Artyku³ przegl¹dowy Review
Autofagia jest niezbêdna dla prze¿ycia komórek. Jest ewolucyjnie konserwatywnym, bardzo starym proce-sem komórkowym, umo¿liwiaj¹cym degradacjê bia³ek z naruszon¹ struktur¹, o d³ugim okresie pó³trwania, oraz usuwanie organelli z udzia³em lizosomów (21). W komórkach eukariotycznych wyró¿niono trzy g³ów-ne formy autofagii: makroautofagiê, mikroautofagiê oraz autofagiê zale¿n¹ od bia³ek opiekuñczych, tzw. chaperonów, jednak¿e makroautofagia jest g³ówn¹ cie¿k¹, odpowiedzialn¹ za nieselektywne przenosze-nie materia³u cytoplazmatycznego do lizosomów pod-czas g³odu komórkowego. W procesie tym sk³adniki cytoplazmy, które maj¹ ulec degradacji, zostaj¹ oto-czone pocz¹tkowo pojedyncz¹, a nastêpnie podwójn¹ b³on¹ izoluj¹c¹, tworz¹c autofagosomy, które z kolei ulegaj¹ fuzji z wczesnymi i pónymi lizosomami. Pro-wadzi to do powstania autofagolizosomów, w których zachodzi ostateczny proces degradacji ich zawartoci przy u¿yciu hydrolaz lizosomalnych (34). Zaburzenie autofagii prowadzi do zmian zwyrodnieniowych.
Bia³ka zaanga¿owane w regulacjê autofagii G³ówne bia³ka zaanga¿owane w regulacjê procesu autofagii w komórkach wszystkich organizmów po-cz¹wszy od dro¿d¿y a¿ po ssaki nale¿¹ do produktów genów z rodziny ATG (AuTophaGy-related) (22, 26). Odkrycie tych bia³ek pozwoli³o na zidentyfikowanie cie¿ek sygna³owych zwi¹zanych z aktywacj¹ i regu-lacj¹ tego procesu. Za g³ówne markery biochemiczne autofagii uwa¿a siê dwa bia³ka: LC3 (Atg8) oraz be-klinê1 (Atg6), jak równie¿ ATG7. Bia³ko LC3 wystê-puje w komórce w dwóch formach: w formie nieak-tywnej (LC3-I) rozproszone w cytoplazmie komórki oraz w formie aktywnej (LC3-II) zlokalizowane w b³onach izoluj¹cych i b³onach autofagosomów. LC3-II ³¹czy siê z fosfatydyloetanoloamin¹ i przy-³¹czane jest do b³on autofagosomów. Iloæ bia³ka LC3-II w komórce jest cile skorelowana z iloci¹ autofagosomów, w zwi¹zku z tym LC3 jest obecnie uwa¿ane za jedyny wiarygodny molekularny marker procesu autofagii (17). Stworzenie konstruktu LC3 z GFP (bia³ko zielonej fluorescencji) umo¿liwia pre-cyzyjn¹ lokalizacjê bia³ka LC3-II zlokalizowanego na
Rola autofagii w mammogenezie gruczo³u
mlekowego krów na modelu mammosfer*
)
AGNIESZKA SOBOLEWSKA, MA£GORZATA GAJEWSKA, TOMASZ MOTYL
Katedra Nauk Fizjologicznych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej SGGW, ul. Nowoursynowska 159, 02-776 Warszawa
Sobolewska A., Gajewska M., Motyl T.
Role of autophagy in the mammogenesis of bovine mammary glands on the model of mammospheres
Summary
Progress in studies concerning the process of mammogenesis have been stimulated by the development of the three-dimensional (3D) culture systems, which enable mammary epithelial cells to form structures mimicking the alveoli of mammary gland in vivo. Mammary epithelial cells (MECs) supported on a laminin--rich extracellular matrix (ECM) form 3D acinar structures mammospheres which mature to form polarized and functional monolayers surrounding a lumen and have the ability to produce milk proteins. These structures develop an axis of apico-basal polarity, subsequently become unresponsive to proliferative signals, and finally a bona fide lumen is formed by cavitation, involving the removal of centrally localized cells via multiple cell death processes. Lumen formation is associated with the selective apoptosis of centrally located cells. Autophagy, which is a process responsible for maintaining cell homeostasis, also seems to be crucial in mammary gland development and remodeling. This review describes the role of autophagy in the formation of acinar structures by mammary epithelial cells. Studies on MECs from different species (human, mouse, cow) cultured on MatrigelTM have shown the protective role of autophagy in centrally located cells of
differentiating mammospheres. Autophagy seems to be the cells first response to the lack of contact with ECM, which in consequence leads to apoptotic cell death, anoikis, and lumen formation in developing alveoli.
