Wpływ temperatury oraz czasu inkubacji roztworów na wykrywalność PLRV, PVM i PVY w soku z bulw ziemniaka.

Ziemniak Polski 2011 nr 1 1

Nasiennictwo i odmianoznawstwo

W

W

W

P

P

P

ŁŁ

Ł

Y

Y

Y

W

W

W

T

T

T

E

E

E

M

M

M

P

P

P

E

E

E

R

R

R

A

A

A

T

T

T

U

U

U

R

R

R

Y

Y

Y

O

O

OR

R

R

A

A

A

Z

Z

Z

C

CZ

C

Z

ZA

A

AS

S

SU

U

U

II

I

N

N

N

K

K

K

U

U

U

B

B

B

A

A

A

C

C

C

JJ

J

II

I

R

R

R

O

O

O

Z

ZT

Z

T

TW

W

W

O

OR

O

R

RÓ

Ó

ÓW

W

W

N

N

N

A

A

A

W

WY

W

Y

YK

K

KR

R

R

Y

Y

Y

W

WA

W

A

A

LL

L

N

N

N

O

O

O

Ś

ŚĆ

Ś

Ć

Ć

P

PL

P

LL

R

R

R

V

V

V

,,

,

P

P

P

V

V

V

M

M

M

I

II

P

P

P

V

V

V

Y

Y

Y

W

W

W

S

S

S

O

O

O

K

K

K

U

U

U

Z

Z

Z

B

B

B

U

U

U

LL

L

W

W

W

Z

Z

Z

II

I

E

E

E

M

M

M

N

N

N

II

I

A

A

A

K

K

K

A

A

A

IHAR – PIB, Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Biochemii w Boninie e-mail: pilecki@ziemniak-bonin.pl

ykrywanie wirusów jest koniecznym elementem w nasiennictwie ziem-niaka. Kontrolę materiału pod ką-tem obecności chorób i szkodników kwaran-tannowych prowadzą Wojewódzkie Inspekto-raty Ochrony Roślin i Nasiennictwa. W sto-sowanej obecnie procedurze robi się tzw. próby oczkowe, polegające na wyprowadza-niu roślin z oczek badanych bulw (najczę-ściej w szklarni w okresie jesienno-zimo-wym), i przeprowadza test DAS-ELISA na liściach (Clark 1977). Ze względów ekono-micznych (nakłady finansowe i pracy oraz czasochłonność procedur) badania nad usprawnieniem diagnostyki wirusów – a szczególnie poszukiwanie możliwości wy-krywania wirusów bezpośrednio w soku z bulw – mogą mieć duże znaczenie praktycz-ne.

Istnieje wiele modyfikacji ELISA mających szerokie zastosowanie w diagnostyce wiru-sologicznej ziemniaka. Modyfikacje testu prowadzą do większej automatyzacji czy przede wszystkim zwiększenia czułości bądź obniżenia tła reakcji. Poprawę czułości testu można uzyskać poprzez zwiększenie ilości wirusa wiązanego przez przeciwciała. Naj-częściej stosuje się zagęszczanie wirusa w większych objętościach soku, poprawę uwalniania cząsteczek wirusa bądź zwięk-szenie ilości przeciwciał zaadsorbowanych na podłożu stałym.

Stosunkowo prostym zabiegiem umożli-wiającym znaczną poprawę czułości testu

jest równoczesna inkubacja badanego anty-genu i koniugatu przeciwciało-AP w tej sa-mej studzience płytki reakcyjnej (test koktajl ELISA). Szybkość reakcji, jak również po-ziom detekcji wirusa zależy od wielu czynni-ków fizykochemicznych – temperatury, cza-su oraz intensywności mieszania roztworów w studzienkach bądź kompozycji buforów używanych podczas testu.

Podjęto prace badawcze mające na celu określenie wpływu czasu inkubacji oraz tem-peratury na uzyskiwanie jasnych, czytelnych oraz nieobarczonych błędem wartości stop-nia porażestop-nia wirusami liściozwoju (potato leafroll virus – PLRV) oraz Y (potato virus Y – PVY) i M (potato virus M – PVM) ziemnia-ka.

