Artyku³ przegl¹dowy Review
Reakcja polimeryzacji ³añcuchowej (PCR) (14) od wielu lat uznawana jest za nowy standard wykrywa-nia genów drobnoustrojów, rolin i zwierz¹t. W meto-dzie tej wykorzystuje siê pary oligonukleotydów (star-tery), z których ka¿dy hybrydyzuje do jednej z nici podwójnego ³añcucha DNA, i które ograniczaj¹ frag-ment ulegaj¹cy powieleniu w wyniku cyklicznej reak-cji polimeryzareak-cji (amplifikareak-cji) DNA. Oligonukleoty-dy s¹ substratem dla polimerazy DNA, która na zasa-dzie komplementarnoci dobudowuje do nich kolejne nukleotydy, tworz¹c kopiê nici DNA, z któr¹ zwi¹za³ siê starter. Ca³oæ procesu PCR opiera siê na wielo-krotnym (25-45 cykli) powtarzaniu trzech etapów: de-naturacji (95°C), hybrydyzacji (annealing) (50-65°C) i wyd³u¿ania startera (72°C). W trakcie kolejnych cykli amplifikacji mo¿na wyró¿niæ fazê logarytmicz-n¹, w trakcie której w warunkach idealnych dochodzi do podwajania siê liczby kopii DNA w ka¿dym cyklu, fazê przejciow¹, w czasie której obserwuje siê ha-muj¹cy wp³yw niedoboru polimerazy, starterów oraz nagromadzonych produktów PCR, przez co amplifi-kacja stopniowo staje siê coraz mniej efektywna, oraz fazê plateau, w której nie dochodzi ju¿ do powielania DNA.
W tradycyjnej metodzie identyfikacja produktu PCR wykonywana jest po zakoñczeniu reakcji. Podstawo-w¹ metod¹ jest tu elektroforeza w ¿elu agarozowym i wizualizacja DNA w promieniach UV po barwieniu, np. bromkiem etydyny (19). Widoczny w ¿elu pr¹-¿ek DNA porównuje siê do wzorca wielkoci i na tej podstawie wynik reakcji uznaje siê za dodatni lub ujemny.
Niestety, wynik badania niedostatecznie zoptymali-zowan¹ metod¹ PCR mo¿e byæ obarczony du¿ym b³ê-dem wynikaj¹cym z amplifikacji nieswoistego DNA o wielkoci zbli¿onej lub identycznej z produktem swoistym. Dodatkowym elementem weryfikuj¹cym specyficznoæ produktu PCR mo¿e byæ przeniesienie uzyskanego DNA na membranê lub inne pod³o¿e sta-³e i wykonanie hybrydyzacji z sond¹ molekularn¹ (oli-gonukleotyd znakowany enzymatycznie komplemen-tarny do amplifikowanego fragmentu DNA). Jedn¹ z mo¿liwoci jest wykonanie transferu Southerna, czyli przeniesienia DNA z ¿elu na membranê nylonow¹ po przeprowadzeniu elektroforezy produktu PCR (19). Inn¹ stanowi PCR-ELISA, czyli przeniesienie produk-tów PCR syntetyzowanych przy u¿yciu znakowanych starterów do do³ków mikrop³ytki op³aszczonych son-d¹ (11). W ka¿dym przypadku nale¿y wykonaæ bar-wienie immunoenzymatyczne.
Postêp w rozwoju techniki cyklicznej
polimeryzacji DNA in vitro Real-Time PCR*
)
TOMASZ STADEJEK
Zak³ad Chorób wiñ Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego Pañstwowego Instytutu Badawczego, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy
Stadejek T.
Recent developments in polymerase chain reaction Real-Time PCR
Summary
Polymerase chain reaction (PCR) has for many years been regarded as the new standard procedure in detecting the genes of microorganisms, plants and animals. Detecting the reacting products is reliant upon agarose gel electrophoresis, ethidium bromide staining, ultraviolet irradiation and comparing the size to a DNA size marker. This has slowed progress in adopting the PCR method in diagnostic laboratories. Developing new methods of PCR product detection without opening a reaction tube has opened new possibilities in applying this technique during routine diagnosis. Monitoring PCR product accumulation as amplification progresses is possible through using labeled primers and/or oligonucleotide probes or DNA binding fluorophores. Real-Time PCR methods can be subdivided into two groups: sequence dependent or sequence independent DNA detection. All of these involve using fluorophores linked to oligonucleotides or their presence in the reaction mixture. Their common feature is measuring fluorescence in each PCR cycle and calculating the threshold cycle that corresponds to the DNA copy number in that sample.
