tylko to drugie jest hamowane przez cyklospo- rynę A. W przeciwieństwie do megakanałów uprzepuszczalnienie powodowane peroksyda- cją jest hamowane przez chelatory Fe2+ i wra żliwe na redukcję koenzymu Q przez

(7)

burszty-nian ( C a s t i l h o i współaut. 1995b). Co więcej, niezbędnym warunkiem dla intensywnej peroksydacji lipidów w mitochondriach jest utlenie nie CoQ9 (N o a c k i współaut. 1994). In vivo mitochondrialna peroksydacja lipidów jest sty mulowana przez niedobór cynku w diecie ( B u r k e i F e n t o n 1985).

Uprzepuszczalnienie w wyniku peroksydacji jest nieodwracalne, podczas gdy megakanały

2+

można zamknąć stosując chelatory Ca i czyn niki redukujące ( K o w a l t o w s k i i w spółaut.

1996). Niezależnie od mechanizmu wywołujące go uprzepuszczalnienie błony mitochondrialnej elementem zagrażającym życiu komórek jest wówczas deenergizacja mitochondriów i utrata ATP (C a r in i i współaut. 1992, M e h e n d a l e i współaut. 1994).

MITOCHONDRIAL MEMBRANE PERMEABILITY TRANSITION DURING OXIDATIVE STRESS S u m m a ry

Increased concentration of reactive oxygen species pro motes the permeability of the inner mitochondrial mem brane for ions and small solutes. This membrane transition is stimulated by influx o f Ca2+ to mitochondria, the oxida

tion o f mitochondrial -SH groups and nicotinamide nucle otides as well as by binding of cyclophilin, a matrix protein to the mitochondrial membrane. The mechanisms inducing the permeability and its physiological role Eire discussed.

LITERATURA Ba r t o s zG., 1995. Druga twarz tlenu. Warszawa, PWN.

Be r n a r d i, P., 1996. The permeability transition pore. Control points o f a cyclosporin A-sensitive mitochondrial chan nel involved in cell death. Biochim. Biophys. Acta 1275, 5-9.

Bernard iP., Br o e k e m e ie rK. M., Pf e iff e rD. R., 1994. Recent

progress on regulation o f the mitochondrial permeability transition pore; a cyclosporin-sensitive pore in the inner mitochondrial membrane. J. Bioenerg. Biomembr. 26, 509-517.

Bernard i P., Pe tr o n illiV ., 1996. The permeability transition pore as a mitochondrial calcium release channel: critical appraisal. J. Bioenerg. Biomembr. 28, 131-138.

Bernard i P., Pe r o n e se P., Pe tr o n illi V., 1993. Modulation o f the mitochondrial cyclosporin A-sertsitive permeability transition pore. J. Biol. Chem. 268, 1005-1010.

Br o e k e m e ie r K. M., Pfe iff e r D. R., 1995. Inhibition o f the mitochondrial permeability transition by cyclosporin A during long time fram e experiments: Relationship be tween pore opening and the activity o f mitochondrial phospholipases. Biochemistry 34, 16440-16449.

Br u s to v e tsk y N., Klin g e n b e r g M., 1996. Mitochondrial

ADP/ATP carrier can be reversibly converted into a large channel by Ca2+. Biochemstry 35, 8483-8488.

BurkeJ. P., Fento nM. R., 1985. Effect o f zinc-deficient diet on lipid peroxidation in liver and tumor subcellular membranes. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 179, 187-191.

Ca r in i R., Pa r o l a M., Dia n zan i M. U., Alb a n o E., 1992.

Mitochondrial damage and its role in causing hepatocyte injury during stimulation o f lipid peroxidation by iron nitriloacetate. Arch. Biochem. Biophys. 297, 110-118.

Castilh oR. F., Ko w a lto w sk iA. Lj., Me in ic k eA. R., Be charam

E. J., Ve r c e siA. E., 1995a. Permeabilization o f the inner mitochondrial membrane by Ca2+ ions is stimulated by t-butylhydroperoxide and mediated by reactive oxygen species generated by mitochondria. Free Rad. Biol. Med. 18, 479-486.

