Medycyna Wet. 2009, 65 (5) 340
Praca oryginalna Original paper
Rozpoznawaniu chorób nowotworowych u zwierz¹t powiêca siê nieco mniej uwagi ni¿ u ludzi, ale prowa-dzone w tym zakresie badania s¹ ostatnio bardzo inten-sywne. Zmusi³y do tego straty ekonomiczne, jakie po-wstaj¹ z powodu chorób nowotworowych w hodow-lach zwierz¹t oraz coraz wiêksze oczekiwania w³aci-cieli dotycz¹ce nie tylko rozpoznania choroby, ale rów-nie¿, w miarê mo¿liwoci, jej skutecznego leczenia.
Najwiêksze straty powoduj¹ choroby nowotworowe drobiu i byd³a, np. enzootyczna bia³aczka byd³a podle-gaj¹ca ustawowemu zwalczaniu. Natomiast w prakty-ce lekarsko-weterynaryjnej w miastach problem doty-czy g³ównie psów i kotów. Wydaje siê, ¿e wzrastaj¹ca liczba stwierdzanych wród zwierz¹t nowotworów jest zwi¹zana z jednej strony ze zwiêkszon¹ wykrywalno-ci¹ tych chorób, z drugiej za ze stale wzrastaj¹c¹ liczb¹ czynników karcinogennych w rodowisku, na przyk³ad herbicydów na bazie kwasu fenoksyoctowe-go, na które s¹ nara¿eni zarówno ludzie, jak i zwierzêta (8, 15).
U psów najczêciej wystêpuj¹cymi nowotworami wywodz¹cymi siê z tkanki krwiotwórczej s¹ ch³oniaki. Ch³oniak z³oliwy (lymphoma malignum) oznacza roz-rost nowotworowy z limfocytów, niezale¿nie od umiejs-cowienia pierwotnego procesu nowotworowego (w wêz-³ach ch³onnych, ledzionie, grasicy, nieotorbionych grudkach ch³onnych, a nawet tam, gdzie fizjologicznie nie istniej¹ skupiska tkanki limfatycznej) oraz bez wzglêdu na fenotyp komórek nowotworowych (limfo-cyty B, T, podwójnie pozytywne B i T lub nie-B/nie-T) (25, 39).
Liczba rocznie notowanych nowych przypadków ch³o-niaków u psów w USA wynosi od 13 do 33/100 tys. osobników (15, 21, 22, 31). Szacuje siê, ¿e ryzyko wyst¹pienia ch³oniaka u psa poni¿ej jednego roku ¿y-cia wynosi 1,5/100 tys., za u 10-11-letniego 84/100 tys. osobników (23). Najczêciej opisywane s¹ one u psów w wieku rednim, 6-9 lat (1, 4, 15, 22). Nie obserwuje siê natomiast zwi¹zku czêstoci zachorowa-nia z p³ci¹ (10, 30). Niektóre rasy psów, takie jak: bok-sery, bassety, bernardyny, szkockie teriery, airdale te-riery, buldogi angielskie, dogi niemieckie i dobermany,
Zastosowanie biopsji chirurgicznej wêz³ów ch³onnych
i cytometrii przep³ywowej w rozpoznawaniu
ch³oniaków wieloogniskowych u psów*
)
JACEK MICUÑ, IGOR BISSENIK*, JUSTYNA SOKO£OWSKA****, MAGDALENA ¯MUDZKA, ANNA WINNICKA**, ROMAN LECHOWSKI, EL¯BIETA MALICKA***
Zak³ad Chorób Wewnêtrznych, *Zak³ad Chirurgii Ma³ych Zwierz¹t, **Zak³ad Diagnostyki Laboratoryjnej i Klinicznej, ***Zak³ad Patomorfologii Katedry Nauk Klinicznych, ****Zak³ad Histologii i Embriologii Katedry Nauk Morfologicznych
Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej SGGW, ul. Nowoursynowska 159c, 02-776 Warszawa
Micuñ J., Bissenik I., Soko³owska J., ¯mudzka M., Winnicka A., Lechowski R., Malicka E. Application of surgical biopsy of lymph nodes and flow cytometry
in diagnosing multicentric lymphomas in dogs
Summary
Lymphoma is one of the most common histological types of carcinoma of the bone marrow. The aim of the study was to determine the usefulness of the flow cytometry in diagnosing lymphomas on the basis of the material obtained from lymph nodes by the surgical biopsy in dogs. The material was lymph nodes obtained by surgical biopsy from 33 dogs suffering from multicentric lymphoma. The control group consisted of 4 clinically healthy dogs. The material was submitted to the flow cytometry analysis using the monoclonal antibodies and fluorochromes. The percentage of the CD4+ lymphocytes was lower in the affected animals than in healthy ones. The percentage of CD21-like + lymphocytes was higher in the affected animals than in healthy ones. The percentage of CD5+ and CD8+ was lower than in the healthy dogs. The research demonstrated that determining the fenotype of lymphocytes from lymph nodes in the case of multicentric lymphoma in dogs is an important addition to immunohistochemical methods.