Materiał i metody

Materiał badawczy stanowił wyciśnięty na prasie sok zdrowych i zainfekowanych PLRV, PVM oraz PVY bulw ziemniaka od-miany Orlik. Doświadczenie przeprowadzono 60 dni po zbiorze (Gugerli 1980). Próby po-bierano, wycinając cienki plaster zawierający wiązkę przewodzącą, i rozcieńczano dwie krople soku w 450 l buforu koniugatowego (10 mM PBS, 0,05% Tween 20, 2% PVP, 1% żelatyna, 1 mM MgCl2 x 6 H2O). Zebrany

sok preinkubowano przez 3 godziny w ciem-ności w temperaturze pokojowej.

Studzienki mikropłytek (NUNC standard) opłaszczono IgG (1 μl IgG/1 ml 50 mM bufo-ru węglanowego pH 9,6 (powlekającego),

Ziemniak Polski 2011 nr 1

2

następnie inkubowano (blokowano) buforem PBS z dodatkiem 3% odtłuszczonego mleka w proszku. Płytki płukano 10x buforem do płukania (10 mM PBS + 0,05% Tween 20, pH 7,4).

Po preinkubacji rozcieńczone soki nakła-dano do studzienek mikropłytek (po 100 l), następnie dodawano po 100 l koniugatu przeciwciał z alkaliczną fosfatazą (2 μl IgG- -AP/1 ml buforu koniugatowego) i inkubowa-no w ustalonych przedziałach czasowych (1--5 godz.) w dwóch zakresach temperatur, tj. w pokojowej (RT – room temperature) oraz w 37oC.

Płytki ponownie płukano buforem do płu-kania i dodawano roztwór substratu reakcji – fosforanu p-nitrofenolu (1 mg substratu/1 ml buforu substratowego 1M dwuetanoloamina pH 9,8, 0,02% azydek sodowy). Płytki inku-bowano w ciemności w temperaturze poko-jowej. Absorbancję odczytywano w 405 nm po 60 lub 120 minutach.

Wyniki i ich omówienie

Uzyskane wyniki wskazują, że modyfikując warunki przebiegu reakcji (Tamada 1980, van den Heuvel 1989, Pilecki 2009), może-my uzyskać wyższe wartości odczytu ELISA. Bardzo duże znaczenie ma prowadzenie inkubacji w optymalnym czasie – skrócenie tego czasu może obniżać wartości absor-bancji, natomiast nadmierne wydłużenie nie poprawia wartości odczytu, tylko niepotrzeb-nie wydłuża czas wykonania testu. Ustalając optimum i ramy czasowe inkubacji, należy

również zwrócić uwagę na testowany mate-riał, gdyż dla różnych wirusów wartości mo-gą być różne.

Ponadto wykazano, że wzrost temperatu-ry w czasie inkubacji może mieć negatywny wpływ na uzyskiwane wartości. W związku z tym nie zaleca się inkubowania w warunkach podwyższonej temperatury, gdyż spada wówczas poziom absorbancji i niepotrzebnie są generowane większe koszty (energia elektryczna i zakup cieplarki z regulacją temperatury).

W przypadku PLRV (rys. 1) stwierdzono, że optymalny czas inkubacji rozcieńczonych soków roślin i koniugatu wynosi minimum dwie godziny. Wydłużenie czasu nie ma wpływu na uzyskane wartości, więc nie zale-ca się prowadzenia inkubacji dłużej. Są moż-liwości uzyskania jeszcze większych warto-ści parametrów odczytu po 4 godzinach, niemniej jednak nie są one na tyle wysokie, aby można było rekomendować taki model działania.

Podobne wyniki uzyskano w testach PVM (rys. 2); optymalny czas inkubacji w tym wy-padku również wynosił dwie godziny, przy czym dalsze wydłużanie czasu nie prowadzi-ło do znaczącego wzrostu wartości.

Najmniej wrażliwy na modyfikacje proce-dur ELISA w zakresie regulacji temperatury okazał się PVY – wyniki w obu wariantach niemalże się nie różniły. Wykazano, że rów-nież w tym wypadku najkorzystniejszy czas inkubacji wynosi dwie godziny (rys. 3).