Keywords: autophagy, apoptosis, mammary gland, three-dimensional cell culture
*) Badania finansowane ze rodków projektu badawczego MNiSW nr
b³onach autofagosomów (29). Tanida i wsp. (41), wy-korzystuj¹c taki konstrukt, wykazali punktow¹ loka-lizacjê wiecenia GFP w komórce podczas g³odu ko-mórkowego, co wskazujê, ¿e jest to dobra i precyzyj-na metoda identyfikacji autofagii w komórce. Z kolei drugi molekularny wskanik autofagii czyli beklina1 jest niezbêdna w transporcie wakuolarnym (23) oraz uczestniczy w formowaniu kompleksu z kinaz¹ 3-fos-fatydyloinozytolu klasy III (PI3K klasy III), bior¹c¹ udzia³ w powstawaniu autofagosomów. Bierze rów-nie¿ udzia³ w sekwestracji materia³u cytoplazmatycz-nego do wakuoli autofagicznych (15, 36). Zahamowa-nie aktywnoci PI3K klasy III przez 3-metyloadeninê (3-MA) prowadzi do zahamowania autofagii w komór-ce (2). Liang i wsp. (23) wykazali, ¿e beklina 1 od-dzia³ywuje tak¿e z bia³kiem Bcl-2, co sugeruje jej rolê w kontrolowaniu procesu apoptozy. Kolejne bia³ka z rodziny ATG (Atg3, Atg4, Atg5, Atg7, Atg8, Atg10, Atg12 i Atg16) odgrywaj¹ równie¿ istotn¹ rolê w ko-mórce, gdy¿ s¹ odpowiedzialne za tworzenie auto-fagosomów oraz spe³niaj¹ wa¿n¹ rolê w rozwoju Ceno-rabditis elegans i Dictyostelium discoideum (27, 35).
Fizjologiczne znaczenie autofagii
Autofagia jest procesem, który umo¿liwia prze¿y-cie komórek w organizmie wielokomórkowym poprzez regulowanie homeostazy komórkowej na drodze kil-ku mechanizmów, tj.: umo¿liwia utrzymanie metabo-lizmu komórkowego na sta³ym poziome poprzez do-starczanie sk³adników od¿ywczych i energii komór-kom nara¿onym na stres oraz g³ód przez degradacjê bia³ek komórkowych o d³ugim okresie pó³trwania; umo¿liwia degradacjê tzw. toksycznych bia³ek; chro-ni komórki przed stresem oksydacyjnym poprzez usu-wanie uszkodzonych mitochondriów, peroksysomów oraz regulacjê wielkoci siateczki ródplazmatycznej (33); uczestniczy w przebudowie komórek na etapie ró¿nicowania i rozwoju tkanek oraz narz¹dów p³odu; umo¿liwia utrzymanie w¹trobowej homeostazy przez konstytutywn¹ autofagiê, tj. niezale¿n¹ od g³odzenia (26); umo¿liwia prezentowanie antygenów MHC kla-sy II w komórkowej obronie przeciw niektórym pato-genom np. Streptococcus (36). Wymienione funkcje wiadcz¹ o istotnej roli autofagii w kontroli wielu pro-cesów fizjologicznych komórki. Sama autofagia jest kontrolowana przez cie¿kê sygna³ow¹ poredniczo-n¹ przez kinazê mTOR (mammalian target of rapamy-cin) (3, 30). cie¿ka ta, z udzia³em PI3 kinazy/PKB/ mTOR, jest niezbêdna w proliferacji, prze¿yciu i mi-gracji komórek. Zablokowanie jej aktywnoci z wy-korzystaniem farmakologicznego, specyficznego inhi-bitora mTOR, jakim jest rapamycyna, która zahamo-wuje fosforylacjê mTOR, prowadzi do nasilenia pro-cesu autofagii (38). Z kolei Debnath i wsp. (7) w ba-daniach in vitro nad morfogenez¹ pêcherzyków wy-dzielniczych gruczo³u mlekowego wykazali, i¿ ci¹g³a aktywacja PKB powoduje tworzenie du¿ych, bez-kszta³tnych struktur w wyniku utrzymuj¹cej siê
akty-wacji proliferacji komórek nab³onkowych. Zastosowa-nie rapamycyny powodowa³o tworzeZastosowa-nie Zastosowa- nieprawid³o-wych struktur pêcherzykonieprawid³o-wych, co wiadczy o istot-nej roli kinazy mTOR w odbieraniu sygna³ów przeka-zywanych przez aktywn¹/fosforylowan¹ formê kina-zy PKB. W warunkach fizjologicznych kinaza mTOR jest równie¿ wy³¹czana podczas g³odu komórkowego, co prowadzi do nasilenia autofagii, natomiast jest ona aktywowana w komórkach dobrze od¿ywionych oraz pod wp³ywem czynników wzrostu IGF-I i EGF, co z kolei prowadzi do zahamowania procesu autofagii (22).