Keywords: dog, lymphoma, chirurgical biopsy, flow cytometry
Medycyna Wet. 2009, 65 (5) 341
z³ote retrievery, chow-chow s¹ szczególnie predyspo-nowane do zachorowania na ch³oniaka (9, 24, 31). Ononis (25) stwierdzi³ zwiêkszon¹ zachorowalnoæ w pewnych liniach ras: rottweiler, bullmastiff i otter-hond. U jamników, cocker spanieli i szpiców pomor-skich choroba spotykana jest doæ rzadko (9, 24, 30, 31).
Klasyfikacja ch³oniaków dokonywana jest na pod-stawie oceny ekspresji cz¹steczek ró¿nicowania limfo-cytów. Do okrelenia fenotypu limfocytów stosowane s¹ dwie uzupe³niaj¹ce siê metody: immunohistoche-miczna i cytometryczna (2, 11, 16). Podstawowym ba-daniem jest okrelenie, z jakich limfocytów B czy T wywodzi siê ch³oniak. Wiêkszoæ wystêpuj¹cych ch³o-niaków, zarówno u ludzi, jak i u psów to B komórkowe (18, 26). U psów odsetek ch³oniaków z limfocytów T waha siê od 10% do 38% i stwierdzenie takiego fenotypu wi¹¿e siê z niekorzystnym rokowaniem (5, 29, 30, 31). Rozpoznawanie ch³oniaka opiera siê na badaniu kli-nicznym oraz badaniach dodatkowych: radiologicznym, laboratoryjnym krwi obwodowej oraz diagnostyce his-topatologicznej. Zwykle podstawê rozpoznania stano-wi ocena materia³u uzyskanego z postano-wiêkszonych wêz-³ów drog¹ biopsji aspiracyjnej cienokoig³owej (BAC) lub metod¹ chirurgiczn¹ (29, 34). W medycynie rozpo-znawanie nowotworów uk³adu limfatycznego opiera siê na badaniu histopatologicznym wêz³a ch³onnego pobra-nego obiema metodami (11). W weterynarii bardzo czê-sto czê-stosuje siê jedynie BAC (5, 14, 35). W przypadku uogólnionego powiêkszenia wêz³ów ch³onnych BAC powinna byæ wykonywana przynajmniej z dwóch ró¿-nych wêz³ów ch³onró¿-nych powierzchowró¿-nych, z wyklu-czeniem, o ile jest to mo¿liwe, wêz³ów ch³onnych zbie-raj¹cych ch³onkê z jamy ustnej, w których stwierdza siê czêsto cechy rozrostu odczynowego (6, 7). Je¿eli powiêkszony jest tylko jeden wêze³ ch³onny, to sposób pobrania materia³u powinien zapewniaæ uzyskanie ma-teria³u do badania histopatologicznego reprezentatyw-nego dla ca³ego narz¹du. W tym celu nale¿y podczas BAC dokonaæ kilku aspiracji materia³u z ró¿nych kie-runków i g³êbokoci wêz³a ch³onnego (6).
