Damian Wojcieszak
1, B–D, Danuta Kaczmarek
1, A–F, Bogdan Adamiak
1, B, C,
Jarosław Domaradzki
1, B, C, Michał Mazur
1, B, C, Dominika Jankowska
1, B, C,
Andrzej Gamian
2, B, C, Aleksandra Antosiak
2, B, C, Bogumiła Szponar
2, B, C,
Zbigniew Rybak
3, B, C, Danuta Paluch
3, B, C, Agnieszka Rusak
3, B, CSposób wytwarzania oraz charakterystyka
właściwości powierzchni i aktywności biologicznej
cienkowarstwowych powłok układu typu Cu–Ti
A Method of Manufacture and Characteristic of Surface Properties
and Biological Activity of Thin-Film Coatings of Cu–Ti System
1 Wydział Elektroniki Mikrosystemów i Fotoniki, Politechnika Wrocławska, Wrocław, Polska 2 Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej, Polska Akademia Nauk, Wrocław, Polska
3 Zakład Chirurgii Eksperymentalnej i Badania Biomateriałów, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu,
Wrocław, Polska
A – koncepcja i projekt badania; B – gromadzenie i/lub zestawianie danych; C – analiza i interpretacja danych; D – napisanie artykułu; E – krytyczne zrecenzowanie artykułu; F – zatwierdzenie ostatecznej wersji artykułu; G – inne
Streszczenie
Wprowadzenie. Biomateriały w postaci powłok cienkowarstwowych nanoszonych na różne podłoża cieszą się obecnie coraz
większym zainteresowaniem. Zwłaszcza powłoki będące połączeniem biokompatybilnych materiałów (np. tytanu) z meta-lami o dużej aktywności biologicznej (np. z miedzią) mają potencjalnie duży obszar zastosowania jako aktywne powłoki, przeznaczone na różnego rodzaju wyroby medyczne.
Cel pracy. Przedstawienie sposobu wytwarzania oraz analiza właściwości cienkowarstwowych powłok Cu–Ti, w
szczególno-ści ich aktywnoszczególno-ści biologicznej w powiązaniu z właszczególno-ściwoszczególno-ściami powierzchni.
Materiał i metody. Warstwy zostały wytworzone metodą rozpylania magnetronowego za pomocą innowacyjnego,
czterotar-getowego stanowiska. W czasie procesów nanoszenia jednocześnie rozpylano dwa metaliczne targety (miedziowy i tytanowy) w atmosferze argonowej. Skład materiałowy wytworzonych powłok został scharakteryzowany za pomocą elektronowego mikroskopu skaningowego wyposażonego w przystawkę do badań metodą mikroanalizy rentgenowskiej. Oprócz tego, na podstawie trójwymiarowych profili powierzchni uzyskanych za pomocą profilometru optycznego zbadano mikrostrukturę powierzchni wytworzonych warstw i określono jej chropowatość. W ramach prac badawczych wykonano również pomia-ry zwilżalności powierzchni na stanowisku do pomiarów kąta zwilżania. Charaktepomia-ryzację właściwości powierzchni warstw Cu–Ti poszerzono również o badania mikrobiologiczne z udziałem bakterii typu Staphylococcus aureus (PCM 2602), a także o ocenę działania cytotoksycznego powłok z udziałem linii komórkowej L 929 (NCTC klon 929).
Wyniki. Pomiary pokazały, że warstwa była złożona w 71% z atomów Cu i 29% z atomów Ti. Analiza topografii
powierzch-ni pokazała, że jej powierzchpowierzch-nia jest bardzo jednorodna i ma chropowatość na poziomie pojedynczych nanometrów. Stwierdzono, że wytworzona warstwa jest hydrofilowa. Uzyskane wyniki badań pokazały również, że wytworzona warstwa ma bardzo dobre właściwości bakteriobójcze i jest cytotoksyczna. Efekt ten był związany z migracją jonów miedzi, która była najintensywniejsza przy krawędzi próbki.
