Choroby kwarantannowe
METODY WYKRYWANIA I IDENTYFIKACJI
CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SUBSP. SEPEDONICUS,
SPRAWCY BAKTERIOZY PIERŚCIENIOWEJ ZIEMNIAKA
– STAN OBECNY I PERSPEKTYWY NA PRZYSZŁOŚĆ
mgr inż. Sebastian Brzozowski
IHAR Radzików, 05-870 Błonie, Zakład Fitopatologii, Pracownia Hodowli Odpornościowej e-mail: s.brzozowski@ihar.edu.pl
akteria Clavibacter michiganensis
subsp. sepedonicus (Spieckermann i Kotthoff) Davis i in. jest sprawcą bakteriozy pierścieniowej ziemniaka, która ma status choroby kwarantannowej. W krajach należą-cych do Unii Europejskiej obowiązują odpo-wiednie regulacje prawne, szczegółowo określające procedury zwalczania i zapobie-gania rozprzestrzenianiu się choroby (Dyrek-tywa 93/98/EEC). Aktem prawnym obowią-zującym w Polsce i kompatybilnym z Dyrek-tywą UE jest Rozporządzenie Ministra Rol-nictwa i Rozwoju Wsi z dnia 13 kwietnia 2005 roku w sprawie szczegółowych sposo-bów postępowania przy zwalczaniu i zapo-bieganiu rozprzestrzenianiu się C.
michiga-nensis subsp. sepedonicus.
Bakterioza pierścieniowa ziemniaka jest notowana w wielu krajach świata, także w Polsce. W ostatnich latach w naszym kraju jej występowanie nasiliło się i jest realnym zagrożeniem dla produkcji nasiennej. Utrud-nia także krajowy obrót ziemUtrud-niakami i w ra-mach UE, a także w eksporcie do krajów trzecich. Wieloletnie programy zwalczania patogenu, wdrażane w Europie Zachodniej, przyniosły bardzo dobry efekt, ale niestety nie doprowadziły do całkowitej likwidacji cho-roby (EPPO/CABI 1997). Mimo usilnych sta-rań i rygorystycznego przestrzegania przepi-sów fitosanitarnych w krajach UE nadal po-jawiają się sporadyczne doniesienia o jej wystąpieniu. Należy zatem podkreślić, że bakterioza pierścieniowa ziemniaka stwarza ogromne problemy nie tylko Polsce, gdzie występuje w dużym nasileniu, ale także w
krajach UE, w których od dawna prowadzi się walkę z tym nad wyraz kłopotliwym agro-fagiem kwarantannowym. Problemy z C.
michiganensis subsp. sepedonicus wynikają
między innymi z braku dostatecznie czułych metod jej wykrywania i identyfikacji. Poszu-kiwanie nowych, a także doskonalenie już znanych metod jest sprawą priorytetową.
Metody stosowane obecnie w badaniach rutynowych
W Polsce kontrolę fitosanitarną prowadzi Państwowa Inspekcja Ochrony Roślin i Na-siennictwa. Jej zadaniem jest między innymi monitorowanie i ocena stanu zagrożenia roślin uprawnych przez organizmy kwaran-tannowe. Procedury wykrywania i identyfika-cji C. michiganensis subsp. sepedonicus stosowane rutynowo przez Wojewódzkie Inspektoraty Ochrony Roślin i Nasiennictwa obejmują test pośredniej immunofluorescen-cji (IFAS), test biologiczny oraz izolację bak-terii na pożywkach półselektywnych. Jak dotąd opracowano dwie pożywki półselek-tywne do izolacji tego patogenu: NCP-88 zawierającą w składzie między innymi anty-biotyki: siarczan polimyksyny B, kwas nali-diksowy oraz cykloheksimid oraz MTNA – zawierającą trimetoprim, kwas nalidiksowy i amfoterycynę B (De la Cruz i in. 1992; Jan-sing, Rudolph 1998). Niestety, nie opraco-wano dotychczas dla C. michiganensis subsp. sepedonicus pożywki selektywnej.