W wiêkszoci przypadków badanie cytologiczne po-zwala na odró¿nienie zapalenia wêz³ów ch³onnych od rozrostu odczynowego i rozrostu nowotworowego, a tak¿e przyspiesza rozpoznanie nowotworów z towa-rzysz¹cymi naciekami w wêz³ach (6, 7). Jednak we wczesnych stadiach rozwoju ch³oniaka lub wspó³istnie-niu ch³oniaka z rozrostem odczynowym albo zajêciu wêz³a ch³onnego przez nowotwór postawienie rozpo-znania tylko w oparciu o ocenê materia³u pochodz¹ce-go z BAC jest utrudnione lub niemo¿liwe (29, 35). Autorzy opracowañ podkrelaj¹, ¿e chocia¿ ocena cy-tologiczna materia³u pobranego metod¹ BAC mo¿e byæ wystarczaj¹ca do postawienia rozpoznania, to w ka¿-dym przypadku stwierdzenia ch³oniaka w materiale cy-tologicznym powinna byæ równie¿ wykonana biopsja chirurgiczna wêz³a ch³onnego (6, 11).
W ch³oniaku ródpiersia dodatkowo pobierany jest p³yn z jamy op³ucnej, a w ch³oniaku z naciekiem guza do orodkowego uk³adu nerwowego pomocne jest
ba-danie p³ynu mózgowo-rdzeniowego. Po odwirowaniu materia³ poddawany jest badaniu cytopatologicznemu, a dopiero stwierdzenie komórek ch³oniaka potwierdza rozpoznanie (13).
Podstawowym badaniem pozwalaj¹cym na postawie-nie wstêpnego rozpoznania jest ocena morfologiczna guza na podstawie preparatów barwionych hematoksy-lina-eozyna. Jednak ze wzglêdu na du¿e podobieñstwo miêdzy komórkami ró¿nych typów ch³oniaka, w me-dycynie oraz coraz czêciej w weterynarii niezast¹pio-nym badaniem jest okrelenie fenotypu komórek no-wotworu przy pomocy przeciwcia³ monoklonalnych. Aktualnie liczba przeciwcia³ swoistych dla psów lub wykazuj¹cych wi¹zania krzy¿owe z limfocytami psa jest jednak niewielka, zw³aszcza w porównaniu z zestawa-mi przeciwcia³ monoklonalnych stosowanych u ludzi (4, 15, 27). W dostêpnej literaturze weterynaryjnej nie-wiele jest informacji na temat badañ cytometrycznych w diagnostyce ch³oniaków, a tak¿e brak jest powi¹za-nia wyników badañ immunohistochemicznych z cyto-metrycznymi, co powoduje, ¿e wyniki badania immu-nofenotypu limfocytów z wêz³ów ch³onnych u psów s¹ trudne do interpretacji (2, 11, 37-39).
Celem pracy by³o okrelenie przydatnoci metody cytometrii przep³ywowej w rozpoznawaniu ch³oniaków u psów z materia³u uzyskanego z wêz³ów ch³onnych w wyniku biopsji chirurgicznej.
Materia³ i metody
Materia³em do badañ by³y pobrane chirurgicznie wêz³y ch³onne od trzydziestu trzech chorych psów. W trzydziestu przypadkach pobrano wêz³y ch³onne podkolanowe, w dwóch wêz³y ch³onne pachowe i w jednym przed³opatkowe. Mate-ria³em kontrolnym by³y wêz³y ch³onne pobrane od czterech psów zdrowych.