Wnioski. Wyniki badań przedstawionych w niniejszej pracy świadczą o tym, że cienkie warstwy Cu–Ti mogą znaleźć
prak-tyczne zastosowanie w przemyśle jako powłoki bioaktywne (Polim. Med. 2013, 43, 3, 135–140).
Słowa kluczowe: rozpylanie magnetronowe, cienka warstwa, tytan, miedź, powłoka aktywna biologicznie, bakteriobójczość,
cytotoksyczność.
Polim. Med. 2013, 43, 3, 135–140 © Copyright by Wroclaw Medical University ISSN 0370-0747
PRACE ORyGINALNE
Biomateriały, zwłaszcza w postaci powłok cienko-warstwowych nanoszonych na różne podłoża, cieszą się obecnie coraz większym zainteresowaniem [1–4]. Zgodnie z przewidywaniami tego typu materiały będą odgrywać dużą rolę w rozwoju polskiej gospodarki i z tego wzglę-du wiele makrotematów oraz priorytetów wymienionych w Programie Foresight Polska 2020 dotyczy właśnie ma-teriałów do zastosowań w medycynie, w szczególności wy-twarzanych w postaci powłok cienkowarstwowych.
Ze względu na obszar zastosowania biomateriały można podzielić na takie grupy, jak: 1) metale – sto-sowane np. do wytwarzania implantów zębów czy w postaci różnego rodzaju śrub i płytek w ortopedii, 2) półprzewodniki, których używa się np. do produkcji mikroelektrod czy też w konstrukcji biosensorów, 3) ce-ramika – np. kości, zęby, zastawki serca, 4) polimery, np. naczynia krwionośne, implanty oka lub też pozwalają na dostarczanie leków, 5) syntetyczne biomateriały. Je-śli chodzi o metaliczne biomateriały, to obecnie najczę-ściej stosuje się takie stopy, jak: Ti-6Al-4V, Ti-6Al-7Nb, Au-Cu-Ag, Au-Cu-Ag-Pt-Pd, Ti-Ni, Pt-Ir, Co-Cr, stal 316L oraz metale, takie jak Ti [1]. Także materiały wy-kazujące aktywność biologiczną, np. w postaci warstw metalicznych oraz na bazie tlenków metali, znajdują za-stosowanie jako różnego rodzaju powłoki antybakteryj-ne [4]. Do wytwarzania bioaktywnych warstw najczę-ściej używa się miedzi, srebra, złota, platyny, palladu, niobu i takich tlenków, jak tlenek srebra, tlenek cynku, dwutlenek cyny czy dwutlenek tytanu [5]. Warstwy bę-dące połączeniem biokompatybilnych materiałów (np. tytanu) z metalami o dużej aktywności biologicznej (np. z miedzią) mogą także często być stosowane jako aktywne powłoki przeznaczone do produkcji różnego rodzaju wyrobów medycznych.
Obecnie w przemyśle powłoki cienkowarstwowe wytwarza się różnymi metodami – najczęstsze z nich to rozpylanie magnetronowe [6, 7]. Metoda ta umożliwia wytwarzanie różnego rodzaju powłok (metalicznych, pół-przewodnikowych i dielektrycznych) na różne podłoża. W szczególności jako podłoża mogą być stosowane mate-riały organiczne (np. polimery) i nieorganiczne (np. szkło, stal) wykorzystywane w różnych wyrobach medycznych.
Niniejsza praca zawiera opis sposobu wytwarzania cienkich warstw Cu–Ti metodą rozpylania magnetro-nowego na innowacyjnym, wielotargetowym stanowi-sku. W czasie nanoszenia materiały bazowe w postaci dwóch targetów Ti i Cu rozpylano w plazmie argo-nowej. Dzięki odpowiedniemu doborowi parametrów procesu uzyskano cienkie warstwy o pożądanym skła-dzie materiałowym. Charakteryzację wytworzonych warstw wykonano na podstawie badań mikrostruktury oraz właściwości fizykochemicznych ich powierzchni. Badano także wpływ powłok Cu–Ti na rozwój bakterii typu Staphylococcus aureus (PCM 2602) oraz komórek z linii L 929 (NCTC klon 929).