Keywords: PCR
Reakcja Real Time PCR
Tradycyjne metody wykrywania i identyfikacji pro-duktu PCR sprawiaj¹, ¿e metoda ta z trudem toruje sobie drogê do laboratoriów diagnostycznych ze wzglê-du na pracoch³onnoæ oraz ³atwoæ, z jak¹ dochodzi do kontaminacji laboratorium. Pojawienie siê mo¿li-woci detekcji produktów PCR w ka¿dym cyklu reak-cji (w czasie rzeczywistym Real-Time) bez koniecz-noci otwierania probówki stanowi³o prze³om w za-stosowaniu PCR w diagnostyce (8, 9). Monitorowa-nie akumulacji produktu reakcji w trakcie jej trwania mo¿liwe jest dziêki wykorzystaniu znakowanych star-terów, sond lub u¿yciu substancji fluoryzuj¹cych w obecnoci amplikonów (barwniki interkaluj¹ce). Mo¿liwoæ wykrywania produktów w przebiegu re-akcji PCR zredukowa³a równie¿ ca³kowity czas nie-zbêdny do jej wykonania oraz umo¿liwi³a zastosowa-nie PCR na wiêksz¹ skalê. Metody PCR, w których produkty wykrywa siê fluorescencyjnie w czasie trwa-nia amplifikacji DNA bez koniecznoci otwieratrwa-nia pro-bówki, nosz¹ nazwê Real-Time PCR.
Metody Real-Time PCR mo¿na, w zale¿noci od sposobu wykrywania produktu PCR, podzieliæ na dwie zasadnicze grupy: niezale¿ne od sekwencji matrycy (nieswoiste) i zale¿ne od sekwencji matrycy (swoiste). We wszystkich u¿ywa siê barwników fluorescencyj-nych (fluoroforów) zwi¹zafluorescencyj-nych z
oligonukleotydowy-mi sondaoligonukleotydowy-mi lub/i starteraoligonukleotydowy-mi PCR (metody swoiste) lub obecnych w stanie wolnym w roztworze, w którym przebiega PCR (metody nieswoiste). Wspóln¹ cech¹ obu grup jest pomiar fluorescencji w ka¿dym cyklu PCR i okrelanie cyklu, w którym poziom fluorescen-cji próbki wzrasta ponad poziom t³a. Cykl ten okrela-ny jest skrótem Ct (threshold cycle) i odzwierciedla pocz¹tkow¹ liczbê kopii DNA w mieszaninie PCR (ryc. 1).
Ilociowe oznaczenia w Real-Time PCR Dotychczas stosowane w laboratoriach diagnostycz-nych tradycyjne metody PCR umo¿liwiaj¹ niemal wy³¹cznie oznaczenia jakociowe, a wiêc daj¹ odpo-wied na pytanie, czy w badanym materiale znajduje siê poszukiwany gen. Rozwój metod Real-Time PCR sprawi³, ¿e oznaczenie liczby kopii genów lub drob-noustrojów sta³o siê znacznie ³atwiejsze do wykona-nia. Liczba drobnoustrojów obecna w badanej próbce wyra¿ona wartoci¹ Ct mo¿e byæ porównana do ich liczby w materiale pobranym z innego organu we-wnêtrznego lub w próbkach pobranych w ró¿nym cza-sie po zaka¿eniu. Mo¿liwe jest równie¿ okrelenie bezwzglêdnej liczby drobnoustrojów w próbce. Zwyk-le oznacza to porównanie wartoci Ct w badanym materiale z krzyw¹ standardow¹ okrelan¹ w trakcie tego samego eksperymentu przez amplifikacjê serii próbek zawieraj¹cych znan¹ liczbê kopii oznaczane-go DNA (16).