Pobrania wêz³ów ch³onnych dokonywano w znieczuleniu ogólnym, do którego kwalifikowano pacjentów na podstawie wyników wykonanych wczeniej badañ: morfologicznych krwi i biochemicznych surowicy oraz badañ obrazowych. Zwierzêta przygotowywano wg standardowego schematu, jak do zabiegu chirurgicznego. Farmakologiczne uspokojenie psów uzyskano podaj¹c: medetodyminê (Domitor Orion, Pfizer) w dawce 10-40 µg/kg masy cia³a domiêniowo, bu-torfanol (Butomidor Richter Farma) w dawce 20-40 µg/kg masy cia³a domiêniowo. Tiopental (Thiopental Sandoz) w dawce 5 mg/kg masy cia³a do¿ylnie powodowa³ indukcjê znieczulenia. Do podtrzymania znieczulenia ogólnego u¿y-wano izofluranu (Izofluran Baxter) w stê¿eniu gazu 2-5% podawanego w mieszance z tlenem wziewnie. Pobierano ca³y wêze³ ch³onny wraz z torebk¹ i umieszczano w PBS. Ranê pooperacyjn¹ zszywano dwoma piêtrami szwów tkankê pod-skórn¹ oraz naczynia krwionone szyto nici¹ rozpuszczaln¹ monofilamentow¹ Vicryl 2-0, a skórê szwem prostym przery-wanym z Amifilu 2-0. Po dziesiêciu dniach zdejmowano szwy. Po zabiegu psy otrzymywa³y amoksycylinê o przed³u¿onym dzia³aniu co 48 godzin trzykrotnie oraz mia³y za³o¿ony ko³-nierz chroni¹cy ranê przed lizaniem. Ka¿dy pies po pobraniu wêz³ów ch³onnych otrzymywa³ preparaty uszczelniaj¹ce na-czynia krwionone rutynê oraz wyci¹g z kasztanowca.
Wêze³ ch³onny przygotowywano do badañ dziel¹c wzd³u¿ na po³owê. Jedn¹ czêæ przekazywano do badania
histopato-Medycyna Wet. 2009, 65 (5) 342
logicznego i immunohistochemicznego, a z dru-giej po³owy usuwano resztki t³uszczu oraz to-rebkê, rozdrabniano i przecierano na sitku z PBS. Tak otrzyman¹ zawiesinê wirowano przez 5 mi-nut przy 1200 obr./min. Powsta³y osad zawie-szano w PBS i rozdzielano w iloci 106 µl do probówek cytometrycznych Falcon (USA) do badañ komórkowych.
Do okrelenia sk³adu ilociowego populacji i subpopulacji limfocytów na podstawie danych z pimiennictwa skompletowano zestaw prze-ciwcia³ monoklonalnych przedstawiony w tab. 1. Rozdzia³u leukocytów na populacje
dokony-wano zgodnie z ogólnie przyjêtymi zasadami na podstawie cytogramów (forward scatter FSC/side scatter SSC) i zna-kowanego fikoerytryn¹ (PE) kompleksu ró¿nicowania CD18 (19, 20, 39). Do znakowania limfocytów u¿yto przeciwcia³ monoklonalnych firmy VMRD Inc. Pullman (USA) i fluoro-chromów: PE i fluoresceiny (FITC) skoniugowanych z prze-ciwcia³ami poliklonalnymi: Mouse IgG /H+L/ R-PE i anti-Mouse IgG + IgM /H+L/ FITC. Iloæ przeciwcia³ i fluoro-chromów ustalono we wstêpnym miareczkowaniu. Próbki inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej bez dostêpu wiat³a. Nadmiar przeciwcia³ niezwi¹zanych wyp³u-kiwano przy u¿yciu 2 ml PBS z 10% NaN3, 10 ml mM EDTA i 2% surowic¹ koñsk¹ pozbawion¹ IgG, nastêpnie wirowano przez 5 minut przy 1200 obr./min. Lizy erytrocytów dokony-wano FACS-lysing solution (Becton-Dickinson). B³ony ery-trocytarne oraz uwolnion¹ hemoglobinê wyp³ukiwano PBS, a po odwirowaniu komórki zawieszano w PBS z 1% formali-n¹. Odczytu wyników dokonywano przy u¿yciu cytometru przep³ywowego FACS Calibur i programu Cell Quest (Bec-ton-Dickinson). Wyniki analizy cytometrycznej przedstawio-no w postaci odsetka limfocytów z wêz³ów ch³onnych wyka-zuj¹cych ekspresjê CD5, CD21, CD4 i CD8. Analizê staty-styczn¹ przeprowadzono przy pomocy programu Statistica 6.0. W celu okrelenia istotnoci statystycznej ró¿nic miêdzy red-nimi wartociami poszczególnych parametrów stosowano test Kruskala-Wallisa oraz test U Manna Whitneya. Istotnoæ sta-tystyczn¹ wykazywano dla p £ 0,05.