Materiał i metody
Cienkowarstwowe powłoki zostały wytworzone metodą rozpylania magnetronowego na nowatorskim, czterotargetowym stanowisku, którego konstrukcja została opracowana i wykonana w Wydziałowym Za-kładzie Technologii i Diagnostyki Struktur Mikroelek-tronicznych na Wydziale Elektroniki Mikrosystemów i Fotoniki Politechniki Wrocławskiej [8, 9]. Stanowi-sko to jest wyposażone w cztery magnetrony, które zamontowano w komorze próżniowej w taki sposób,
Abstract
Background. Biomaterials in the form of thin-film coatings as-deposited on different substrates are nowadays increasingly
popular. In particular coatings based on a combination of biocompatible materials (eg. titanium) with metals of high biological activity (eg. copper) have a potentially wide range of applications as active films, intended for various types of medical devices.
Objectives. The aim of this study was to present a method for preparation and analysis of the properties of Cu–Ti thin films,
in particular their biological activity in connection with the properties of the surface.
Material and Methods. The films were prepared by magnetron sputtering method with the aid of an innovative four-target
apparatus. During deposition process two metallic targets (copper and titanium) were sputtered under an argon atmosphere. Material composition of produced coatings was characterized by scanning electron microscope equipped with an adapter for energy dispersive spectroscopy. Moreover, the surface microstructure and roughness of coatings was characterized based on three-dimensional surface profiles, which were obtained with the aid of optical profilometer. The research was also carried out by investigations of surface wettability on the apparatus for measurements of contact angle. Characterization of Cu–Ti surface properties was also expanded by microbiological tests involving Staphylococcus aureus (PCM 2602) bacteria and investigations of cytotoxicity with L 929 (NCTC clone 929) cell line.
Results. Measurements have shown that the film was composed of 71% at. Cu and 29% at. Ti. The analysis of surface
topog-raphy has shown that the surface of Cu–Ti thin film was very uniform with roughness in range of nanometers. It was found that as-deposited film is hydrophilic. Obtained results has shown that as-deposited film had a very good bactericidal proper-ties and it was cytotoxic. This effect was associated with the migration of copper ions, which was the most intense at the edge of the sample.
Conclusions. The results presented in this paper testify that manufactured Cu–Ti thin films may find practical application
in the industry as a bioactive coating (Polim. Med. 2013, 43, 3, 135–140).
że podłoża, na które są nanoszone powłoki, umiesz-cza się w ognisku pola nanoszenia magnetronów. Wy-tworzenie warunków wysokiej próżni (na poziomie 10–5 mbar) w komorze roboczej umożliwia zespół pom-powy, który składa się z pompy obrotowej i dyfuzyjnej. Aparatura ta jest również wyposażona w regulatory przepływu masowego gazów roboczych, co pozwala na ich odpowiednie dozowanie podczas procesu nanosze-nia. Magnetrony są zasilane przez cztery zasilacze typu MSS2 (firmy DORA Power System), których moc jest regulowana przez zmianę współczynnika PWM
(Pulse-Width Modulation) [10]. PWM jest to metoda regulacji
sygnału prądowego lub napięciowego (o stałej amplitu-dzie i częstotliwości) polegająca na zmianie współczynni-ka wypełnienia sygnału. Za kontrolę parametrów pracy każdego z zasilaczy odpowiada natomiast specjalistyczny sterownik, który jest sterowany za pomocą komputera wraz z odpowiednim oprogramowaniem. Sposób stero-wania pracą zasilaczy jest chroniony zgłoszeniem paten-towym [8].