Precyzja oznaczeñ ilociowych w Real-Time PCR wynika z du¿ej dynamiki czu³oci (dynamic range) siêgaj¹cej 8 log10 kopii DNA (2). Osi¹gniêcie tak wysokiego parametru jest mo¿liwe dziêki temu, ¿e dane odnonie do iloci produktu PCR zbierane s¹ w trakcie fazy logarytmicznej amplifikacji, kiedy wa-runki reakcji s¹ optymalne i nie obserwuje siê jeszcze hamuj¹cego wp³ywu niedoboru polimerazy, starterów, nasycenia mieszaniny swoistymi i nieswoistymi pro-duktami i dzia³ania innych inhibitorów, co jest przy-czyn¹ osi¹gania fazy plateau. Iloæ produktu oznacza-na oznacza-na tym etapie PCR (elektroforeza po zakoñczeniu reakcji) nie odzwierciedla pocz¹tkowej liczby kopii w próbce.
Nieswoiste metody wykrywania produktów Real-Time PCR
Podstaw¹ nieswoistych metod detekcji produktów w Real-Time PCR jest zastosowanie substancji, które wykazuj¹ zdolnoæ fluorescencji po zwi¹zaniu siê z dwuniciowym DNA i wzbudzeniu fal¹ o okrelonej d³ugoci. Najszerzej znanym barwnikiem tego typu jest bromek etydyny wykorzystywany do barwienia DNA po elektroforezie w ¿elu (9). Inn¹ substancj¹ naj-czêciej stosowan¹ w metodach Real-Time PCR jest SYBR Green 1 (13). Metody Real-Time PCR z wyko-rzystaniem SYBR Green 1 nie wymagaj¹ korzystania ze specjalnych starterów ani sond DNA, a wiêc teore-tycznie ka¿da wczeniej opracowana metoda PCR
Ryc. 1. Krzywa amplifikacji DNA (a) oraz krzywa topnienia (denaturacji) produktów PCR (b). Linia w kolorze pomarañ-czowym oznacza poziom fluorescencji t³a (a) lub temperatu-rê topnienia swoistego produktu PCR (b). Reakcje wykona-no w obecwykona-noci barwnika interkaluj¹cego SYBR Green 1 przy u¿yciu aparatu iCycler (Biorad)
a)
mo¿e byæ zaadaptowana do formatu Real-Time PCR. Niestety, barwnik SYBR Green 1 wi¹¿e siê równie¿ z nieswoistymi produktami PCR (dimery starterów, produkty nieswoistej amplifikacji), co czêsto mo¿e pro-wadziæ do b³êdnej interpretacji wyniku reakcji. Prob-lem ten mo¿e byæ niekiedy rozwi¹zany przez okrele-nie temperatury denaturacji produktów PCR (18) (ryc. 1b). W tym celu po zakoñczeniu PCR probówki stopniowo podgrzewa siê, dokonuj¹c jednoczenie po-miaru fluorescencji. Gwa³towny spadek poziomu fluo-rescencji oznacza denaturacjê podwójnej nici DNA. Temperatura, w której ma to miejsce, jest w najwiêk-szym stopniu uzale¿niona od d³ugoci ³añcucha DNA a wiêc stosunkowo krótkie dimery starterów bêd¹ ule-ga³y denaturacji w ni¿szej temperaturze ni¿ produkt swoisty (ryc. 1).
Swoiste metody wykrywania produktów Real-Time PCR
Podstaw¹ swoistej detekcji produktów PCR jest wykorzystanie sond oligonukleotydowych o sekwen-cjach komplementarnych do sekwencji DNA synte-tyzowanego w trakcie reakcji. Sondy te znakowane s¹ fluorescencyjnie w sposób umo¿liwiaj¹cy emisjê wiat³a o okrelonej d³ugoci wy³¹cznie w obecnoci swoistej matrycy. W metodach tych wykorzystuje siê nastêpuj¹ce rodzaje sond: liniowe, nukleolityczne, typu szpilka do w³osów, a tak¿e samoidentyfikuj¹ce siê amplikony przy udziale sondy DNA zwi¹zanej na sta-³e ze starterem PCR.
Wszystkie wymienione metody swoistego wykry-wania produktów PCR opieraj¹ siê na przekazywa-niu energii fluorescencji miêdzy dwoma cz¹steczka-mi fluoroforu donorem i akceptorem (fluorescence resonance energy transfer FRET). Jest to proces, w którym energia jest przekazywana bezpromienicie, bez emisji fotonu, miêdzy cz¹steczkami oddalonymi o 10-100 Å, i których zakresy emisji i absorpcji po-krywaj¹ siê (6). Efektywnoæ transferu energii jest od-wrotnie proporcjonalna do szóstej potêgi odleg³oci miêdzy donorem i akceptorem (7). W zale¿noci od konstrukcji sondy o swoistej amplifikacji i obecnoci produktu PCR wiadczy fluorescencja donora lub ak-ceptora. W takiej sytuacji fluorofor ten nazywany jest reporterem.