Ekstrakty z porażonych przez patogen bulw ziemniaka, z których najczęściej wyko-nuje się izolację, mogą zawierać wiele
nych gatunków bakterii saprofitycznych, cha-rakteryzujących się szybkim wzrostem na pożywkach. Przy bezpośrednim posiewie ekstraktów na pożywkę półselektywną bakte-rie inne niż C. michiganensis subsp.
sepe-donicus, rozmnażające się znacznie
szyb-ciej, pokrywają całą jej powierzchnię, co uniemożliwia skuteczną izolację czystych szczepów patogenu. Izolacja na półselek-tywnej pożywce daje najlepsze efekty, gdy jest poprzedzona inokulacją roślin bakłażana ekstraktem, z którego izoluje się patogen. Zakażone rośliny bakłażana są dobrym śro-dowiskiem dla selektywnego rozmnażania sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemnia-ka.
Obecnie powszechnie stosowana jest me-toda serologiczna immunofluorescencji po-średniej – IFAS (De Boer, Copeman 1980). Technika immunoflurescencji umożliwia ob-serwację w mikroskopie fluorescencyjnym efektu reakcji serologicznej w postaci fluore-scencji komórek bakteryjnych, jak również ocenę ich morfologii (kształt, wielkość, wza-jemne ułożenie). Składa się z dwóch głów-nych etapów. W pierwszym etapie utrwalona na szkiełku podstawowym zawiesina bakterii traktowana jest surowicą zawierającą nie-znakowane specyficzne przeciwciała anty- -Cms. Po inkubacji i wypłukaniu nadmiaru niezwiązanych przeciwciał w etapie drugim stosuje się znakowaną barwnikiem surowicę z przeciwciałami przeciwko nieznakowanym immunoglobulinom zastosowanym wcze-śniej. W pozytywnych preparatach widoczne są komórki bakteryjne o typowej morfologii, z fluoryzującą ścianą komórkową wyraźnie widoczną na ciemnym tle.
Granice wykrywalności testu IFAS miesz-czą się w zakresie 103-104 komórek bakterii w 1 ml ekstraktu z tkanki ziemniaka. W nie-sprzyjających warunkach C. michiganensis subsp. sepedonicus rozmnaża się bardzo wolno w roślinie i może występować w stę-żeniu niższym, niż wynosi granica wykrywal-ności testu. Przy stosowaniu przeciwciał poliklonalnych dodatkową wadą testu IFAS jest możliwość występowania reakcji krzyżo-wych. Można je wyeliminować, stosując przeciwciała monoklonalne, co jednak zwięk-sza koszty badania (De Boer, Wieczorek 1984).
Pozytywne wyniki testu IFAS wymagają
potwierdzenia w teście patogeniczności na oberżynie. Młode siewki inokuluje się eks-traktem z bulw przygotowanym w trakcie wykonywania testu IFAS, na odcinku łodygi pomiędzy liścieniami a pierwszym liściem, po czym rośliny inkubuje w ściśle określo-nych warunkach temperatury (optymalna 23ºC), przy wysokiej wilgotności i szesna-stogodzinnym dniu. Wadą metody biologicz-nej jest jej czasochłonność, wymagane jest bowiem, aby test dla potwierdzenia obecno-ści i wirulencji C. michiganensis subsp.
se-pedonicus trwał 40 dni.
Granica wykrywalności testu na oberżynie mieści się również w zakresie 103-104 komó-rek bakterii w 1 ml ekstraktu z tkanki ziem-niaka. Bakterie C. michiganensis subsp.
se-pedonicus mogą występować w roślinach
ziemniaka w bardzo niskim stężeniu, poniżej progu wykrywalności stosowanych obecnie rutynowo metod.
Nowe techniki wykrywania i identyfikacji
Techniki molekularne polegające na wykry-waniu amplifikowanego fragmentu genomu bakteryjnego z zastosowaniem starterów unikatowych dla danego patogenu (klasycz-ny PCR) są bardzo szybkie, czułe i specy-ficzne, ale mimo to nie stosuje się ich w ru-tynowych badaniach ze względu na słabą powtarzalność wyników (Alvarez 2004). Ko-lejnym krokiem w rozwoju metod detekcji było zmodyfikowanie klasycznego PCR i w efekcie opracowanie szczegółowego proto-kołu wykrywania C. michiganensis subsp.
sepedonicus powodującego bakteriozę
pier-ścieniową ziemniaka za pomocą metody określanej jako „multiplexed PCR-ELISA” (Mills, Russell 2003).