Wyniki i omówienie
Przeprowadzone badania cytometryczne limfocytów z wêz³ów ch³onnych pobranych metod¹ chirurgiczn¹ od psów z ch³oniakiem wieloogniskowym wykaza³y ni¿-szy odsetek limfocytów pomocniczych CD4+ oraz wy¿-szy odsetek limfocytów CD21-like+ w porównaniu do zdrowych zwierz¹t (tab. 2).
Diagnostyk¹ cytometryczn¹ ch³oniaków u psów w Polsce po raz pierwszy zajmowa³ siê Jagielski (17), badaj¹c subpopulacje limfocytów krwi obwodowej. W wyniku przeprowadzonych obserwacji stwierdzi³, i¿ odsetek limfocytów CD5+, CD4+ i CD8+ psów z ch³o-niakami by³ istotnie ni¿szy, a odsetek limfocytów CD21+ istotnie wy¿szy w porównaniu do psów zdro-wych i psów leczonych lekami cytostatycznymi. W ba-daniach w³asnych, w których materia³em by³y chirur-gicznie pobrane wêz³y ch³onne od chorych psów, zaob-serwowano statystycznie istotnie ni¿szy odsetek limfo-cytów CD4+ psów z ch³oniakiem wieloogniskowym ni¿ u psów zdrowych oraz istotnie wy¿szy odsetek limfo-cytów CD21+ u psów chorych ni¿ u psów zdrowych.
Ponadto stwierdzono ni¿szy odsetek limfocytów CD5+ i CD8+ u psów chorych ni¿ u zdrowych zwierz¹t. Wil-kerson i wsp. (35) badali metod¹ cytometrii przep³y-wowej materia³ uzyskany w wyniku BAC oraz biopsji a k z c e t s ¹ z C a i n a w o c i n ¿ ó r mPorzneockilwocniaal³noe przeczIoiwtycpia³a Koniugatpirzlfueocirwocchiaro³mpoówilklonalnych 8 1 D C BAQ30A IgG1 Ant-iMouseIgG/H+L/R-PE 8 D C CADO46A IgG1 Ant-iMouseIgG/H+L/R-PE 4 D C DH29A IgM Ant-iMouseIgG+IgM/H+L/FITC 5 D C DH13A IgM Ant-iMouseIgG+IgM/H+L/FITC ) e k il -1 2 D C ( 1 B -r C F46A IgG1 Ant-iMouseIgG/H+L/R-PE Tab. 1. Przeciwcia³a monoklonalne (VMRD Inc. Pullman USA) i fluoro-chromy (Medac Niemcy) do immunofenotypowania limfocytów z wêz³ów ch³onnych psów z ch³oniakiem wieloogniskowym
Tab. 2. Odsetek subpopulacji limfocytów z wêz³ów ch³onnych u psów zdrowych i z ch³oniakiem wieloogniskowym
Objanienia: * ró¿nica statystycznie istotna, przy p £ 0,05 wobec grupy psów zdrowych w ó ³ z ê w z y t y c o f m i L h c y n n o ³ h c h c y n n o ³ h c w ó ³ z ê w z k e r ó m o k k e t e s d O ) E S ± x ( , e w o r d z y s p 4 = n psyprzend=le3c7zeniem, + 5 D C 53,70±1,47 50,23±2,34 + 4 D C 46,01±2,57 *38,07±3,14* + 8 D C 15,99±2,41 14,84±2,79 8 D C / 4 D C 14,14±1,76 15,78±1,92 + e k il 1 2 D C 39,08±1,47 *45,17±2,87*
Ryc. 1. Przyk³adowy cytogram limfocytów CD8 + (PE) i CD4+ (FITC) z wêz³a ch³onnego psa zdrowego i psa z ch³oniakiem wieloogniskowym
Medycyna Wet. 2009, 65 (5) 343