Castilh oR. F., Kow a lto w sk iA. J., Me in ick eA. R., Ve r c e siA.

E., 1995b. Oxidative damage o f mitochondria induced by Fe(II)citrate or t-butyl hydroperoxide in the presence o f Ca2+: effect o f coenzyme Q redox state. Free Rad. Biol. Med. 18, 55-59.

Chern yak B. V., Be r n ar d i P., 1996. The mitochondrial per

meability transition pore is modulated by oxidative agents through both pyridine nucleotides and gluta thione at two separate sites. Eur. J. Biochem. 238, 623-630.

Ch e r n ya k B. V., De d o v V. N., Ch e r n ya k V. Ya., 1995.

Ca2^-triggered membrane permeability transition in deenergized mitochondriafromrat liver. FEBS Lett. 365, 75-78.

Co n n e r nC. P., Ha le s tr a p A. P., 1994. Recruitment o f mito

chondrial cyclophilin to the mitochondrial inner mem brane under conditions o f oxidative stress that enhance the opening o f a calcium-sensitive non-specific channel. Biochem. J. 302, 321-324.

Co n n e r nC. P., Ha le s tr a pA. P., 1996. Chaotropic agents and increased matrix volume enhance binding o f mitochon drial cyclophilin to the inner mitochondrial membrane and sensitize the mitochondrial permeability transition to [Ca2+], Biochemistry 35, 8172-8180.

Co s ta n tin i P., Ch e r n ya k B. V., Pe tr o n illi V., Ber n ar d i P., 1996. Modulation o f the mitochondrial permeability transition pore by pyridine nucleotides and dithiol oxi dation at two separate sites. J. B iol Chem. 271, 6746- 6751.

Die r k s T., Sa le n tinA., He b e r g e r C., Kr a m e r R., 1990. The mitochondrial asparate/glutamate and ADP/ATP car rier switch from obligate counterexchange to unidirec tional transport after modification by SH-reagents. Biochim. Biophys. Acta 1028, 268-280.

Go gvadze V., ScHWEizER M., Ric h t e r Ch., 1996. Control o f

2+

the pyridine nucleotide-linked Ca release from mito chondria by respiratory substrates. Cell Calcium 19, 521-526.

Gr iffith sE. J., Ha le s tr a pA. P., 1993. Pyrophosphate meta bolism in the perfused heart and isolated heart mito chondria and its role in regulation o f mitochondrial function by calcium. Biochem. J. 290, 489-495.

Gr iffith s E. J., Ha le s tr a p A. P., 1995. Mitochondrial non

specific pores remain closed during cardiac ischaemia but open upon reperfusion. Biochem. J. 307, 93-98.

Gu id o u xR., La m b e l e tP., Ph o e n ixJ., 1993. Effects o f oxygen

and antioxidants on the mitochondrial Ca-retention ca pacity. Arch. Biochem. Biophys. 306, 139-147.

Gu n ter T. E., Pf e iff e r D. R., 1990. Mechanism by which

mitochondria transport calcium. Am. J. Physiol. 258, C755-C786.

Ha r am a k iN., As sa d n a za r iH., Zim m e rG., Sc h e pk inV., Pac k e r

L., 1995. The influence o f vitamin E and dihydrolipoic acid on cardiac energy and glutathione status under hypoxia-reoxygenation. Bichem. Mol. Biol. Inter. 37, 591-597.

(8)

104 Ew a Le n a r t o w i c z, Jo l a n t a Wu d a r c z y k

He r m e s-Lim aM „ Ca st il h oR. F., Me in ic k eA. R., Ve r c e siA. E., 1995. Characteristics o f Fe(II)ATP complex-induced, damage to the rat liver mitochondrial membrane. Mol. Cell Blochem. 145, 53-60.

Hu nter D. R., Ha w o r th R. A., 1979. The Ca2+ -induced membrane transition in mitochondria. Arch. Biochem. Biophys. 195, 453-459.