Zarówno klasyczny PCR, jak i jego mody-fikacja (PCR-ELISA) z zastosowaniem spe-cyficznych starterów pozwala wykrywać nie tylko żywe, ale także martwe komórki C.
michiganensis subsp. sepedonicus. Jest to
główny powód, dla którego obie wymienione wyżej techniki nie są stosowane w bada-niach rutynowych. Ich pozytywny wynik, po-dobnie jak w przypadku testu IFAS, wymaga potwierdzenia testem patogeniczności na oberżynie. Techniki molekularne tego typu mogą być zatem stosowane jedynie jako pomocnicze, potwierdzające wyniki uzyska-ne w teście IFAS.
Idealnym rozwiązaniem byłaby metoda pozwalająca nie tylko na wykrycie patogenu, ale również na określenie jego żywotności. Stwierdzenie, czy organizm wywołujący cho-robę jest w stanie rozmnażać się i infekować rośliny gospodarza, jest niezbędne i ko-nieczne w diagnostyce fitopatologicznej.
W ostatnich latach adaptowano kilka mo-lekularnych technik wykrywania i identyfikacji
C. michiganensis subsp. sepedonicus, za
pomocą których można stwierdzić, czy bak-terie obecne w badanej próbie były żywe, czy martwe. Są to: fluorescencyjna hybrydy-zacja in situ – FISH (Li i in. 1997) , BIO-PCR z zastosowaniem analizy przyrostu ilości produktu w czasie rzeczywistym – Real-time PCR (Schaad i in. 1999) oraz metoda izo-termicznej amplifikacji kwasu nukleinowego – NASBA (Van Beckhoven i in. 2002).
Klasyczny PCR
Zaprojektowano szereg specyficznych star-terów do amplifikacji fragmentów genomo-wego lub plazmidogenomo-wego DNA C.
michiga-nensis subsp. sepedonicus. Znanych jest
wiele prac na temat zastosowania PCR do wykrywania sprawcy bakteriozy pierścienio-wej ziemniaka. Dotyczą one sposobu opra-cowania starterów do PCR, optymalizacji warunków jej przebiegu oraz porównania z innymi metodami (Schneider i in. 2003; Li, De Boer 1995; Lee i in. 1997; Hu i in. 1995; Firrao, Lozzi 1994; Pastrik, Rainer 1999). Ekstrakty z bulw ziemniaka zawierają dużo inhibitorów polimerazy DNA hamujących reakcję PCR i nie zawsze możliwych do usu-nięcia w trakcie izolacji DNA. Jest to istotny powód stosunkowo słabej powtarzalności wyników testów molekularnych.
Multiplexed PCR-ELISA
Technika łączy w sobie dwie metody: mole-kularną i serologiczną. Procedura opraco-wana przez Mills i Russell (2003) obejmuje dwa etapy. W pierwszym powiela się 3 spe-cyficzne fragmenty genomu C.
michiganen-sis subsp. sepedonicus różnej wielkości:
164, 193 i 205 nukletydów. Informacje doty-czące starterów przedstawiono w tabeli 1.