tn¹cej od 59 psów. W wyniku przeprowadzonych ba-dañ stwierdzili, ¿e ch³oniaki z limfocytów B (CD79á+ i CD21+) stanowi³y 30 przypadków, ch³oniaki z limfo-cytów T (CD3+CD4+CD8+) rozpoznano u 16 psów, za ch³oniaki o podwójnym fenotypie B i T (CD79á+ CD21+CD3+CD4+CD8+) rozpoznali a¿ u 13 zwierz¹t. W badaniach w³asnych stwierdzono wystêpowanie ch³o-niaków z limfocytów B (CD79á+ i CD21+). W 73% badanych przypadków oraz 27% ch³oniaków z limfo-cytów T (CD3+CD4+CD8+). Clumsee i wsp. (1) bada-li cytometrycznie materia³ z wêz³ów ch³onnych uzyska-ny na drodze BAC od 30 psów i stwierdzili 20 ch³onia-ków B komórkowych (CD79á+) i 10 ch³oniach³onia-ków T ko-mórkowych. Limfocyty ch³oniaków T wykazywa³y eks-presjê CD4, a nie wykazywa³y ekspresji cz¹steczki CD8. We wczeniejszych badaniach Teske i wsp. (33), bada-j¹c materia³ uzyskany metod¹ BAC, oceni³ 34 ch³onia-ki jako T komórkowe: CD4+ w 9 przypadkach, za CD8+ w 8 przypadkach. W immunocytochemicznych badaniach w³asnych otrzymano podobne wyniki, przy czym materia³ uzyskano poprzez biopsjê chirurgiczn¹ wêz³ów ch³onnych. Stwierdzono 9 przypadków ch³o-niaków wieloogniskowych z limfocytów T: w 5 przy-padkach wykazano ekspresjê CD4, a w 4 przyprzy-padkach wykazano ekspresjê CD8. W wyniku przeprowadzo-nych badañ w³asprzeprowadzo-nych potwierdzono wskazywan¹ w pi-miennictwie (29, 35) koniecznoæ uzyskiwania mate-ria³u do badañ immunohistochemicznych i cytometrycz-nych w drodze biopsji chirurgicznej. Materia³ otrzymy-wany w wyniku biopsji chirurgicznej wêz³ów ch³on-nych pozwala na rozpoznanie ch³oniaka we wczesch³on-nych stadiach rozwoju, jak równie¿ przy wspó³istnieniu ch³o-niaka z rozrostem odczynowym lub zajêciu przez no-wotwór ca³ego wêz³a ch³onnego.
Przeprowadzone badania wykaza³y, ¿e cytometrycz-ne fenotypowanie limfocytów z wêz³ów ch³onnych psów z ch³oniakiem wieloogniskowym stanowi cenne uzupe³nienie badañ immunohistochemicznych.
Pimiennictwo
1.Clumsee K., Simon D., Mischke R.: Possibilites of Flow Cytometric Analyssis for Immunophenotypic Characterization of Canine Lymphoma. J. Vet. Med. 2001, 48, 199-206.
2.Czumiñska K., Winnicka A., Malicka E., Lechowski R., Jagielski D., Soko³ow-ska J., Micuñ J., MieczkowSoko³ow-ska J.: Trudnoci diagnostyczne w klasyfikacji ch³o-niaków o nietypowym fenotypie u psów. Medycyna Wet. 2004, 60, 1196-1201. 3.Dobson J. M., Blackwood L. B., McInnes E. F.: Prognostic variables in canine
multicentric lymphosarcoma. J. Small Anim. Pract. 2001, 42, 377-384. 4.Dobson J. M., Blackwood L. B., McInnes E. F., Bostock D. E., Nicholls P.,
Hoather T. M., Tom B. D.: Prognostic variables in canine multicentric lympho-sarcoma. J. Small Anim. Pract. 2001, 42, 377-384.