Sondy liniowe (linear oligo probes, LightCycler probes, HybProbes, kissing probes). Sondy liniowe s¹ to zwykle uk³ady dwóch oligonukleotydów kom-plementarnych do tej samej nici DNA produktu PCR, które hybrydyzuj¹ w bezporednim s¹siedztwie, w od-leg³oci oko³o 10 nukleotydów od siebie (5). Oligo-nukleotydy te znakowane s¹ pojedynczo na koñcach, którymi s¹ do siebie zwrócone. Na przyk³ad, jedna son-da mo¿e byæ znakowana fluorescein¹ (donor) na koñ-cu 3, a druga np. fluoroforem LightCycler Red 640 (akceptor) na koñcu 5 (10). W obecnoci swoistej mat-rycy DNA (swoistej amplifikacji) dochodzi do hybry-dyzacji obu sond i zbli¿enia cz¹steczek fluoroforu. Po
owietleniu probówki promieniami o d³ugoci fali 490 nm wzbudzona cz¹steczka fluoresceiny emituje energiê, absorbowan¹ przez cz¹steczkê akceptora s³u-¿¹cego jako reporter, która emituje falê o d³ugoci 680 nm (ryc. 2). wiat³o reportera jest mierzone przez uk³ad optyczny aparatu do Real-Time PCR.
Metoda umo¿liwia równie¿ wykrywanie mutacji w obrêbie regionów hybrydyzacji sond przez okrela-nie temperatury ich topokrela-nienia (20). W temperaturze tej, podobnie jak w metodzie z barwnikiem SYBR Green 1, dochodzi do zaniku fluorescencji. W przy-padku sond liniowych temperatura ta zale¿y jednak od stopnia komplementarnoci sondy i matrycy, a nie, jak we wczeniej opisanej metodzie, od d³ugoci produk-tu PCR (20).
Odmianê tej techniki stanowi metoda wykorzystu-j¹ca transfer energii miêdzy donorem zlokalizowanym na koñcu 5 startera, a akceptorem znajduj¹cym siê na oligonukleotydowej sondzie (PriProET Primer-Pro-be Energy Transfer) (17). Metoda ta jest szczególnie przydatna w wykrywaniu genów o zmiennych sekwen-cjach, gdy¿ wymaga krótszego ni¿ w przypadku dwóch sond fragmentu konserwatywnego. Niedogodnoci¹ jest natomiast wiêksza odleg³oæ miêdzy donorem i akceptorem, co w pewnym stopniu ogranicza mo¿li-woci wykorzystania fluoroforów i aparatów do Real--Time PCR.
Sondy nukleolityczne (TaqMan®). Sondy nukleo-lityczne znane s¹ najszerzej pod nazw¹ TaqMan®. S¹ to oligonukleotydy komplementarne do jednej z nici produktu PCR, których koñce 3 i 5 znakowane s¹ dwoma ró¿nymi fluoroforami, np. fluorescein¹ (ko-niec 5) (reporter) i TAMRA (koniec 3) (quencher wygaszacz fluorescencji) (12). Nawietlenie miesniny reakcyjnej PCR zawieraj¹cej sondê, lecz nie za-wieraj¹cej komplementarnego do niej produktu PCR promieniami o d³ugoci fali 490 nm wywo³a wzbu-dzenie cz¹steczki fluoresceiny, której energia zosta-nie jednak poch³oniêta przez znajduj¹c¹ siê na drugim
Ryc. 2. Schemat dzia³ania uk³adu dwóch sond liniowych hy-brydyzuj¹cych do nici swoistego produktu PCR. Dochodzi wówczas zbli¿enia cz¹steczek fluoroforów. Po owietleniu probówki promieniami o d³ugoci fali 490 nm cz¹steczka fluo-resceiny (kolor ¿ó³ty) emituje energiê, która wzbudza emisjê fali o d³ugoci 680 nm przez cz¹steczkê akceptora (kolor sza-ry) s³u¿¹cego jako reporter. wiat³o reportera jest mierzone przez uk³ad optyczny aparatu do Real-Time PCR