Inoue T., Yo s h id a y„ Nis h im u r a M ., Kurosaw a K ., Ta g a w a K.,

1993. Ca2+-induced, phospholipase-independent injury during reoxygenation o f anoxic mitochondria. Biochim. Biophys. Acta 1140, 313-320.

Ka spa r in sk y F. O., Vin o g r a d o vA. D., 1996. Slow Ca2+-in-

duced inactive/active transition o f the energy-depend ent Ca2+ transporting system o f rat liver mitochondria: clue fo r Ca2+ influx cooperavity. FEBS Lett. 389, 293- 296.

Kin n ally K. W ., Ca m p o M . L., Te d e s c h i H ., 1989. Mitochon drial channel activity studied by patch-clamping mito- plasts. J. Bioenerg. Biomembr. 21, 497.

Kow altow ski A. J ., Ca st ilh o R.F., Ve r c e si A. E., 1996. Openning o f the mitochondrial permeability transition pore by uncoupling or inorganic phosphate in the presence o f Ca?+ is dependent on mitochondrial-gener- ated reactive oxygen species. FEBS Lett. 378, 150-152.

La pid u s R. G., So k o lo v e P. M., 1994. The mitochondrial

permeability transition. Interactions o f spermine, ADP and inorganic phosphate. J. Biol. Chem. 269, 18931- 18936.

Le n a r t o w ic zE., Wu d a r c zy kJ., Dę b sk aG., 1996. Regulacja stopnia oksydoredukcji grup holowych w komórkach zwierzęcych. Post. Biochem. 42, 154-161.

Lo h r e tT. A ., Mu r ph y R. C., Dr g o n T., Kin n a ll y K. W ., 1996. Activity o f the mitochondrial multiple conductance chan nel is independent o f the adenine nucleotide transloca tor. J. Biol. Chem. 271, 4846-4849.

Me h e n d aleH. M., RothR. A., Ga n d o lf iA. J., Klau n ingJ. E.,

Le m aste r sJ. J., Cu r tis L. R., 1994. Novel mechanism

in chemically induced hepatotoxicity. FASEB J. 8, 1285- 1295.

Nico lliA., Ba ss oE., Pe tr o n illiV., Wen g e rR. M., Ber n ar d i

P., 1996. Interactions o f cyclophilin with the mitochon drial inner membrane and regulation o f the permeability transition pore, a cyclosporin A-sensitive channel. J.

Biol. Chem. 271, 2185-2192.

Niem in en A. -L., Sa y l o r A . K ., Tesfai S. A ., Herm an B., Lem aste r s J. J., 1995. Contribution o f the mitochondrial permeability transition to lethal injury after exposure o f hepatocytes to t-butylhydroperoxide. Biochem J. 307, 99-106.

No a c kH., K ub e U., A u g u s tin W., 1994. Relations between tocopherol depletion and coenzyme Q during lipid per oxidation in rat liver mitochondria Free. Radic. Res. 20, 375-386.

No v g o r o d o vS. A., Gu d zT. I., 1996. Permeabilty transition

pore o f the inner mitochondrial membrane can operate in two open states with different selectivities. J. Bioen erg. Biomembr. 28, 139-146.

Pa c k e r M. A ., Mu r ph y M . P., 1995. Peroxynitrite form ed by stimultaneous nitric oxide and superoxide generation causes cyclosporin-A-sensitive mitochondrial calcium ef flu x and depolarisation. Eur. J. B io c h e m . 2 34, 2 3 1 -

239.

Per e ir a R. S., Be r to c c h i A. P. F., Ver c e si A. E., 1992. Protective effect o f trifluoperazine on the mitochondrial damage induced by Ca + plus prooxidants. Biochem. Pharmacol. 44, 1795-1801.

Persso n B., Ryd str ó m J., 1987. Evidence f o r a role o f a

vicinal dithiol in catalysis and proton pumping in mito chondrial nicotinamide nucleotide transhydrogenase. Biochem Biophys. Res. Commun. 142, 573-578.