Rola autofagii w przebudowie gruczo³u mlekowego Przebudowa gruczo³u mlekowego jest procesem fiz-jologicznym, zwi¹zanym z panuj¹c¹ tam dynamiczn¹ równowag¹ pomiêdzy dwoma jednoczenie zachodz¹-cymi procesami mitozy i programowanej mierci ko-mórek nab³onka gruczo³u mlekowego. Podczas roz-woju gruczo³u, w okresie ci¹¿y nastêpuje wzmo¿ona proliferacja komórek macierzystych nab³onka. Ponadto dochodzi do ich ró¿nicowania, wyd³u¿ania, rozga³ê-ziania przewodów mlekowych, wzrostu liczby pêche-rzyków wydzielniczych oraz powstawania typowej zrazikowo-pêcherzykowej struktury narz¹du. Badania naszego zespo³u jako pierwsze wykaza³y istotn¹ rolê autofagii w fazie zasuszania gruczo³u mlekowego u byd³a. W okresie inwolucji tkanka gruczo³owa wy-kazuje charakterystyczne cechy morfologiczne (obec-noæ wakuoli autofagicznych w komórkach) i bioche-miczne (wzrost poziomu LC3-II i bekliny1) autofagii w komórkach nab³onka gruczo³u sutkowego byd³a (42). Nasze obserwacje uzyskane w dowiadczeniach ex vivo zosta³y równie¿ potwierdzone w dowiadcze-niach in vitro na komórkach nab³onka gruczo³u mle-kowego byd³a linii BME-UV1 (9, 32). Nasilona auto-fagia podczas inwolucji jest mechanizmem obrony ko-mórek gruczo³u mlekowego w odpowiedzi na deficyt substancji od¿ywczych, bioaktywnych oraz ekspozy-cji na dzia³anie czynników indukuj¹cych apoptozê, tj.: TGF-â1, FIL, IGFBPs (31). Dalsze badania wykaza³y równie¿, i¿ czynniki wzrostu IGF-I, EGF oraz ich kom-binacja znosz¹ efekt autofagiczny w komórkach na-b³onka gruczo³u mlekowego linii BME-UV1, hodo-wanych w warunkach g³odu komórkowego. Hamuj¹-ce dzia³anie wymienionych czynników mo¿e zostaæ zniesione przy zastosowaniu rapamycyny. Wskazuje to na istotn¹ rolê kinazy mTOR jako molekularnego prze³¹cznika w cie¿kach sygna³owych zale¿nych od IGF-I i EGF. W naszych badaniach efekt g³odu ko-mórkowego zosta³ wywo³ywany przez redukcjê stê-¿enia p³odowej surowicy bydlêcej w po¿ywce, ze stan-dardowego 10% (niezbêdnego do prawid³owego wzro-stu) do 0,5%. Taki model dowiadczalny nazwalimy modelem inwolucji in vitro, poniewa¿ naladowa³ on ograniczenie poda¿y substancji od¿ywczych oraz bio-logicznie aktywnych w gruczole mlekowym podczas zasuszania. Aby jeszcze bardziej upodobniæ ten
mo-del inwolucji in vitro do warunków fizjologicznych wystêpuj¹cych w organizmie ciê¿arnej samicy, do po-¿ywki hodowlanej, ubogiej w FBS, dodane zosta³y ste-roidy p³ciowe (17-â estradiol oraz progesteron). Uza-sadnieniem tego dowiadczenia by³ fakt, i¿ koñcowy okres ci¹¿y u krów pokrywa siê z faz¹ zasuszania gru-czo³u mlekowego. Badania te wykaza³y, i¿ obydwa stosowane hormony steroidowe zwiêkszaj¹ poziom LC3-II w komórkach nab³onka gruczo³u mlekowego krów linii BME-UV1, jednak¿e mechanizm tego od-dzia³ywania na poziomie molekularnym pozostaje nie-znany (10, 31, 36).
Znaczenie autofagii w procesie mammogenezy Rozwój gruczo³u mlekowego krów i pe³nienie przez niego funkcji wydzielniczych s¹ regulowane przez interakcje komórek nab³onka gruczo³u z macierz¹ zewn¹trzkomórkow¹ ECM (extracellular matrix). Komórki nab³onka w warunkach in vivo tworz¹ sieæ przewodów mlekononych i pêcherzyków wydzielni-czych otoczonych macierz¹ zewn¹trzkomórkow¹, bo-gat¹ w kolagen i lamininy. Dziêki kontaktowi z ECM komórki wytwarzaj¹ wyspecjalizowane po³¹czenia z otaczaj¹c¹ je b³on¹ podstawn¹, bêd¹c¹ równie¿ for-m¹ macierzy zewn¹trzkomórkowej. Po³¹czenie sygna-³ów pochodz¹cych zarówno z oddzia³ywañ komórek miêdzy sob¹, jak i z macierz¹ zewn¹trzkomórkow¹ jest czynnikiem koniecznym w regulacji wielu cie¿ek syg-na³owych niezbêdnych m.in. do proliferacji, ró¿nico-wania, adhezji, polarnoci i prze¿ycia (14, 24).