Ryc. 4. Schemat dzia³ania sondy o kszta³cie szpilki do w³osów (molecular beacon). Koñce sondy s¹ wzajemnie komplementarne i w temperaturze pokojowej tworz¹ wyd³u¿ony fragment dwuniciowy (stem). rodkowy frag-ment jest komplefrag-mentarny do sekwencji produktu PCR i ma kszta³t jedno-niciowej pêtli (loop). W obecnoci swoistej sekwencji DNA, po denaturacji sondy, a nastêpnie obni¿eniu temperatury dochodzi do jej zwi¹zania z mat-ryc¹ DNA, a w efekcie oddalenia cz¹steczek donora (reportera, kolor ¿ó³-ty) i akceptora (wygaszacza fluorescencji, kolor szary), dziêki czemu mo¿-na wykryæ wiecenie reportera
koñcu oligonukleotydu cz¹steczkê TAMRA i fluore-scencja nie bêdzie wykryta przez uk³ad optyczny apa-ratu do Real-Time PCR. W przypadku obecnoci w roztworze DNA swoistego produktu PCR sonda bêdzie hybrydyzowaæ do jednej z nici, a nastêpnie ulegnie hydrolizie w wyniku dzia³ania polimerazy DNA wyd³u¿aj¹cej starter. Napromieniowanie takiej mieszaniny wywo³a fluorescencjê reportera, poniewa¿ jego energia nie bêdzie poch³aniana przez cz¹steczkê TAMRA i zostanie wykryta oraz zmierzona (ryc. 3).
Niestety w trakcie PCR dochodzi niekiedy do sa-moistnego rozpadu sondy TaqMan® co uwidacznia siê wzrostem fluorescencji w pónych cyklach PCR i co mo¿e byæ przyczyn¹ b³êdnego rozpoznania wyniku reakcji (2). W tym przypadku nie ma mo¿liwoci we-ryfikacji uzyskanego wyniku przez okrelenie tempe-ratury denaturacji produktu ani topnienia
sondy.
Sondy o kszta³cie szpilki do w³osów (hairpin oligoprobes, molecular beacons). Sondy te s¹ oligonukleotydami znakowany-mi na obu koñcach, podobnie jak sondy TaqMan. Jak wskazuje nazwa, tego typu sondy maj¹ kszta³t szpilki do w³osów, gdy¿ skrajne fragmenty s¹ do siebie wzajemnie komplementarne, tworz¹c wyd³u¿ony ment dwuniciowy (stem), natomiast frag-ment rodkowy, który jest komplefrag-mentar- komplementar-ny do sekwencji produktu PCR i decyduje o swoistoci sondy, ma kszta³t jednonicio-wej pêtli (loop) (21).
Opisany kszta³t sonda przybiera w tem-peraturze ni¿szej od temperatury denatura-cji wyd³u¿onego fragmentu struktury (stem). W takich warunkach przy braku spe-cyficznej sekwencji DNA oba fluorofory znajduj¹ siê w bezporedniej bliskoci i energia wzbudzonego wiat³em o
odpo-wiedniej d³ugoci fali donora jest poch³aniana przez akceptor. W obecnoci swoistej sekwencji DNA, po denaturacji sondy, a nastêpnie obni¿eniu tempera-tury dochodzi do jej hybrydyza-cji do matrycy DNA, a w efek-cie rozdzielenia cz¹steczek do-nora i akceptora, dziêki czemu mo¿na wykryæ fluorescencjê (21) (ryc. 4).
Uwa¿a siê, ¿e mutacje punk-towe w obrêbie fragmentu pro-duktu PCR, do którego hybry-dyzuje sonda, maj¹ silniejszy wp³yw destabilizuj¹cy na dimer sonda-produkt PCR ni¿ w przy-padku sond liniowych ze wzglê-du na to, ¿e wyd³u¿ony fragment struktury szpilki stanowi stabil-n¹ alternatywstabil-n¹ konformacjê oligonukleotydu. Sondy tego typu s¹ wiêc bardziej specyficzne (1).