W trakcie procesów nanoszenia jest możliwe roz-pylanie materiałów bazowych z kilku magnetronów w sposób jednoczesny lub sekwencyjny, co pozwala na wytwarzanie powłok o ściśle określonym i pożądanym składzie materiałowym. To innowacyjne, wielotargeto-we stanowisko pozwala nanosić warstwy kompozyto-we, powłoki wielowarstwowe oraz powłoki o gradien-towej koncentracji domieszek. W przypadku warstw kompozytowych proces nanoszenia polega na szybkim multipleksowaniu, czyli włączaniu i wyłączaniu po-szczególnych magnetronów. Powoduje to mieszanie rozpylanych materiałów i osadzanie ich na podłożu w postaci kompozytu. Z kolei podczas ustalenia odpo-wiedniej kolejności i czasu pracy poszczególnych ma-gnetronów można wytwarzać powłoki wielowarstwowe.
Warto podkreślić, że stanowisko to umożliwia również wytwarzanie wielu warstw o gradientowej koncentracji domieszek w poszczególnych warstwach. Jest to moż-liwe dzięki opracowanemu nowatorskiemu systemowi dobierania parametrów mocy i czasów włączania, wy-łączania poszczególnych magnetronów.
Na potrzeby niniejszej pracy cienkie warstwy Cu–Ti zostały naniesione na podłoża szklane typu Cor-ning 7059 przez jednoczesne rozpylanie dwóch meta-licznych targetów – Ti i Cu w plazmie argonowej. Ma-gnetrony z targetami były zasilane z jednakową mocą (PWM = 80%). Ciśnienie w komorze roboczej podczas procesu wynosiło 4 ⋅ 10–2 mbar. Uzyskano warstwy za-wierające 71% atomów Cu i 29% atomów Ti, co pokaza-ły wyniki badań metodą mikroanalizy rentgenowskiej. Grubość cienkich warstw wynosiła około 100 nm.
Wyniki i omówienie
Właściwości wytworzonych powłok Cu–Ti zosta-ły określone na podstawie badań mikrostruktury po-wierzchni za pomocą profilometru optycznego (typu CCI Lite firmy Taylor Hobson) oraz elektronowego mikroskopu skaningowego (FESEM FEI Nova Nano SEM 230). Uzyskane wyniki (ryc. 1.) pokazały, że cien-kie warstwy charakteryzują się bardzo dużą jednorod-nością. Analiza struktury geometrycznej powierzchni, którą wykonano na podstawie analizy trójwymiarowych profili powierzchni (ryc. 1a) pokazała, że chropowatość powierzchni określona jako średnie arytmetyczne od-chylenie profilu chropowatości (Sa) wynosi 1,0 nm. Niewielkie różnice w wysokości obszarów badanego fragmentu powierzchni warstwy są związane natomiast z niedoskonałością podłoża szklanego (brakiem dosta-tecznej płaskorównoległości).
Ryc. 1. Wyniki badań topografii powierzchni cienkiej warstwy Cu–Ti, które otrzymano za pomocą: a) profilometru optycznego,
b) skaningowego mikroskopu elektronowego
Fig. 1. Results of surface topography investigations of Cu–Ti thin film, which were obtained by: a) an optical profilometer,
b) scanning electron microscope
Kolejny etap prac badawczych dotyczył pomiarów kąta zwilżania powierzchni cienkich warstw Cu–Ti, które wykonano za pomocą stanowiska typu Theta Li-te firmy AtLi-tension. Uzyskane wyniki (ryc. 2) pokaza-ły, że wytworzona warstwa ma właściwości hydrofilo-we. Wartość kąta zwilżania (dla wody dejonizowanej) dla tej warstwy wynosiła 74o. Na podstawie pomiarów z użyciem różnych cieczy (glikolu etylenowego, etano-lu, wody dejonizowanej) wyznaczono także krytyczne napięcie powierzchniowe (metodą Zismana) [11]. Jest to wartość napięcia powierzchniowego cieczy, potrzeb-nej do całkowitego zwilżenia powierzchni badanego materiału. W przypadku wytworzonych powłok Cu–Ti wartość tego parametru wynosiła 15,16 mN/m.
