NA
UK
A
KR
Ó
TK
O
SZK
OŁA
Wstęp
Wielu spośród odbiorców tego artykułu zapewne znana jest nowela napisana w 1886 r. przez Roberta Louisa Stevensona pt. Strange Case of Dr Jekyll and Mr Hyde. Któż mógłby się spodziewać, że natura stworzyła podobne „dzieło” na poziomie molekularnym. Mowa tu o białkach prionowych – białkach, które mogą wy-stępować w dwóch jakże odmiennych postaciach: PrPC – niegroźnej dla organizmów ssaczych oraz PrPSc –
po-Kamil Lisiecki: licencjat chemii, student IV roku
Między-obszarowych Indywidualnych Studiów Matematyczno--Przyrodniczych, Uniwersytet Warszawski
Molekularny Dr Jekyll
i Mr Hyde
Kamil Lisiecki
Streszczenie:
Białka prionowe stanowią jak dotąd bardzo słabo pozna-ną rodzinę białek. Jednakże ich wyjątkowe cechy sprawia-ją, iż od momentu ich odkrycia (uwieńczonego nagrodą Nobla) są intensywnie badanym obiektem. W dodatku, zaskakująca natura białek prionowych – białek o dwóch twarzach – powoduje, że są one niezwykle interesującą ciekawostką biologiczną.
Słowa kluczowe: prion, choroby prionowe, PRNP, aktywność antyprionowa, choroba Creutzfeldta-Jakoba, BSE, kurkumina, dendrymery, drożdże
otrzymano: 16.04.2013; przyjęto: 9.05.2013; opublikowano: 28.06.2013
wodującej u ssaków liczne choroby (Prusiner, 1982). W tym drugim przypadku nazywane są one prionami. Pomimo tak fascynującej natury priony nie należą do często omawianych tematów, głównie za sprawą tego, że nasza wiedza na ich temat jest wciąż niewielka. W arty-kule tym postaram się przybliżyć zagadnienie prionów, przedstawić dotychczasowy stan wiedzy w tym zakresie oraz szczególnie skupić się na próbach farmakoterapii w odniesieniu do chorób prionowych.
Rys historyczny
Termin „prion” jest skrótem od angielskiego ter-minu „proteinaceous infectious particle” – „zakaźna cząsteczka białkowa”. Został on wprowadzony w 1982 r. przez amerykańskiego biochemika i neurobiologa, laureata Nagrody Nobla Stanley’a B. Prusiner’a (Prusi-ner, 1982). Warto zdać sobie sprawę, że w latach 80. XX wieku genetyka była już nauką o silnych fundamentach. Genetycy i biolodzy molekularni wierzyli, że nic nie jest już w stanie ich zaskoczyć i że ich wiedza na temat kwa-sów nukleinowych, białek oraz dziedziczenia jest prak-tycznie kompletna. Jakże wielkim zaskoczeniem było dla nich odkrycie prionu – białka, które jest w pewnym sensie wyjątkiem od dwóch obowiązujących w biologii molekularnej i genetyce zasad: 1) przekazywanie infor-macji o patogenności zachodzi przy udziale kwasów nu-kleinowych, 2) struktura drugorzędowa białek determi-nowana jest przez strukturę pierwszorzędową.
Komentarza wymaga również pochodzenie stoso-wanych skrótów (PrPC i PrPSc). PrP to skrót od angiel-skiego terminu „prion protein”, indeksy górne oznaczają natomiast: C – Cellular, czyli komórkowy, występujący naturalnie w komórce, oznaczający niepatogenną for-mę; Sc – jest to skrót od Scrapie, nazwy choroby wystę-pującej u owiec, a wywołanej przez priony, oznaczający formę patogenną tegoż białka.
Charakterystyka białka prionowego
Białko prionowe (PrP) istnieje w dwóch postaciach: fizjologicznej – PrPC, oraz patogennej – PrPSc (ryc. 1). Podstawową cechą formy patogennej jest jej słaba roz-puszczalność w środowisku wodnym oraz brak podat-ności na trawienie proteazami – enzymami hydrolizu-jącymi białka i peptydy (w przeciwieństwie do PrPC). Formy te różnią się również strukturą drugorzędową. W formie fizjologicznej dominuje struktura a-helisy, natomiast w formie patologennej struktura b-kartki (ryc. 2).