Tabela 1
Startery wykorzystywane do wykrywania Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus przy zastosowaniu PCR
Nazwa starteru Region amplifikowanego DNA Sekwencja starterów 5’-3’ Wielkość produktu (pz) Pi- śmien-nictwo Cms 6 Cms 7 DNA plazmidowe
CGC TCT CCC TCA CCA GAC TC
TCC CGT GCT TGC CTG CGT TG 258 17
A 47 A A47 B
DNA plazmidowe
CAC CCC TCG ACT GCG AGA AAC G
TCC TCC GAG ACT TTC GGG ACG C 670 7 Sp 1f
Sp 5r Region ITS
CCT TGT GGG GTG GGA AAA
TGT GAT CCA CCG GGT AAA 215 11
Cms 50 F Cms 50 R Cms 72 F Cms 72 R Cms 85 F Cms 85 R Region ITS
GAG CGC GAT AGA AGA GG TCC TGA GCA ACG ACA AGA AAA AGT TCG AGT TGA TAG CAA TCC GTG TCT CGG ATT CAC GAT CAC C AAG ATC AGA AGC GAC CCG CC TCG CAC AGC CAA ATC CAG C
193 164 205
13
PSA-1
PSA-R Region ITS
CTC CTT GTG GGG TGG GAA AA
TAC TGA GAT GTT TCA CTT CCC C 502 14
W następnym etapie produkty amplifikacji wykrywa się za pomocą testu ELISA. Tech-nika Multiplexed PCR-ELISA charakteryzuje się bardzo wysoką specyficznością, co wy-klucza z dużym prawdopodobieństwem
re-akcje fałszywie pozytywne, ponadto metoda zawiera kontrolę amplifikacji. Polega ona na tym, że do mieszaniny reakcyjnej dodaje się fragment DNA o długości 253 par zasad (SA72), pochodzący z genomu ukwiału.
Je-go końce są komplementarne do starterów Cms 72 F i Cms 72 R, co powoduje, że jest on przez nie powielany. Zastosowanie star-terów, które powielają zarówno matrycę SA72, jak i fragment genomu bakterii C.
mi-chiganensis subsp. sepedonicus, umożliwia
w przypadku braku produktu specyficznego dla bakterii stwierdzenie, że warunki reakcji amplifikacji były poprawne. Doświadczenia wykonane przez amerykański zespół wyka-zały, że PCR-ELISA jest bardziej czuły od standardowego PCR z zastosowaniem elek-troforetycznego rozdziału produktów, a także dokładniejszy w porównaniu z testami sero-logicznymi (Mills, Russell 2003).
Real-time PCR
Łańcuchowa reakcja polimerazy z analizą przyrostu ilości produktu w czasie rzeczywi-stym (Real-Time PCR) jest najnowszą tech-niką, wykorzystywaną także w fitopatologii do wykrywania wielu bakteryjnych patoge-nów roślin. Jej istotą jest użycie sond fluore-scencyjnych w połączeniu z klasyczną łań-cuchową reakcją polimerazy (PCR). Opra-cowano kilka rodzajów sond posiadających w swojej budowie różne fluorochromy, typu TaqMan, Molecular Beacon, SYBR Green I i inne. Ich cechą wspólną jest połączenie z barwnikami fluorescencyjnymi, które – wzbudzone – emitują fale świetlne o odpo-wiedniej długości, gdy reakcja PCR przebie-ga prawidłowo, prowadząc do powstania specyficznego produktu. Natężenie emisji światła o odpowiedniej długości fali jest mo-nitorowane i wzrasta proporcjonalne do ilości kopii amplifikowanej sekwencji DNA.
Real-Time PCR ma wiele zalet, świad-czących o jego wyższości nad klasycznym PCR: jest łatwiejszy do wykonania, mniej wrażliwy na zanieczyszczenia, będące przy-czyną fałszywie pozytywnych wyników, i nie wymaga specjalistycznej aparatury do prze-prowadzania elektroforetycznego rozdziału produktów amplifikacji. Optymalizacja wa-runków Real-Time PCR jest łatwiejsza w porównaniu z klasycznym PCR, może on być również zastosowany jako Multiplex- -PCR do wykrywania kilku patogenów jedno-cześnie (Alvarez 2004).
Metoda Real-Time PCR ma jeszcze jedną bardzo ważną zaletę: możliwość ilościowego oznaczania matrycowego DNA w
mieszani-nie reakcyjnej, a tym samym oznaczania liczebności bakterii w badanej próbie. Po-przez eliminację etapu elektroforezy usunię-to zagrożenie wynikające z użycia rako-twórczego bromku etydyny niezbędnego do wizualizacji DNA na żelu agarozowym. Sto-sowanie Real-time PCR ma również jedną zasadniczą wadę. Jest nią wysoka cena aparatury do przeprowadzania reakcji PCR i odczytu jej wyniku w czasie rzeczywistym, która uniemożliwia wykorzystanie tej techniki w małych laboratoriach diagnostycznych.