Komórki nab³onka gruczo³u mlekowego hodowane w klasycznych hodowlach in vitro rosn¹ w postaci jed-nej warstwy i nie wykazuj¹ typowej polaryzacji szczy-towo-podstawnej. Jednak¿e po wysianiu na pod³o¿e zawieraj¹ce sk³adniki ECM przechodz¹ one zmiany morfogenetyczne, co powoduje utworzenie bieguno-wo spolaryzowanych struktur pêcherzykowych nazwa-nych mammosferami, które s¹ morfologicznie zbli¿o-ne do pêcherzyków mlekowych wystêpuj¹cych w gru-czole (6). Czynnikiem niezbêdnym do utworzenia w³aciwych, spolaryzowanych i funkcjonalnych mam-mosfer w warunkach in vitro jest obecnoæ sk³adni-ków b³ony podstawnej, takich jak: lamininy, kolagen typu IV czy entaktyna oraz obecnoæ hormonów lak-togennych. Tego typu pod³o¿e dostêpne jest komer-cyjnie pod nazw¹ MatrigelTM i zawiera bia³ka
macie-rzy zewn¹trzkomórkowej wyizolowane z mysiego miêsaka EngelbrethaHolmaSwarma (EHS) (16). Komórki hodowane na Matrigelu tworz¹ po³¹czenia z laminin¹ za porednictwem wytwarzanych przez siebie powierzchniowych receptorów integrynowych zlokalizowanych w czêci podstawnej b³ony komór-kowej. Integryny dzia³aj¹ jako komórkowe transb³o-nowe ³¹czniki porednicz¹ce w interakcjach miêdzy cytoszkieletem i ECM, przez co reguluj¹ kszta³t, ruch i przekazuj¹ komórce sygna³y niezbêdne do prze¿y-cia (1, 12, 19). Mo¿na równie¿ zauwa¿yæ, i¿ hodowle pierwotne komórek nab³onka gruczo³u mlekowego na
sk³adnikach ECM wykazuj¹ znaczn¹ ekspresjê cyto-keratyn 18 i 14, bêd¹cych, odpowiednio, markerami komórek nab³onka wydzielniczego (38) oraz komó-rek miêniowo-nab³onkowych i wykazuj¹ ekspresjê bia³ek mleka: â-kazeiny, á-laktoalbuminy i â-laktoglo-buliny w obecnoci hormonów laktogennych (37).
Komórki tworz¹ce mammosfery pocz¹tkowo ule-gaj¹ podzia³om, tworz¹c ma³e agregaty, przechodz¹c jednoczenie polaryzacjê szczytowo-podstawn¹. Pro-ces polaryzacji komórek polega na inicjacji wydziela-nia przez czêæ podstawn¹ komórki sk³adników b³ony podstawnej, lokalizacji aparatu Golgiego w czêci wierzcho³kowej i wytworzeniu po³¹czeñ miêdzyko-mórkowych w czêci bocznej komórki (boczna loka-lizacja desmosomów i boczno-szczytowa lokaloka-lizacja bia³ek po³¹czeñ cis³ych, jak ZO-1 (zonula occluden), b¹d boczna lokalizacja E-kadheryny) (6, 18).
Najwiecej danych dotycz¹cych wzrostu komórek nab³onka gruczo³u mlekowego na Matrigelu pocho-dzi z dowiadczeñ prowadzonych na komórkach mysich oraz ludzkich. Nasz zespó³ wprowadzi³ model trójwymiarowych (3D) hodowli in vitro do badañ nad procesem mammogenezy u byd³a. Wykazano, i¿ two-rzenie prawid³owo spolaryzowanych struktur pêche-rzykowych przez komórki nab³onka gruczo³u mleko-wego linii BME-UV1, które osi¹gnê³y pe³ne zró¿ni-cowanie, rozpoczyna siê od 6. dnia hodowli komórek na Matrigelu (17, 18). W pierwszych szeciu dniach zaobserwowano wzrost tworz¹cych siê struktur oraz podzia³y komórkowe. W tym czasie wszystkie komórki nab³onkowe tworz¹ce mammosfery posiada³y po³¹cze-nia miêdzykomórkowe, o czym wiadczy lokalizacja markerów polaryzacji komórkowej: E-kadheryny i ZO-1. W kolejnych dniach hodowli zaobserwowano ró¿nicowanie siê komórek, ich stopniow¹ polaryzacjê oraz postêpuj¹c¹ eliminacjê komórek znajduj¹cych siê w wietle pêcherzyka. W 16. dniu hodowli barwienie przeciwko E-kadherynie wykazywa³o jedynie pojedyn-cz¹ warstw¹ komórek okalaj¹cych wiat³o pêcherzy-ka, a ZO-1 zlokalizowane by³o w szczytowej czêci komórek tworz¹cych mammosfery, co w pe³ni potwier-dza prawid³owoæ rozwijaj¹cych siê struktur (ryc. 1a) (17). Inni badacze uzyskali podobne tempo tworzenia struktur pêcherzykowych in vitro. Komórki ludzkiej linii MCF-10A do pe³nej polaryzacji i zró¿nicowania potrzebuj¹ oko³o 2 tygodni (5), za mysia linia HC11 tworzy³a w pe³ni spolaryzowane mammosfery w ci¹-gu 10 dni (42).