5.Dzimira S.: Immunocytochemical and cytomorphometric diagnostics of malignant lymphomas in dogs. Biull. Vet. Inst. Pulawy 2007, 51, 71-78. 6.Fournel-Fleury C., Magnol J. P., Bricaire P., Marchal T., Chabanne L.,
Deverdier A., Bryon P. A., Felman P.: Cytohistological and immunological classification of canine malignant lymphomas: comparison with human non Hodgkins lymphomas. J. Comp. Pathol. 1997, 117, 35-59.
7.Fournel-Fleury C., Ponce F., Felman P.: Canine T-cell lymphomas: a morpho-logical, immunomorpho-logical, and clinical study of 46 new cases. Vet. Pathol. 2002, 39, 92-109.
8.Gavazza A., Presiuttini S., Barale R., Lubas G., Gugliucei B.: Association between canine malignant lymphoma, living in industrial areas, and use of chemicals by dog owners. J. Vet. Inter. Med. 2002, 15, 190-195.
9.Gorman N. T.: The Haemolymphatic System, [w:] White R.A.S. (wyd): Manual of Small Animal Oncology. British Small Animal Veterinary Association, Oxford 1991, 207-235.
10.Guija de Arespacochaga A., Schwedendenwein I., Weissenbock H.: Retro-spective study of 82 cases canine lymphoma in Austria based on the Working Formulation and immunophenotyping. J. Comp. Pathol. 2007, 136, 186-192. 11.Harris N. L., Jaffe E. S., Diebold J.: The World Health Organization
classifica-tion of neoplastic disease of the haematopoeitic and lymphoid tissues: Report of the Clinical Advisory Committee Meeting, Airlie House, Virginia, Nov 1997. Histopathology 2000, 36, 69-87.
12.Hawkins E. C, Morrison W. B., DeNicola D. B: Cytologic analysis of broncho-alveolar lavage fluid from 47 dogs with multicenrtic malignant lymphoma. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1993, 203, 1418-1425.
13.Hayes H. M., Tarione R. E., Cantor K. P.: Case-control study of canine malignant lymphoma: positive association with dog owners use of 2,4 dichloro-phenoxyacetic acid herbicides. J. Natl. Cancer. Inst. 1991, 85, 1226-1231. 14.Hildebrand W.: Wykorzystanie badañ laboratoryjnych krwi w diagnostyce
i leczeniu ch³oniaka z³oliwego u psów. Magazyn Wet. 2005, 3, 13-14. 15.Jacobs R. M., Messick J. B., Valli V. E.: Tumors of the haemolymphatic system,
[w:] Meuten D. J. (wyd): Tumors in Domestic Animals. Iowa State Press 2002, 119-144.
16.Jaffe E. S., Harris N. L., Stein H., Vardiman J. M.: World Health Organization Classification of Tumors, Pathology and Genetics of Tumors of Haemapoetic and Lymphoid Tissues. IARC Press, Lyon 2001.
17.Jagielski D.: Epidemiologia, rozpoznawanie i leczenie postaci wieloognisko-wej ch³oniakomiêska psa. Praca dokt., Wydz. Med. Wet. SGGW, Warszawa 2001. 18.Jakóbisiak M.: Populacje i subpopulacje limfocytów, [w:] Go³¹b J., Jakóbisiak M.,
Lasek W. (wyd.): Immunologia. PWN, Warszawa 2002, 94-102.
19.Kluciñski W., Winnicka A., Kawiak J.: Analiza subpopulacji limfocytów krwi obwodowej prze¿uwaczy metod¹ cytometrii przep³ywowej. Medycyna Wet. 1997, 53, 588-591.
20.Kluciñski W., Winnicka A., Lechowski R.: Analiza cytometryczna limfocytów krwi obwodowej kotów. Mat. IX Zjazdu Pol. Tow. Immunologii Dowiadczal-nej i KliniczDowiadczal-nej, Warszawa 16-18.09.1998, s. 23.
21.Lechowski R.: Stê¿enie AFP i CAE w surowicy oraz sk³ad procentowy sub-populacji limfocytów we krwi obwodowej u psów z rozpoznanym ch³oniako-miêsakiem. Mat. 3 sesji nauk., Stan Badañ Naukowych w Weterynarii, Pu³awy 18-19.12.2000, s. 26.