Ziemniak Polski 2011 nr 1 3

Rys. 1. Wpływ czasu wytrząsania płytek i temperatury na wykrywalność PLRV w bulwach ziemniaka

Rys. 2. Wpływ czasu wytrząsania płytek i temperatury na wykrywalność PVM w bulwach ziemniaka

Rys. 3. Wpływ czasu wytrząsania płytek i temperatury na wykrywalność PVY w bulwach ziemniaka Oznaczenia: K.NEG – kontrola negatywna (sok z bulw nieporażonych)

K.POZ – kontrola pozytywna (sok z bulw porażonych odpowiednim wirusem)

Żaden z testowanych parametrów nie miał wpływu na wartości kontroli negatyw-nych (sok z bulw nieporażonegatyw-nych). Reasumu-jąc i biorąc pod uwagę metodykę oraz spe-cyfikę wykonania testu ELISA (często na dużą skalę), doświadczenie wykazało, że najkorzystniejsza pod względem uzyskanych wartości oraz czasu i kosztów jest 2-godzin-na inkubacja badanych roztworów w tempe-raturze pokojowej.

A więc warto poszerzać tematykę badań o nowe aspekty metodyczne (Spiegel 1993, Treder 2009)) czy stosowanie innych (często niedrogich) modyfikantów – w metodyce koktajl-ELISA bez wątpienia tkwią ukryte rezerwy (Lewosz 2004). Dzięki stosunkowo

prostym zabiegom stosowanym na etapie prac przygotowawczych można osiągnąć doskonalsze rezultaty przy niewielkim zaan-gażowaniu finansowym i technicznym. Literatura

1. Clark M. F., Adams A. N. 1977. Characteristics of

the microplate method enzyme-linked immunosorbent assay for detection of plant viruses. – J. Gen. Virol. 34: 475-483; 2. Gugerli P. 1980. Potato leafroll virus con-centration in vascular region of potato tubers examined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). – Potato Res. 23: 137-141; 3. Gugerli P., Gehringer W.

1980. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

for the detection of potato leafroll virus and potato virus Y in potato tubers after artificial break of dormancy. –

Ziemniak Polski 2011 nr 1

4

Potato Res. 23: 353-359; 4. Heuvel J. F. J. M. van

den, Peters D. 1989. Improved detection of potato

leafroll virus in plant material and in aphids. – Phyto-pathology 79: 963-967; 5. Lewosz J., Pilecki T.,

Tre-der K. 2004. Możliwości usprawnienia certyfikacji

nasiennej poprzez wykrywanie PLRV, PVY i PVM w bulwach ziemniaka w stanie spoczynku. Warsztaty. Bonin, 28.09.2004. IHAR ZNiOZ Bonin: 64 s.; 6.

Pilec-ki T. 2009. Wpływ modyfikacji technik diagnostycznych

ELISA na wykrywalność wirusów ziemniaka. – Ziemn. Pol. 4: 16-19; 7. Spiegel S., Martin R. R.1993. Im-proved detection of potato leafroll virus in dormant potato tubers and microtubers by the polymerase chain reaction and ELISA. – Ann. Appl. Biol. 122: 493-500;

8. Tamada T., Harrison B. D. 1980. Factors affecting

the detection of potato leafroll virus in potato foliage by enzyme-linked immunosorbent assay. – Ann. Appl. Biol. 95: 209-219; 9. Treder K., Pilecki T., Lewosz J.

2004. Optimization of cocktail-ELISA for potato viruses

detection in tuber sap. [W:] Workshop on Improvement and unification of plant disease diagnostics. Skiernie-wice, 30.08.-1.09.2004. Abstr.: 65; 10. Treder K.,

Pilecki T., Łycuś P. 2009. Wykrywanie wirusów

ziem-niaczanych bezpośrednio w ekstraktach z bulw – po-równanie testu ELISA z immuno-captured RT-PCR. – Prog. Plant Prot. 49(2): 740-745