Po pierwszym okresie tworzenia struktur pêcherzy-kowych przez komórki nab³onka gruczo³u dochodzi do wyjcia komórek z cyklu komórkowego i oczysz-czenia siê wiat³a utworzonej mammosfery poprzez szczególny rodzaj apoptozy (anoikis) komórek, które nie maj¹ bezporedniego kontaktu z pod³o¿em. Bada-nia wykaza³y, ¿e anoikis silnie wzbudza autofagiê (5, 39). W tym okresie w komórkach zlokalizowanych centralnie w mammosferach wzrasta ekspresja aktyw-nej formy kaspazy-3 (ryc. 1b, d), co potwierdza rolê
apoptozy w tworzeniu siê wiat³a mammosfer (5, 11), jednak¿e zablokowanie apoptozy (z wykorzystaniem bia³ka antyapoptotycznego bcl-2 czy bcl-xL) opónia jedynie o kilka dni tworzenie siê wiat³a powsta³ej mammosfery. Sugeruje to, i¿ komórki po³o¿one cen-tralnie w tworz¹cych siê strukturach, wykazuj¹ce nad-ekspresjê bia³ka bcl-2 mog¹ byæ eliminowane na dro-dze alternatywnej do apoptozy mierci autofagicznej (4). Wykazano równie¿, i¿ TRIAL (tumor necrosis
factor related apoptosis indu-cing ligand) indukuje autofagiê w komórkach nab³onkowych rosn¹cych w hodowlach 3D, jednak w kombinacji z Bcl-xL powoduje zahamowanie roz-woju mammosfer, co sugeruje, ¿e to apoptoza jest odpowie-dzialna za oczyszczanie siê wiat³a mammosfer z komórek (27). W tym przypadku auto-fagiê nale¿y traktowaæ raczej jako reakcjê obronn¹ komórki w warunkach braku kontaktu ze sk³adnikami ECM. Debnath i Mills (5, 28), zaobserwowali pojawienie siê w obrazie z mi-kroskopu elektronowego licz-nych autofagiczlicz-nych wakuoli w centralnie po³o¿onych ko-mórkach rozwijaj¹cych siê mammosfer. Równie¿ dowiad-czenia prowadzone na komór-kach bydlêcej linii BME-UV1 rosn¹cych w hodowlach 3D wykaza³y obecnoæ autofagii w komórkach zlokalizowanych w centralnej czêci tworz¹cych siê mammosfer (ryc. 1b) (ba-dania w³asne). W celu precy-zyjnej lokalizacji autofagii w mammosferach wykorzys-talimy konstrukt LC3 z bia³-kiem zielonej fluorescencji GFP (green fluorescence prote-in), dziêki któremu mo¿na zlo-kalizowaæ komórki o aktyw-nym procesie autofagii na pod-stawie kumulacji punktowego wiecenia GFP w strukturze pê-cherzykowej (ryc. 1b). Dodat-kowo o aktywacji autofagii podczas tworzenia mammosfer wiadczy wzrost poziomu ak-tywnej formy bia³ka LC3 (LC3II) od 6. dnia hodowli ko-mórek BME-UV1 na pod³o¿u Matrigel (ryc. 1c) (badania w³asne). Wynika z tego, ¿e ak-tywacja procesu autofagii rozpoczyna siê w momen-cie, gdy zewnêtrzna warstwa komórek wykazuje pra-wid³ow¹ polaryzacjê szczytowo-podstawn¹, za ko-mórki znajduj¹ce siê wewn¹trz struktury pêcherzyko-wej powoli trac¹ kontakt z pod³o¿em. Jednoczenie zaobserwowano wzrost iloci aktywnej formy kas-pazy-3 w kolejnych dniach hodowli. Apoptoza po-dobnie jak autofagia zlokalizowana by³a w centralnie po³o¿onych komórkach mammosfer (ryc. 1b, d). Tak
Ryc. 1. Rola apoptozy i autofagii podczas tworzenia siê wiat³a mammosfer linii BME--UV1 w 16. dniu hodowli. (a) boczna lokalizacja E-kadheryny w komórkach, wiadcz¹-ca o prawid³owym tworzeniu siê mammosfer; (b) apoptoza zielone barwienie dotyczy aktywnej formy kaspazy-3 jako markera apoptozy, zlokalizowanej w centrum mam-mosfery; j¹dra wybarwiono 7-aktynomycyn¹ D (7-AAD); autofagia GFP-LC3 zielo-ne barwienie zlokalizowazielo-ne w centrum mammosfery jako marker autofagii; (c i d) ana-liza Western-blot dla aktywnej formy kaspazy-3 oraz LC3 w mammosferach hodowa-nych przez 16 dni. Wykres prezentuje intensywnoæ obu procesów w tworz¹cych siê mammosferach w przeliczeniu na bia³ko referencyjne, jakim jest GAPDH
wytworzone mammosfery zdolne s¹ do ekspresjono-wania bia³ek mleka.