Poprzedzenie amplifikacji Real-Time PCR etapem wzbogacania badanego ekstraktu, określanego mianem BIO-PCR, zwiększa czułość testu. W pierwszym etapie wykonuje się posiew części uzyskanego ekstraktu bak-teryjnego na pożywkę półselektywną w celu namnożenia żywych bakterii. Po 48 lub 72 godzinach inkubacji w temperaturze opty-malnej dla wzrostu C. michiganensis subsp.
sepedonicus, wynoszącej 23ºC, kolonie
wy-rosłe na pożywce spłukuje się, a uzyskany ekstrakt analizuje Real-Time PCR (Schaad i in. 1999).
Fluorescencyjna hybrydyzacja
in situ (FISH)
Hybrydyzacja in situ oraz metody immunocy-tochemiczne są technikami, które znalazły szerokie zastosowanie w wykrywaniu specy-ficznych sekwencji DNA, RNA, białek i in-nych biopolimerów w komórkach oraz okre-ślaniu ich dokładnej lokalizacji w przestrzeni. Opracowano metodę wykrywania C.
michi-ganensis subsp. sepedonicus, która łączy
fluorescencyjną hybrydyzaję in situ z po-średnią immunofluorescencją IFAS (Li i in. 1997). Identyfikacja bakterii odbywa się na podstawie dwóch różnych reakcji. Pierwsza z nich to klasyczna technika pośredniego immunofluorescencyjnego barwienia komó-rek bakterii C. michiganensis subsp.
sepe-donicus z użyciem zestawu dwóch
przeciw-ciał monoklonalnych: anty-Cms oraz koniu-gatu sprzężonego z izotiocyjanianem fluore-sceiny. Druga reakcja polega na hybrydyza-cji znakowanych barwnikiem fluorescencyj-nym (izotiocyjanianem tetrametylorodaminy) oligonukleotydowych sond z komplementar-nymi fragmentami genu 16S rRNA w komór-kach C. michiganensis subsp. sepedonicus.
Połączenie dwóch technik w jednym te-ście świadczy niewątpliwie o wyższości me-tody FISH nad testem IFAS, w którym wyko-rzystuje się tylko znakowane fluorescencyj-nie przeciwciała. Stosując odmienne barwni-ki fluorescencyjne dla sondy oligonukleoty-dowej i specyficznych przeciwciał, można odróżnić żywe komórki bakterii od martwych, ponieważ po śmierci komórki RNA jest szyb-ko degradowane, a to uniemożliwia przyłą-czenie sond oligonukleotydowych. Różnice pomiędzy komórkami martwymi i żywymi można łatwo zauważyć w mikroskopie flu-orescencyjnym sprzężonym z komputero-wym systemem analizy obrazu. Komórki martwe będą wykazywały tylko fluorescencję w kolorze zielonym, wynikającym z przyłą-czenia specyficznych przeciwciał sprzężo-nych z izotiocyjanianem fluoresceiny. Żywe bakterie będą widoczne na obrazie mikro-skopowym dzięki fluorescencji barwników z obu rodzajów sond.
Izotermiczna amplifikacja sekwencji kwasu nukleinowego (NASBA)
W krótkim czasie po śmierci komórki RNA jest degradowane przez wewnątrzkomórko-we rybonukleazy, czego nie obserwuje się w wypadku DNA. Pozwoliło to opracować me-todę wykrywania żywych komórek określaną jako AmpliDet RNA, polegającą na wykwaniu amplifikowanej sekwencji kwasu ry-bonukleinowego. Van Beckhoven i inni (2002) zaadaptowali AmpliDet RNA do wy-krywania żywych komórek bakterii C.