Mechanizm powstawania formy PrPSc nie jest jesz-cze do końca wyjaśniony. Naukowcy zdążyli jednak zaproponować model tłumaczący to zjawisko (ryc. 3) (Jackson i Clarke, 2000):
1. Forma fizjologiczna może w sposób spontaniczny, ale odwracalny zmienić się w monomeryczny pre-kursor PrPSc.
2. Prekursory te mogą ze sobą odwracalnie i słabo oddziaływać, dopóki nie powstanie stabilny, in-fekcyjny „zalążek” (przedstawiony na ryc. 2 jako struktura w nawiasie kwadratowym).
3. Przekroczenie ,,masy krytycznej” powoduje, że monomeryczne prekursory PrPSc mogą być przy-łączane nieodwracalnie i umożliwiany jest wzrost cząstek PrPSc.
4. Cząstki zakaźne mogą się powielać poprzez pęk-nięcia na mniejsze, stabilne cząstki.
W ten sposób powstają złogi amyloidowe (nieroz-puszczalne, włókniste agregaty białek), które uważane są za przyczynę chorób prionowych. Należy również zwrócić uwagę, że dostanie się do organizmu formy pa-togennej (zakażenie), działa jak swego rodzaju domino – powoduje indukcję konwersji formy PrPC do formy PrPSc. Nasuwa się pytanie o funkcje fizjologicznej for-my białka prionowego. Funkcje te nie są jak dotąd do
NA
UK
A
KR
Ó
TK
O
SZK
OŁA
końca poznane. Podejrzewa się, że może ona pełnić rolę dysmutazy nadtlenkowej oraz odgrywać rolę w ochro-nie komórek przed stresem oksydacyjnym (Rachidi i wsp., 2003). Inne badania wskazują natomiast na ich udział w regulacji rytmu snu i czuwania, stabilizacji ko-mórek nerwowych i ochronie osłonek neuronów (Bal, 2011). Forma fizjologiczna białka prionowego jest gli-koproteiną zbudowaną z 253 aminokwasów, dodatko-wo stabilizowaną przez jedno wiązanie disiarczkowe. Podczas modyfikacji wewnątrz komórek, nazywanych ogólnie modyfikacjami posttranslacyjnymi, do PrP przyłączane są reszty cukrowe i lipidowe. Białko to zlo-kalizowane jest na powierzchni komórki za pomocą GPI – glikozylofosfatydyloinozytolu, glikolipidu docze-pianego do C-końca białek (Stahl i wsp., 1987).
Gen kodujący białko prionowe
Szczególną cechą prionów jest możliwość ich prze-kazywania horyzontalnie, czyli na skutek zakażenia podczas spożywania mięsa zawierającego patogenne priony, skarmiania bydła mączką mięsno-kostną zawie-rającą PrPSc, przeszczepu opon mózgowo-rdzeniowych czy przyjmowaniu hormonu wzrostu od dawców do-tkniętych chorobami prionowymi (Allison, 2009). Jed-nak choroby prionowe mogą być również przenoszone poprzez odziedziczenie zmutowanego genu PRNP.
Gen kodujący białko prionowe – PRNP znajduje się w krótkim ramieniu 20. chromosomu. Tworzy on tylko jeden ekson, czego odkrycie obaliło nieprawidłową te-orię, że różne formy przestrzenne PrP wynikają z alter-natywnego składania eksonów.
Jak już wcześniej wspomniano białko prionowe w fi-zjologicznej postaci zakotwiczone jest w błonie komór-kowej i przyłączane są do niej reszty cukrowe. Cechy te nasunęły swego czasu badaczom ideę, że białko PrP jest receptorem dla hipotetycznego wirusa powodującego choroby u owiec. Obalanie tej teorii oraz wskazanie,
że to białko prionowe jest bezpośrednim czynnikiem patogennym, stało się możliwe dzięki konstruowaniu mutantów z mutacjami w genie PRNP. Okazało się, że niektóre mutacje uniemożliwiają białku przyjęcie nie-patogennej konformacji PrPC, a choroba rozwija się u tych osobników dużo szybciej (Prusiner, 1998).