Najnowsze badania Funga i wsp. (8) wskazuj¹, i¿ obecnoæ autofagicznych wakuoli w komórkach cen-tralnie zlokalizowanych w mammosferach jest mecha-nizmem obronnym, nie za prowadz¹cym do mierci komórek, poniewa¿ ³agodzi stres wywo³any brakiem kontaktu komórek z ECM. W celu potwierdzenia tej tezy badacze zastosowali 3-MA (3-metyloadeninê inhibitor tworzenia autofagosomów, poprzez zahamo-wanie aktywnoci PI3K), co wzmog³o intensywnoæ apoptozy w tych komórkach. Dodatkowo znokauto-wanie genów atg5 i atg7 (koduj¹ bia³ka odpowiedzial-ne za tworzenie autofagosomów) spowodowa³o rów-nie¿ wzrost intensywnoci apoptozy w komórkach li-nii MCF-10A. Wyniki tych badañ wskazuj¹ zatem na rolê autofagii jako mechanizmu przetrwania komórek, a nie ich degradacji, jednak mechanizm tego procesu jest nadal s³abo poznany. Wykorzystuj¹c model trój-wymiarowy udowodniono równie¿, i¿ stransformowa-ne mysie komórki nab³onkowe linii E1A, które nie po-siadaj¹ jednego allelu dla genu koduj¹cego beklinê 1, wykazywa³y szybsze tworzenie siê wiat³a mammo-sfer w porównaniu do kontrolnych komórek (13). Jest to kolejny dowód na wa¿n¹ ochronn¹ rolê autofagii w mammogenezie gruczo³u sutkowego.
Jak wspomniano wczeniej, w³aciwy rozwój i prze-¿ycie komórek w mammosferach zale¿ne s¹ od pra-wid³owego kontaktu komórek z ECM, co z kolei zale-¿y od bia³ek powierzchniowych, jakimi s¹ integryny. Autofagia jest równie¿ procesem zale¿nym od tych re-ceptorów. Zablokowanie funkcji jednej z podjednostek integrynowych integryny â1 jest wystarczaj¹ce, by wzbudziæ autofagiê, o czym wiadczy pojawienie siê autofagosomów w komórkach maj¹cych kontakt z ECM (4). Lock i wsp. (25) sugeruj¹, i¿ w wyniku utraty kontaktu komórek z ECM dochodzi do aktywa-cji autofagii jako procesu chroni¹cego komórki przed stresem. Wyró¿niono trzy g³ówne szlaki zwi¹zane z aktywacj¹ autofagii w komórkach nie maj¹cych kon-taktu z macierz¹ zewn¹trzkomórkow¹: cie¿kê zale¿-n¹ od dostêpnoci sk³adników pokarmowych i czyn-ników wzrostu, cie¿kê zale¿n¹ od dostêpnoci ener-gii w komórce oraz cie¿kê zwi¹zan¹ z warunkami stresowymi, tzw. ISR (integrated stress response). W wyniku braku kontaktu centralnie po³o¿onych ko-mórek z ECM dochodzi do zablokowania cie¿ki zwi¹-zanej z aktywnoci¹ receptorów dla czynników wzro-stu, np. EGFR, co powoduje zablokowanie cie¿ek sygna³owych zale¿nych od nich, np. kinazy mTOR. Zablokowanie kinazy mTOR powoduje aktywacjê autofagii. Autofagia jest równie¿ regulowana w odpo-wiedzi na czynniki stresowe. Fosforylacja eukariotycz-nego czynnika eIF2á w pozycji seryny 51 powoduje aktywacjê cie¿ki IRS poprzez zablokowanie trans-lacji bia³ek. W tym momencie, jak i podczas stresu energetycznego w komórce, autofagia dostarcza pros-tych sk³adników od¿ywczych powstaj¹cych w
wyni-ku degradacji sk³adników komórkowch. Powsta³e sk³adniki s¹ wykorzystywane do produkcji nowych bia³ek i umo¿liwiaj¹ wytwarzanie ATP w komórce. W odpowiedzi komórki na czynnik stresowy autofa-gia powoduje wyrównanie poziomu ATP w komórce (24). W zwi¹zku z tym w mammosferach autofagia jest traktowana jako proces chroni¹cy komórki przez apoptoz¹ i jest procesem poprzedzaj¹cym apoptozê. Debnath i wsp. (4) wykazali, i¿ zahamowanie auto-fagii z wykorzystaniem zwi¹zków chemicznych, np. 3-MA, powoduje wczeniejsze pojawienie siê apop-tozy. Na tej podstawie mo¿na postawiæ hipotezê, i¿ autofagia jest procesem umo¿liwiaj¹cym obronê ko-mórek przed anoikis. Podobny efekt uzyskano tak¿e w mysich komórkach nab³onkowych rosn¹cych w ho-dowli 3D, nie posiadaj¹cych jednego allelu dla bek-liny 1 o genotypie beklina+/. W komórkach tych
do-chodzi³o do szybszego tworzenia siê wiat³a mammo-sfer w porównaniu z komórkami dzikimi (4).