michi-ganensis subsp. sepedonicus. Metoda ta
bazuje na izotermicznej amplifikacji sekwen-cji kwasów nukleinowych (NASBA) połączo-nej z analizą przyrostu ilości produktu w cza-sie rzeczywistym z zastosowaniem sondy typu „Molecular Beacon”. Istotą jest wykry-wanie specyficznego fragmentu RNA, a nie DNA, jak w wypadku klasycznej reakcji PCR. NASBA opiera się na współdziałaniu trzech enzymów: odwrotnej transkryptazy AMV, rybonukleazy H oraz polimerazy T7 RNA. Matrycą do amplifikacji jest specyficz-ny fragment 16S rRNA C. michiganensis subsp. sepedonicus, którego sekwencja w pierwszym etapie procesu, przy udziale od-wrotnej transkryptazy AMV, jest przepisywa-na przepisywa-na sekwencję DNA. Powstaje w ten spo-sób nić hybrydowego RNA-DNA, w której nić
RNA jest degradowana przez rybonukleazę H. Odwrotna transkryptaza AMV, ujawniając aktywność polimerazy DNA, przeprowadza proces enzymatycznego dobudowania dru-giej nici DNA do nici DNA, powstałej na ma-trycy RNA.
Polimeraza T7 RNA jest odpowiedzialna za transkrypcję sekwencji z podwójnej nici DNA na fragmenty RNA, które są wykrywane przez sondę molekularną. Sonda typu „Mo-lecular Beacon” to odcinek DNA posiadający sekwencje komplementarne wobec siebie, dzięki którym tworzy strukturę tzw. „spinki do włosów”. Na obu końcach pojedynczej sondy związane są dwie cząsteczki, z których jed-na jest fluorochromem, a druga wygasza-czem. Struktura spinki zbliża obie cząsteczki do siebie. W obecności światła o odpowied-niej długości fali fluorochrom na jednym koń-cu zostaje wzbudzony, lecz nie emituje świa-tła, gdyż wygaszacz przechwytuje jego energię. W momencie gdy sonda hybrydyzu-je do komplementarnej sekwencji RNA na amplifikowanym fragmencie, fluorochrom zostaje przestrzennie odizolowany od wyga-szacza i emituje światło. Natężenie emisji światła o odpowiedniej długości fali jest mo-nitorowane i proporcjonalne do ilości kopii badanej sekwencji RNA. NASBA jest obec-nie najnowocześobec-niejszą metodą wykrywania
C. michiganensis subsp. sepedonicus,
praw-dopodobnie jej optymalizacja i przetestowa-nie na większej liczbie prób pozwoli na wdrożenie jej do rutynowych testów.
Mimo stosowania różnych technik wykry-cie C. michiganensis subsp. sepedonicus w materiale roślinnym nastręcza wielu trudno-ści. Metoda IFAS oraz biologiczny test pato-geniczności na oberżynie mają niedosta-teczną czułość, rzędu 103-104 komórek bak-terii w 1 ml ekstraktu z tkanki ziemniaka. Pozytywne wyniki testu IFAS muszą zostać potwierdzone testem patogeniczności, co wymaga dużych nakładów pracy i wydłuża okres diagnozy.
Nowe metody wykrywania i identyfikacji
C. michiganensis subsp. sepedonicus mają
wyższą czułość w porównaniu z metodami stosowanymi obecnie rutynowo. Mała czaso- i pracochłonność testów NASBA oraz BIO-PCR, a także możliwość wykrywania jedynie żywych bakterii C. michiganensis subsp.
świadczące o ich wyższości nad stosowa-nymi dziś rutynowo metodami. Standaryza-cja metod pozwoliłaby znacznie skrócić czas diagnozy patogenu. Ma to szczególne zna-czenie w przypadkach, gdy konieczne jest szybkie zbadanie materiału pod kątem obecności sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka.
Nowo opracowane metody diagnostyczne wymagają jeszcze poprawienia wielu szcze-gółów, ale można już jednoznacznie stwier-dzić, że są one doskonałym narzędziem do badań epidemiologicznych. NASBA i BIO-PCR będą zapewne w przyszłości stosowa-ne jako dodatkowe testy wykrywania C.
mi-chiganensis subsp. sepedonicus, a być
mo-że zastąpią stosowany obecnie rutynowo test IFAS oraz test patogeniczności na obe-rżynie.