5. Choroby prionowe – przykład chorób
konformacyjnych
Chorobami najczęściej kojarzonymi z prionami są choroba Creutzfeldta-Jakoba (CJD) i BSE – gąbcza-sta encefalopatia bydła (tzw. choroba szalonych krów). Pierwsza z nich została opisana w latach 20. ubiegłe-go stulecia. Jest to tzw. choroba neurodegeneracyjna, czyli postępujący, nieodwracalny proces zwyrodnie-nia komórek nerwowych (neuronów), prowadzący do ich obumierania. Proces ten jest wynikiem tworzenia się i agregacji nieprawidłowo zwiniętych form biał-ka, posiadających charakterystyczną konformację β-harmonijki. Choroby neurodegeneracyjne związa-ne z odkładaniem się takich zdegezwiąza-nerowanych białek
PrPC PrPSc
rozpuszczalne w środowisku wodnym TAK NIE podatne na trawienie proteazami TAK NIE dominująca struktura drugorzędowa alfa helisa beta
kartka
Ryc. 1. Porównanie postaci białka prionowego
Ryc. 2. Struktury drugorzędowe białka prionowego; od lewej forma fizjologiczna, od prawej hipotetyczny model formy patogennej Źródło: http://www. cmpharm.ucsf.edu/
cohen Ryc. 3 Hipotetyczny model powstawania PrP
Sc
(na podstawie Jackson i Clarke, 2000)
NA
UK
A
KR
Ó
TK
O
SZK
OŁA
noszą nazwę amyloidoz (Allison, 2009). CJD objawia się zanikiem pamięci, trzęsieniem się kończyn i utratą mimiki. W konsekwencji dochodzi do śmierci chore-go w ciągu 2 lat od pojawienia się pierwszych objawów (Prusiner, 1982). Niekorzystną cechą tej choroby jest brak odpowiedzi immunologicznej organizmu. Jest to spowodowane tym, że przyczyną choroby jest białko naturalnie występujące w organizmie ludzkim (Prusi-ner, 1998). Innymi chorobami prionowymi są: śmier-telna bezsenność rodzinna (FFI) – choroba genetyczna powodująca śmierć chorego w ciągu 36 miesięcy od wy-stąpienia objawów (Schenkein, 2006) czy choroba kuru występująca u dopuszczających się kanibalizmu człon-ków plemienia Fore, zamieszkującego Góry Wschodnie Papui Nowej Gwinei (Collinge, 2006). Podobne choroby występują również u innych organizmów, m.in. owiec, kotów lub krów. Krótką charakterystykę chorób prio-nowych przedstawia ryc. 4.
Podczas zakażenia patogenną formą białka priono-wego wyróżnia się cztery etapy infekcji (Epstein, 2005): 1. Penetracja – przedostanie się białka prionowego
do komórek układu pokarmowego, a stamtąd do układu limfatycznego,
2. Translokacja – wędrówka PrPSc po układzie lim-fatycznym i krwionośnym zakończona dostaniem się do obwodowego, a następnie centralnego ukła-du nerwowego (rzadziej do śledziony),
3. Namnażanie – konwersja form fizjologicznych do form patogennych, przyłączanie kolejnych podjed-nostek białka,
4. Patogeneza – różnego rodzaju skutki uboczne wy-nikające z odkładania się złogów amyloidowych. Choroby prionowe nie są jedynymi chorobami związanymi z błędnym zwijaniem się białek. Wszystkie takie schorzenia nazywa się chorobami konformacyj-nymi. Na ryc. 5 przedstawione jest zestawienie najważ-niejszych chorób konformacyjnych.