Petron illiV., Co laC., Ma s s a r iS., Co l o n n aR., Be r n ar d iP.,

1993. Physiological effectors modify voltage sensing by the cyclosporin A-sensitive transition pore o f mitochon d ria J. Biol. Chem. 268, 21939-21945.

Pe tron illiV., Co sta n tin iP., Sc o r r a n oL., Co l o n n aR., Pa s s-

a m o n tiS., Be rnard iP., 1994. The voltage sensor o f the

mitochondrial permeability transition is tuned by the oxidation-reduction state o f vicinal thiols. J. Biol. Chem. 269, 16638-16642.

Po l l aB. S., Ka t e n g w aS., Fr a n c o isO., Salv io l iS., Fr a n c es c h i

C., Ma r sac C., Co s s a r iz z aA., 1996. Mitochondria are selective targets fo r the protective effects o f heat shock against oxidative injury. Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 6458- 6463.

Po w e llS.R ., Ha l lD., Aiu toL., Wa p n ir R. A., Te ic h b e r gS.,

To r to la n iA. J., 1994. Zinc improves postischemic re covery o f isolated rat hearts through inhibition o f oxida tive stress. Am. J. Physiol. 266, H2497-H2507.

Ree d D. J., Sav ag e M. K., 1995. Influence o f metabolic inhibitors on mitochondrial permeability transition and glutathione status. Biochim. Biophys. Acta 1271, 43- 50.

Ril e y W . W ., Pf e iff e rJr. D. R., 1985. Relationships between Ca2+ release, Ca2+ cycling, and Ca2+-mediated per meabilty changes in mitochondria. J. Biol. Chem. 260, 12416-12425.

Sa x e n a K., Hen r y T. R., So lem L. E., Wa ll a c eK. B., 1995. Enhanced induction o f the mitochondrial permeability transition follow ing acute menadione administration. Arch. Biochem. Biophys. 317, 79-84.

Sc h l e g e lJ., Sc h w e iz e rM., Ric h t e rCh., 1992. ’Pore’form a

tion is not required fo r the hydroperoxide-induced Ca2+ release fro m rat liver mitochondria. Biochem. J. 285, 65-69.

Sc h w e iz e r M., Ric h t e r Ch., 1996. Peroxynitrite stimulates the pyridine nucleotide-linked Ca2+ release fro m intact rat liver mitochondria. Biochemistry. 35, 4524-4528.

Sc h w e iz e rM., Sc h l e g e lJ ., Ba u m a g a r t n e r D., Ric h t e rCh., 1993. Sensitivity o f mitochondrial peptidyl-prolyl cis- trans isomerase, pyridine nucleotide hydrolysis and Ca2+ release to cyclosporine A and related compounds. Biochem. Pharmacol. 45, 641-646.

Sk u la c h e v V. P., 1996. Why are mitochondria involved in

apoptosis? Permeability transition pores and apoptosis as selective mechanisms to eliminate superoxide-pro- ducing mitochondria and cell. FEBS Lett. 397, 7-10.

Va ll eV. G. R., Fa g ia nM. M., Pa r e n t o n iL. S., Me in ick eA. R.,

Ver c e siA. E., 1993. The participation o f reactive oxygen species and protein thiols in the mechanism o f mitochon drial inner membrane permeabilization by calcium plus prooxidants. Arch. Biochem. Biophys.307, 1-7.

Wu d a r c zy k J., Dę b sk a G ., Le n a r t o w ic zE., 1996. Relation

between the activities reducing disulfides and the pro tection against membrane permeability transition in rat liver mitochondria. Arch. Biochem. Biophys. 327, 215- 2 2 1.

Yam a m o to K., Fa r b e r J. L., 1992. Metabolism o f pyridine

nucleotides in cultured rat hepatocytes intoxicated with tert-butyl hydroperoxide. Biochem. Pharmacol. 43, 1119-1126.

Zo r atti M., Szab o I., 1995. The mitochondrial permeability transition. Biochim. Biophys. Acta 1241, 139-176.