22.MacEwen E. G., Hayes A. A., Mooney S.: Levamisole as adjuvant to chemo-therapy for canine lymphosarcoma. J. Biol. Response Mod. 1985, 4, 427-433. 23.Novotny B. J.: Canine Cancer: An Overview. Canine Cancer, Hills Pet Nutrion,
Topeca 1998, 1-8.
24.Ogilvie G. K., Moore A. S.: Managing the Veterinary Cancer Patient. Veterinary Learning System Co., Inc. Trenton, New Jersey 1996, 228-259.
25.Ononis D. E.: A prospective survey of familial canine lymposacroma. J. Natl. Cancer Inst. 1984, 72, 909-910.
26.Parodi A. L.: Historia i ewolucja zasad klasyfikacji z³oliwych ch³oniaków u zwierz¹t domowych. Magazyn Wet. 2003, 77, 9-13.
27.Ponce F., Magnol J. P., Ledieu D.: Prognostic significance of morfological subtypes in canine malignant lymphomas during chemotherapy. Vet. J. 2004, 167, 158-166.
28.Saba C. F., Thamm D. H., Vali D. M.: Combination chemotherapy with L-asparaginase, Lomustine, and prednicone for relapsed or refractory canine lymphoma. J. Vet. Intern. Med. 2007, 21, 127-132.
29.Soko³owska J.: Aktywnoæ proliferacyjna w ch³oniakach u psów. Praca dokt., Wydz. Med. Wet. SGGW, Warszawa 2005.
30.Sozmen M., Tasca S., Carli E., DeLorenzi D., Furlanello T., Caldin M.: Use of fine needle aspirates and flow cytometry for the diagnosis, classification, and immunophenotyping of canine lymphomas. J. Vet. Diagn. Invest. 2005, 17, 323-330.
31.Teske E.: Canine malignant lymphoma: a review and comparison with human non-Hodkins lymphoma. Vet. Q. 1994a, 16, 209-219.
32.Teske E., Heerde P., Rutterman G. R., Kurzman I. D., Moore P. F., McEwen E. G.: Prognostic factors for treatment of malignant lymphoma in dogs. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1994b, 205, 1722-1728.
33.Teske E., Wisman P., Moore P. F., van Heerde P.: Histologic classification and immunophenotyping of canine non-Hodgkins lyphomas: unexpected high frequency of T cell lymphomas with B cell morphology. Exp. Hematolog. 1994c, 12, 1179-1187.
34.Timothy M., Fan B., Kitchell E.: Obecne i nowe metody rozpoznawania i lecze-nia ch³olecze-niaka u psów. Wet. Dypl. 2003, 4, 25-34.
35.Wilkerson L., Dolce K., Koopman T., Shuman W., Chun L., Garrett L., Barber L., Avery A.: Lineage differentiation of canine lymphoma/leukemias and aberrant expression of CD molecules. Vet. Immunol. Immunopathol. 2005, 106, 179-196. 36.Williams L. E., Broussard M. T., Johnson J. L., Neel J.: Comparison of results of clinicians assessments, cytologic examination of fine-needle lymph node aspirates and flow cytometry for determination of remission status of lymphoma in dogs. J. Am. Vet. Med. Ass. 2005, 226, 562-566.
37.Winnicka A., Jagielski D., Hoffmann-Jagielska M., Lechowski R.: Cytometric evaluation of peripherial blood lymphocytes in dogs with lymphoma during che-motherapy. J. Vet. Med. A. 2002, 42, 303-306.
38.Winnicka A., Jagielski D., Lechowski R.: Cytometric evaluation of peripherial blood in dogs with malignant lymphoma. Cytometry 2000, Suppl. 10, 154. 39.Withrow S. J., MacEwen E. G.: Small Animal Clinical Oncology. Saunders W. B.,
Philadelphia 2001.
Adres autora: lek. wet. Jacek Micuñ, ul. Dzieci Warszawy 27 B m. 76, 02-495 Warszawa; e-mail: jacekmicun@tlen.pl