Choroba Gospodarz Mechanizm patogenezy
Kuru Członkowie plemie-nia Fore Infekcja podczas rytualnego kanibalizmu
iCJD Ludzie Infekcja poprzez zawierający priony hormon wzrostu, przy przeszczepie opony twardej vCJD Ludzie Infekcja bydlęcymi prionami (prawdopodobnie)
FCJD Ludzie Germinalna mutacja w genie PrP GSS Ludzie Germinalna mutacja w genie PrP
FFI Ludzie Germinalna mutacja w genie PrP (D178N, M129)
sCJD Ludzie Mutacja somatyczna lub spontaniczna konwersja PrPC w PrPSc FSI Ludzie Mutacja somatyczna lub spontaniczna konwersja PrPC w PrPSc
Scrapie Owce Infekcja u genetycznie podatnych osobników
BSE Bydło Infekcja poprzez zawierającą priony mączkę mięsno-kostną TME Norki Infekcja prionami od owcy lub bydła
CWD Mulaki, łosie Nieznany
FSE Koty Infekcja poprzez zawierającą priony wołowinę Egzotyczna
encefa-lopatia kopytnych
Kudu wielkie, niala,
oryx Infekcja poprzez zawierającą priony mączkę mięsno-kostną
Skróty: BSE – encefalopatia gąbczasta bydła; CJD – choroba Creutzfeldta-Jakoba; sCJD – sporadyczna CJD; fCJD – rodzinna CJD; iCJD – jatrogenna CJD; vCJD – wariant CJD; CWD – przewlekła choroba wyniszczająca; FFI – śmiertelna bezsenność rodzinna; FSE – kocia encefa-lopatia gąbczasta; FSI – śmiertelna sporadyczna bezsenność; GSS – zespół Gerstmanna-Sträusslera-Scheinkera; TME – przenośna encefalo-patia norek.
Ryc. 4. Zestawienie chorób wywoływanych przez priony
Na podstawie: Prusiner i wsp., 1998
Choroba Błędnie zwinięte białko Natura i umiejscowienie uszkodzeń
Choroba Alzheimera Peptyd A-beta Hiperufosforylowane białko Tau Zewnątrzkomórkowe blaszki starcze Splątki neu-rofibrylarne
Choroba Parkinsona alfa-Synukleina Cytoplazma neuronów Choroba Huntingtona Powtórzenie poliglutaminowe w huntingtynie Jądra i cytoplazma neuronów Cukrzyca typu II Wysepkowy polipeptyd amyloidowy (amylina) Agregaty w trzustce
Choroba Creutzfeldta-Jakoba Białko prionowe Płytki zewnątrzkomórkowe i oligomery wewnątrz i na zewnątrz neuronów
Ryc. 5. Porównanie chorób konformacyjnych
NA
UK
A
KR
Ó
TK
O
SZK
OŁA
Często w literaturze można spotkać się z informa-cjami na temat aktywności antyprionowej związków wykorzystywanych w leczeniu innych chorób konfor-macyjnych. Jest to przesłanka do twierdzenia, że być może wszystkie choroby (lub większość z nich) zwią-zane z nieprawidłowym zwijaniem się białek mają wspólne podłoże. Możliwe, że istnieje dodatkowe biał-ko występujące w biał-komórce, które pełni rolę centralnego węzła, inicjatora chorób konformacyjnych. Być może istnieje jeden, wspólny mechanizm błędnego zwijania się białek. Jednak jak do tej pory nie ma jednoznacznych informacji na ten temat.
„Stany prionowe” u drożdży
Na podstawie podanych wyżej informacji można sądzić, że priony są białkami stanowiącymi ogromne zagrożenie dla organizmów. I rzeczywiście tak jest, jeśli mamy na myśli organizmy ssacze. Okazuje się jednak, że istnieją organizmy, u których obecność tzw. stanów prinowych może odgrywać pozytywną rolę – chodzi tu o drożdże piekarnicze Saccharomyces cerevisiae. Te proste, jednokomórkowe organizmy są najlepiej pozna-nymi na poziomie genetyki i fizjologii komórki organi-zmami eukariotycznymi (Wawrzycka, 2011). Dlatego też nazywa się je organizmami modelowymi. S. cerevi-siae zawiera wiele białek, które zachowują się jak priony (Derkatch i wsp., 2001). Dodatkowo szlaki biochemicz-ne kontrolujące powstawanie agregatów prionów lub ich utrzymanie są zachowane od drożdży do człowieka (Bach i wsp., 2006).