Podsumowuj¹c, nale¿y wnioskowaæ o wspó³zale¿-nociach autofagii i apoptozy w tworzeniu wiat³a pêcherzyków wydzielniczych w gruczole sutkowym. Autofagia pojawia siê jako pierwsza w centralnie po-³o¿onych komórkach, chroni je przed stresem wywo-³anym brakiem kontaktu komórek z ECM i poprzedza apoptozê. Brak kontaktu z ECM kreuje stan, w któ-rym komórki nie otrzymuj¹ odpowiednich sygna³ów ¿yciowych, co powoduje indukcjê autofagii jako me-chanizmu mobilizuj¹cego rezerwy aminokwasowe i energetyczne, szczególnie w obliczu nasilenia wp³y-wu czynników stresowych o dzia³aniu apoptotycznym. Dopiero w kolejnym etapie rozwoju struktur pêche-rzykowych pojawia siê apoptoza, powoduj¹c mieræ komórek, w celu oczyszczenia wiat³a struktur. Tak wiêc w tworzeniu pêcherzyków wydzielniczych w gru-czole mlekowym istotn¹ rolê ogrywa zarówno apop-toza, jak i autofagia.
Pimiennictwo
1.Boudreau N., Sympson C. J., Werb Z., Bissell M. J.: Suppression of ICE and apoptosis in mammary epithelial cells by extracellular matrix. Science 1995, 267, 891-893.
2.Bursch W.: The autophagosomal-lysosomal compartment in programmed cell death. Cell Death Differ. 2001, 8, 569-581.
3.Cuervo A. M.: Autophagy: in sickness and in health. Trends Cell Biol. 2004, 14, 70-77.
4.Debnath J.: Detachment-induced autophagy during anoikis and lumen formation in epithelial acini. Autophagy 2008, 4, 352-35.
5.Debnath J., Mills K. R., Collins N. L., Reginato M. J., Muthuswarny S. K., Brugge J. S.: The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene expressing mammary acini. Cell 2002, 111, 29-40.
6.Debnath J., Muthuswamy S. K., Brugge J. S.: Morphogenesis and onco-genesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods 2003, 30, 256-268.
7.Debnath J., Walker S. J., Brugge J. S.: Akt activation disrupts mammary acinar architecture and enhances proliferation in an mTOR-dependent manner. J. Cell Biol. 2003, 163, 315-326.
8.Fung Ch., Lock R., Gao S., Salsa E., Debnath J.: Induction of autophagy during extracellular matrix detachment promotes cell survival. Mol. Biol. Cell. 2008, 19, 797-806.
9.Gajewska M., Gajkowska B., Motyl T.: Apoptosis and autophagy induced by TGF-â1 in bovine mammary epithelial BME-UV1 cells. J. Physiol. Phar-macol. 2005, 56, 143-157.
10.Gajewska M., Gajkowska B., Sobolewska A., Motyl T.: Autofagia w prze-budowie gruczo³u mlekowego byd³a. Medycyna Wet. 2007, 63, 1412-1416. 11.Gajewska M., Sobolewska A., Kozlowski M., Motyl T.: Role of autophagy in mammary gland development. J. Physiol. Pharmacol. 2008, 59, 237-249. 12.Gilmore A. P., Metcalfe A. D., Romer L. H., Struli C. H.: Integrin mediated survival signals regulates the apoptotic function of Bax through its confor-mation and subcellular localization. J. Cell. Biol. 2000, 149, 431-446. 13.Karantza-Wadsworth V., Patel S., Kravchuk O., Chen G., Mathew R., Jin S.,
White E.: Autophagy mitigates metabolic stress and genome damage in mammary tumorigenesis. Genes Dev. 2007, 21, 1621-1635.
14.Katz E., Streuli C. H.: The extracellular matrix as an adhesion checpoint for mammary epithelial function. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2007, 39, 715-726. 15.Kihara A., Kabeya Y., Ohsumi Y., Yoshimori T.: Beclin-phosphatidylinositol 3 - kinase complex functions at the trans-Golgi network. EMBO Rep. 2001, 2, 330-335.
16.Kleinman H. K., Martin G. R.: Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Semin. Cancer Biol. 2005, 15, 378-386.
17.Koz³owski M., Gajewska M., Majewska A., Jank M., Motyl T.: Differences in growth and transcriptomic profile of bovine mammary epithelial monolayer and three-dimensional cell cultures. J. Physiol. Pharmacol. 2009, 1, 5-14. 18.Koz³owski M., Motyl T.: Zastosowanie technik hodowli przestrzennych (3D)
w badaniach biologii gruczo³u mlekowego byd³a. Medycyna Wet. 2007, 63, 1417-1420.
19.Kuma A., Matsui M., Mizushima N.: LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy 2007, 3, 323-328. 20.Larsen M., Artym V. V., Green A., Yamada K. M.: The matrix reorganized:
extracellular matrix remodeling and integrin signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 2006, 18, 463-471.