W ramach charakteryzacji właściwości cienkich warstw Cu–Ti w Instytucie Immunologii i Terapii Do-świadczalnej wykonano badania aktywności biologicz-nej wytworzonych powłok w kontakcie z bakteriami typu Staphylococcus aureus (PCM 2602). Procedura badawcza polegała na zanurzeniu i inkubacji (przez 24 godziny) badanych próbek w płynnej zawiesinie z bakteriami. W tym czasie pobierano również próbki roztworu i hodowano z niego kulturę bakteryjną na po-żywce agarowej. Liczbę bakterii wyhodowanych w ten sposób oznaczono za pomocą mikroskopu optycznego. Na podstawie uzyskanych wyników (ryc. 3) stwierdzono, że wytworzona warstwa ma bardzo dobre właściwości bakteriobójcze. Można zauważyć, że bakteriobójcze dzia-łanie Cu–Ti uzyskano już w czasie pierwszych 2 godzin od momentu rozpoczęcia ekspozycji, a po 5 godzinach z roztworu mającego bezpośredni kontakt z powierzch-nią warstwy nie wyhodowano już żadnych bakterii.
W celu oceny aktywności cytotoksycznej warstw Cu–Ti w Pracowni Hodowli Komórkowych Zakładu Chirurgii Eksperymentalnej i Badania Biomateriałów
Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu wykonano badania na linii komórkowej L 929 (NCTC klon 929). W szczególności, komórki fibroblastów mysich inku-bowano w zawiesinie (gęstość komórek 1 × 105/ml) w obecności cienkich warstw przez 24 godziny. Do oce-ny cytotoksycznego działania powłok wykorzystano od-wrócony mikroskop kontrastowo-fazowy typu CKX 41 (Olympus). Uzyskane wyniki (ryc. 4) świadczą o tym, że cienka warstwa Cu–Ti ma właściwości cytotoksyczne, które są związane z migracją jonów miedzi. Największa liczba obumarłych komórek występuje zwłaszcza przy krawędzi próbki (ryc. 4b). Jest to najprawdopodobniej związane ze sposobem przygotowania próbki do badań, tzn. pocięciem podłoża szklanego na mniejsze
fragmen-Ryc. 2. Wyniki badań zwilżalności cienkiej warstwy Cu–Ti: a) obraz kropli wody na powierzchni warstwy, b) sposób
wyznacza-nia wartości krytycznego napięcia powierzchniowego
Fig. 2. Results of wettability investigations of Cu–Ti thin film: a) an image of water drops on the surface of the film, b) a
meth-od of the critical surface tension determination
θ – kąt zwilżania, γL – napięcie powierzchniowe cieczy użytej do pomiarów.
θ – wetting angle, γL – surface tension of liquid used for measurement.
Ryc. 3. Aktywność bakteriobójcza w czasie dla
cien-kiej warstwy Cu–Ti mającej kontakt z bakteriami typu Staphylococcus aureus (PCM 2602)
Fig. 3. The antibacterial activity in time for Cu–Ti thin film
in contact with Staphylococcus aureus (PCM 2602) bacterial type 10 20 30 40 50 60 70 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 co s( θ) γL(mN/m) Cu–Ti krytyczne napięcie powierzchniowe Cu–Ti 0,00E+00 2,00E+07 4,00E+07 6,00E+07 8,00E+07 1,00E+08 [cfu/ml] [h] 0 4 8 12 16 20 24 a) b)
ty (o powierzchni 1 cm2). Na krawędzi próbki powstało wtedy wiele defektów w strukturze warstwy, co sprzyja procesowi migracji jonów miedzi.