Literatura
1. Alvarez A.M. 2004. Integrated approaches for
de-tection of plant pathogenic bacteria and diagnosis of bacterial diseases. – Ann. Rev. Phytopathol. 42: 339- -366; 2. De Boer S.H., Copeman R.J. 1980. Bacterial ring rot testing with the indirect fluorescent antibody staining procedure. – Am. Pot. J. 57: 457-466; 3. De
Boer S.H., Wieczorek A. 1984. Production of
mono-clonal antibodies to Corynebacterium sepedonicum. – Phytopathology 74: 1431-1434; 4. De la Cruz A.R.,
Wiese M.V., Schaad N.W. 1992. A semiselective agar
medium for isolation of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus from potato tissues. – Plant Dis. 76, 830-834; 5. Dyrektywa Rady Wspólnoty Europej-skiej 93/85/EEC z dnia 4 października 1993 dotycząca zwalczania bakteriozy pierścieniowej ziemniaka;
6. EPPO/CABI. 1997. Quarantine Pests for Europe.
Second edition: 986-990; 7. Firrao G.R., Lozzi R.
1994. Identification of Clavibacter michiganensis
subsp. sepedonicus using polymerase chain reaction. – Can. J. Microbiol. 40: 148-151; 8. Hu X., Lai F.M.,
Reddy A.S.N., Ishimaru C.A. 1995. Quantitative
de-tection of Clavibacter michiganensis subsp.
sepedoni-cus by polymerase chain reaction. – Phytopathology
85(12): 1468-1473; 9. Jansing H., Rudolph K. 1998. Physiological capabilities of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and development of a semi-selective medium – Z. Pflanzenkrankh. Pflanzensch. 105(6): 590-601; 10. Lee I.M., Bartoszczyk I.M.,
Gundersen D.E., Mogen D., Davis R.E. 1997. Nested
PCR for ultrasensitive detection of the potato ring rot bacterium, Clavibacter michiganensis subsp.
sepe-donicus. – Appl. Environ. Microbiol. 63: 2625-2630;
11. Li X., De Boer S.H. 1995. Selection of polymerase
chain reaction primers from an RNA intergenic spacer region for specific detection of Clavibacter
michi-ganensis subsp. sepedonicus. – Phytopathology 85:
837-842; 12. Li X., De Boer S.H., Ward L.J. 1997. Improved microscopic identification of Clavibacter
michiganensis ssp. sepedonicus cells by combining in situ hybridization with immunofluorescence. – Lett.
Appl. Microbiol. 24: 431-434; 13. Mills D., Russell
B.W. 2003. Parameters for specific detection of
Clavi-bacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato
stems and tubers by multiplexed PCR-ELISA. – Am. J. Potato Res. 80: 223-234; 14. Pastrik K.H., Rainey
F.A. 1999. Identification and differentiation of
Clavibac-ter michiganensis subspecies by polymerase chain
reaction-based techniques. – J. Phytopath. 147: 687-693; 15. Rozp. MRiRW z dn. 13 kwietnia 2004 r. w sprawie szczegółowych sposobów postępowania przy zwalczaniu i zapobieganiu rozprzestrzenianiu się bak-terii Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. – Dz. U. Nr 75, poz. 709; 16. Schaad N.W.,
Berthier-Schaad Y., Sechler A., Knorr D. 1999. Detection of
Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in
potato tubers by BIO-PCR and an automated real-time detection system. – Plant Dis. 83: 1095-1100;
17. Schneider B.J., Zhao J.L., Orser C.D. 1993.
Detection of Clavibacter michiganensis subsp.
sepe-donicus by DNA amplification. – FEMS Microbiol. Lett.
109: 207-212; 18. Van Beckhoven J.R.C.M., Stead
D.E., van der Wolf J.M. 2002. Detection of Clavibacter
michiganensis subsp. sepedonicus by AmpliDet RNA,
a new technology based on real time monitoring of NASBA amplicons with a molecular beacon. – J. Appl. Microbiol. 93: 840-849