21.Lemasters J. J., Qian T., He L., Kim J. S., Elmore S. P., Cascio W. E., Brenner D. A.: Role of mitochondrial inner membrane permeabilization in necrotic cell death, apoptosis and autophagy. Antioxid. Redox. Signal. 2002, 4, 769-781.
22.Levine B., Klionsky D. J.: Development by self-digestion: molecular mecha-nisms and biological functions of autophagy. Develop. Cell 2004, 6, 463--477.
23.Liang X. H., Kleeman L. K., Jiang H. H., Gordon G., Goldman J. E., Berry G., Herman B., Levine B.: Protection against fatal Sindbis virus ence-phalitis by beclin, a novel Bcl-2-interacting protein. J. Virol. 1998, 72, 8586--8596.
24.Lin C. Q., Bissell M. J.: Multi-faceted regulation of cell differentation by extracellular matrix. FASEB J. 1993, 7, 737-743.
25.Lock R., Debnath J.: Extracellular matrix regulation of autophagy. Cur. Opin. Cell Biol. 2008, 20, 583-588.
26.Meijer A., Codogno P.: Regulation and role of autophagy in mammalian cells. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004, 36, 2445-2462.
27.Melendez A., Talloczy Z., Seaman M., Eskelinen E.-L., Hall D. H., Levine B.: Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans. Science 2003, 301, 1387-1391.
28.Mills K. R., Reginato M., Debnath J., Queenan B., Brugge J. S.: Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) is required for induction of autophagy during lumen formation in vitro. PNAS 2004, 101, 3438-3443.
29.Mizuchima N.: Methods for monitoring autophagy. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004, 36, 2491-2502.
30.Moore M. N., Allen J. I., Somerfield P. J.: Autophagy: role in surviving environmental stress. Mar. Environ. Res. 2006, 62, 420-425.
31.Motyl T., Gajewska M., Zarzynska J., Sobolewska A., Gajkowska B.: Regu-lation of autophagy in bovine mammary epithelial cells. Autophagy 2007, 3, 484-486.
32.Motyl T., Gajkowska B., Zarzyñska J., Gajewska M., Lamparska-Przybysz M.: Apoptosis and autophagy in mammary gland remodeling and breast cancer chemotherapy. J. Physiol. Pharmacol. 2006a, 57, 17-32.
33.Ogier-Denis E., Codogno P.: Autophagy.: a barrier or an adaptive response to cancer. Biochimica and Biophysica Acta. 2003, 1603, 113-128. 34.Ohsumi Y.: Molecular dissection of autophagy: two ubiquitin-like systems.
Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2001, 2, 211-216.
35.Otto G. P., Wu M. Y., Kazgan N., Anderson O. R., Kessin R. H.: Macroauto-phagy is required formulticellular development of the social amoeba Dictyo-stelium discoideum. J. Biol. Chem. 2003, 278, 17636-17645.
36.Pattingre S., Espert L., Biard-Piechaczyk M., Codogno P.: Regulation of macroautophagy by mTOR and beclin 1 complex. Biochimie 2008, 90, 313--323.
37.Rocha V., Hwang S., Ortiz C. L.: Casein secretion by mammary gland epithelia from collagen gel cultures and lactating glans. J. Cell. Physiol. 2005, 12, 343-348.
38.Schweizer J., Bowden P. E., Coulombe P. A., Langbein L., Lane E. B., Magin T. M., Maltais L., Omary M. B., Parry D. A., Rogers M. A.: New consensus nomenclature for mammalian keratins. J. Cell Biol. 2006, 174, 169-174.
39.Shaw K. R., Wrobel C. N., Brugge J. S.: Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithe-lial morphogenesis. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia 2004, 9, 297-310. 40.Sobolewska A., Gajewska M., Zarzynska M., Gajkowska B., Motyl T.: IGF-I,
EGF, and sex steroids regulate autophagy in bovine mammary epithelial cells via the mTOR pathway. Eur. J. Cell Biol. 2009, 88, 117-130.
41.Tanida I., Ueno T., Kominami E.: LC3 conjugation system in mammalian autophagy. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004, 36, 2503-2518.
42.Xian W., Schwertfeger K. L., Vargo-Gogola T., Rosen J. M.: Pleiotropic effects of FGFR1 on cell proliferation, survival, and migration in a 3D mam-mary epithelial cell model. J. Cell Biol. 2005, 171, 663-673.
43.Zarzynska J., Gajkowska B., Wojewódzka U., Dymnicki E., Motyl T.: Apoptosis and autophagy in involuting bovine mammary gland is accompa-nied by up-regulation of TGF-b1 and suppression of somatotropic pathway. Polish J. Vet. Sci. 2007, 10, 1-9.
Adres autora: mgr Agnieszka Sobolewska, ul. Nowoursynowska 159, 02-776 Warszawa; e-mail: sobolewskaa@interia.pl