Samoidentyfikuj¹ce siê amplikony. Zasada dzia-³ania tego typu detekcji amplikonów opiera siê na struk-turze powsta³ej z po³¹czenia sondy DNA o kszta³cie szpilki do w³osów z sekwencj¹ startera, który jest
do-Ryc. 3. Schemat dzia³ania sond nukleolitycznych TaqMan®. S¹ to oligonukleotydy zna-kowane fluorescencyjnie fluoroforem FAM (donor-reporter, kolor ¿ó³ty) i TAMRA (akceptor-wygaszacz fluorescencji, kolor szary). W obecnoci produktu PCR sonda hybrydyzuje do niego, a nastêpnie ulega hydrolizie w wyniku dzia³ania polimerazy DNA wyd³u¿aj¹cej starter komplementarny do tej samej nici, co sonda TaqMan®. W wyniku tego fluorescencja FAM nie jest t³umiona przez cz¹steczkê TAMRA i mo¿e byæ zmierzona
³¹czony do koñca 3 sondy. Barwnik fluorescencyjny sondy jest wiêc wbudowywany w sekwencjê produk-tu reakcji amplifikacji. W metodach tego typu wyko-rzystuje siê startery sunrise (sunrise primers, Am-plifluor hairpin primers) i startery skorpion (scor-pion primers) (23). W obecnoci swoistego produktu PCR komplementarny do niego fragment sondy sun-rise (fragment dzia³aj¹cy jako starter PCR) hybrydy-zuje do matrycy i jest wyd³u¿any przez polimerazê DNA w trakcie pierwszego cyklu PCR. Produktem tego cyklu jest wiêc niæ DNA zakoñczona pêtl¹ po-chodz¹c¹ z sondy. Na tym etapie emisja energii repor-tera jest poch³aniana przez cz¹steczkê wygaszacza fluorescencji. W kolejnym cyklu z nowo zsyntetyzo-wan¹ nici¹ ³¹czy siê drugi, nieznakowany starter, a polimeraza, wyd³u¿aj¹c go, destabilizuje wyd³u¿o-ny fragment pêtli sondy i dobudowuje niæ komplemen-tarn¹. Sekwencja nukleotydowa produktu PCR zawiera wiêc fragment pochodz¹cy z amplifikowanego genu oraz sondy. W ten sposób cz¹steczka reportera uwal-nia siê spod wp³ywu wygaszacza fluorescencji i wie-cenie reportera mo¿e byæ wykryte (15).
Podobn¹ budowê posiadaj¹ startery skorpion, z tym, ¿e wbudowaniu w produkt PCR ulega tylko fragment sekwencji startera skorpion, a sonda podobnie do odw³oka skorpiona wygina siê, hybrydyzuj¹c do sek-wencji amplikonu zlokalizowanej w pewnej odleg³o-ci od koñca 3 startera, dziêki czemu dochodzi do fluo-rescencji (23).
Podsumowanie
Ostatnio obserwowany jest intensywny rozwój w zakresie opracowywania nowych fluoroforów, no-wych metod znakowania DNA oraz nono-wych metod wy-krywania produktów PCR. Tak¿e instrumenty wyko-rzystywane w Real-Time PCR staj¹ siê coraz bardziej precyzyjne, szybsze i co niezmiernie wa¿ne umo¿-liwiaj¹ adaptacjê wszelkich dostêpnych technik de-tekcji. To wszystko sprawia, ¿e mimo intensywnego rozwoju technik wykorzystuj¹cych mikromacierze DNA (DNA microarrays) w najbli¿szym czasie nale-¿y siê spodziewaæ dalszej ekspansji PCR. Mo¿liwoæ szybkiej detekcji kilku drobnoustrojów w czasie poje-dynczej reakcji PCR przy jednoczesnej mo¿liwoci oznaczenia ilociowego wykrytych fragmentów spra-wia, ¿e Real-Time PCR staje siê standardow¹ techni-k¹ w wielu laboratoriach diagnostycznych (3, 4, 22, 24).
Pimiennictwo
1.Abravaya K., Huff J., Marshall, R., Merchant B., Mullen C., Schneider G., Robinson J.: Molecular beacons as diagnostic tools: technology and applica-tions. Clin. Chem. Lab. Med. 2003, 41, 468-474.