W niniejszej pracy przedstawiono sposób wytwa-rzania cienkich warstw Cu–Ti metodą rozpylania ma-gnetronowego na innowacyjnym, czterotargetowym stanowisku. Dzięki doborowi odpowiednich parame-trów procesu zasilania magnetronów, z których rozpy-lano miedź i tytan, uzyskano bardzo jednorodne cien-kowarstwowe powłoki. Chropowatość wytworzonych warstw (Sa) wynosiła 1 nm i miały one gęsto upakowa-ne ziarna. Z kolei badania zwilżalności pokazały, że po-wierzchnia cienkiej warstwy miała właściwości hydrofi-lowe (wartość kąta zwilżania θ = 74o) oraz że będzie ona zwilżana przez wszystkie ciecze o napięciu powierzch-niowym mniejszym niż 15,16 mN/m. Charakteryzację właściwości wytworzonych warstw poszerzono również
Ryc. 4. Wyniki badań cytotoksyczności cienkich warstw Cu–Ti naniesionych na podłoże szklane typu Corning 7059, które
wykonano z udziałem linii komórkowej L 929 (NCTC klon 929)
Fig. 4. Results of cytotoxicity investigations of Cu–Ti thin films as-deposited on a Corning 7059 glass substrate, which were
performed with the use of L 929 (NCTC clone 929) cell line
o badania wpływu powłoki Cu–Ti na rozwój bakterii typu Staphylococcus aureus (PCM 2602) oraz komó-rek z linii L 929 (NCTC klon 929). Analiza uzyskanych wyników pokazała, że warstwy te mają bardzo dobre właściwości bakteriobójcze. Niszczenie mikroorgani-zmów zaobserwowano już po 2 godzinach od rozpo-częcia inkubacji, a czterogodzinny kontakt spowodował zniszczenie wszystkich bakterii. Z kolei badania z ko-mórkami fibroblastów mysich pokazały, że wytworzona warstwa ma właściwości cytotoksyczne, co jest związa-ne z migracją jonów miedzi. Zaobserwowano, że proces migracji jonów był bardziej intensywny przy krawędzi próbki (w miejscu występowania dużej liczby defektów w strukturze) niż na powierzchni warstwy. Na podsta-wie analizy uzyskanych wyników można stpodsta-wierdzić, że warstwy te z powodzeniem mogą znaleźć zastosowanie jako powłoki bioaktywne.
Piśmiennictwo
[1] Hiromoto S.: Interface 2008, 1–41.
[2] Bokare A., Sanap A., Pai M., Sabharwal S., Athawale A.A.: Antibacterial activities of Nd doped and Ag coated TiO2
nano-particles under solar light irradiation. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 2013, 102, 273–280. [3] Brash J.L.: Biomaterials in Canada 2005, 26 (35), 7209–7220.
[4] Carp O., Huisman C.L., Reller A.: Photoinduced reactivity of titanium dioxide. Progress in Solid State Chemistry 2004, 32, 33–177.
[5] Sant S.B., Gill K.S., Burrell R.E.: Nanostructure, dissolution and morphology characteristics of microcidal silver films de-posited by magnetron sputtering. Acta Biomaterialia 2007, 3 (3), 341–350.
[6] Kaczmarek D.: Modyfikacja wybranych właściwości cienkich warstw TiO2. Oficyna Wydawnicza Politechniki
Wrocław-skiej, Wrocław 2008.
[7] Domaradzki J.: Powłoki optyczne na bazie TiO2. Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej, Wrocław 2010.
[8] Zgłoszenie patentowe nr PL 396389.
[9] Adamiak B., Kaczmarek D., Dora J., Domaradzki J., Wojcieszak D., Mazur M.: Wytwarzanie cienkowarstwowych powłok gradientowych do zastosowań w wyrobach medycznych. Referaty plenarne z I Konferencji Techniczno-Medycznej „Materia-ły Biologicznie Aktywne”, Sulistrowiczki (8–9 marca 2013), Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej, Wrocław 2013, 7–16.
[10] Dora J.: Polski patent nr PL 178285.
[11] Żenkiewicz M.: Analiza głównych metod badania swobodnej energii powierzchniowej materiałów polimerowych. Polimery 2007, 52 (10), 760–767.
Adres do korespondencji:
Damian Wojcieszak
Wydział Elektroniki Mikrosystemów i Fotoniki Politechnika Wrocławska
ul. Janiszewskiego 11/17 50-372 Wrocław
e-mail: damian.wojcieszak@pwr.wroc.pl Konflikt interesów: nie występuje. Praca wpłynęła do Redakcji: 6.05.2013 r. Po recenzji: 5.09.2013 r.
Zaakceptowano do druku: 5.09.2013 r. Received: 6.05.2013
Revised: 5.09.2013 Accepted: 5.09.2013