2.Alexandersen S., Oleksiewicz M. B., Donaldson A. I.: The early pathogenesis of foot-and-mouth disease in pigs infected by contact: a quantitative time-course study using TaqMan RT-PCR. J. Gen. Virol. 2001, 82, 747-755. 3.Belak S., Thoren P.: Molecular diagnosis of animal diseases: some
experien-ces over the past decade. Expert Rev. Mol. Diagn. 2001, 1, 434-443. 4.Cai H. Y., Archambault M., Gyles C. L., Prescott J. F.: Molecular genetic
methods in the veterinary clinical bacteriology laboratory: current usage and future applications. Anim. Health Res. Rev. 2003, 4, 73-93.
5.Cardullo R. A., Agrawal S., Flores C., Zamecnik P. C., Wolf D. E.: Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluorescence resonance energy transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 8790-8794.
6.Clegg R. M.: Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Meth. Enzymol. 1992, 211, 353-388.
7.Didenko V. V.: DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. Biotechniques 2001, 31, 1106-1121. 8.Heid C. A., Stevens J., Livak K. J., Williams P. M.: Real time quantitative
PCR. Genome Res. 1996, 6, 986-994.
9.Higuchi R., Dollinger G., Walsh P. S., Griffith R.: Simultaneous amplifica-tion and detecamplifica-tion of specific DNA sequences. Biotechnology 1992, 10, 413--417.
10.Jackwood D. J., Sommer S. E.: Identification of infectious bursal disease virus quasispecies in commercial vaccines and field isolates of this double--stranded RNA virus. Virology 2002, 304, 105-113.
11.Legeay O., Bounaix S., Denis M., Arnauld C., Hutet E., Cariolet R., Albina E., Jestin A.: Development of a RT-PCR test coupled with a microplate colori-metric assay for the detection of a swine Arterivirus (PRRSV) in boar semen. J. Virol. Meth. 1997, 68, 65-80.
12.McGoldrick A., Lowings J. P., Ibata G., Sands J. J., Belak S., Paton D. J.: A novel approach to the detection of classical swine fever virus by RT-PCR with a fluorogenic probe (TaqMan). J. Virol. Meth. 1998, 72, 125-135. 13.Morrison T. B., Weis J. J., Wittwer C. T.: Quantification of low-copy
trans-cripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification. Bio-techniques 1998, 24, 954-962.
14.Mullis K., Faloona F., Scharf S., Saiki R., Horn G., Erlich H.: Specific enzy-matic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Bio-technology 1992, 24, 17-27.
15.Nazarenko I. A., Bhatnagar S. K., Hohman R. J.: A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer. Nucleic Acids Res. 1997, 25, 2516-2521.
16.Orlando C., Pinzani P., Pazzagli M.: Developments in quantitative PCR. Clin. Chem. Lab. Med. 1998, 36, 255-269.
17.Rasmussen T. B., Uttenthal A., de Stricker K., Belak S., Storgaard T.: Deve-lopment of a novel quantitative real-time RT-PCR assay for the simultaneous detection of all serotypes of foot-and-mouth disease virus. Arch. Virol. 2003, 148, 2005-2021.
18.Ririe K. M., Rasmussen R. P., Wittwer C. T.: Product differentiation by analy-sis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Anal. Bioch. 1997, 245, 154-160.
19.Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nowy Jork 1989.
20.Schalasta G., Arents A., Schmid M., Braun R. W., Enders G.: Fast and type--specific analysis of herpes simplex virus types 1 and 2 by rapid PCR and fluorescence melting-curve-analysis. Infection 2000, 28, 85-91.
21.Tyagi S., Bratu D. P., Kramer F. R.: Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nature Biotechnology 1998, 16, 49-53.
22.van Rijn P. A., Wellenberg G. J., Hakze-van der Honing R., Jacobs L., Moonen P. L., Feitsma H.: Detection of economically important viruses in boar semen by quantitative Real-Time PCR technology. J. Virol. Meth. 2004, 120, 151-160.
23.Whitcombe D., Theaker J., Guy S. P., Brown T., Little S.: Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence. Nature Biotechno-logy 1999, 17, 804-807.
24.Zarlenga D. S., Higgins J.: PCR as a diagnostic and quantitative technique in veterinary parasitology. Vet. Parasitol. 2001, 101, 215-230.
Adres autora: doc. dr hab Tomasz Stadejek, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy; e-mail: stadejek@piwet.pulawy.pl