Należy jednak wyraźnie zaznaczyć, że drożdżowe „stany prionowe” nie mają wiele wspólnego z priona-mi ssaczypriona-mi. Są to stany metaboliczne wywołane przez zmiany konformacyjne białek, niewykazujących homo-logii sekwencyjnej do PrP. Natomiast wspólną ich cechą jest możliwość przyjmowania dwóch różnych
konfor-macji bez zmiany sekwencji amino-kwasowej i odkładanie się w pew-nych warunkach w postaci złogów amyloidowych.
Najlepiej poznanym „stanem prionowym” u drożdży jest ten spo-wodowany obecnością czynnika [PSI+] (Cox i wsp., 1988). Komórki posiadające ten czynnik dużo częś-ciej pomijają kodony stop na koń-cu obszaru kodującego genu, przez co powstaje dłuższe niż powinno białko. Istotą czynnika [PSI+] jest białko Sup35. Jest ono czynnikiem terminacji translacji, składnikiem złożonego kompleksu uwalniającego rybosom od mRNA (ortolog ssacze-go eRF3) (Stansfield i wsp., 1995). Gdy dojdzie do inaktywacji Sup35, kompleks, którego jest składnikiem, przestaje działać poprawnie, powo-dując defekt w terminacji translacji. Drożdże wykazujące tę cechę ozna-cza się symbolem [PSI+], natomiast komórki bez takich zmian [psi-]. Istotę opisanego zjawiska przedsta-wia ryc. 6.
Istotnym momentem w badaniach nad czynnikiem [PSI+] było wykorzystanie mutacji w genie ADE2, któ-ry koduje jeden z enzymów niezbędnych do biosyntezy adeniny. Wykorzystywana mutacja wprowadza przed-wcześnie kodon stop – przez co powstaje krótkie, nie-funkcjonalne białko. Taki enzym nie pełni poprawnie swojej funkcji, a więc nie może dojść do dokończenia biosyntezy adeniny. Zamiast tego dochodzi do nagro-madzenia się półproduktu o czerwonej barwie (Silhan-kova, 1972). Przeprowadzono doświadczenie polegające
na wprowadzeniu czynnika [PSI+] do komórek droż-dżowych posiadających opisaną mutację w genie ADE2. Okazało się, że komórki takie w przeciwieństwie do ko-mórek [psi-] miały normalną, białą barwę (Cox i wsp., 1980). Tłumaczy się to tym, że czynnik [PSI+] umożli-wił pominięcie mutacji (przedwczesnego kodonu stop) w genie ADE2. Dzięki temu możliwe było powstanie funkcjonalnego enzymu i dokończenie biosyntezy ade-niny.
Ryc. 6. Związek Sup35 z czynnikiem [PSI+]
NA
UK
A
KR
Ó
TK
O
SZK
OŁA
Istnieje hipoteza o związku między czynnikiem [PSI+] a ewolucją genomu drożdży (True i wsp., 2004). Okazuje się bowiem, że z pewną częstością budowa przestrzenna białka Sup35 może się spontanicznie zmieniać i przyjmować nieaktywną formę. W zwy-kłych warunkach środowiska zmiana ta nie przynosi dla komórki korzyści. Jednak nagła zmiana warunków może spowodować, że jedyną możliwością przeżycia będzie posiadanie czynnika [PSI+]. W tych warunkach faworyzowane są oczywiście komórki [PSI+] i zaczyna-ją dominować w populacji, aczkolwiek spontanicznie powstają również komórki [psi-]. Gdy nastąpi powrót do warunków pierwotnych, lepiej przystosowanymi komórkami są te pozbawione czynnika [PSI+] i tym razem to one są faworyzowane i zaczynają dominować. Mechanizm ten umożliwia drożdżom szybkie dostoso-wanie się do zmieniających się warunków środowiska. W przeciwieństwie do zmian genetycznych przejście ze stanu [psi-] do stanu [PSI+] jest szybkie, a ponadto od-wracalne.
Strategie leczenia oraz problemy i wyzwania
związane z potencjalnymi lekami
antyprionowymi
Na poziomie molekularnym, terapeutyki potencjal-nie aktywne antyprionowo działają zgodpotencjal-nie z jedną z dwóch głównych strategii (Clare i wsp., 2006):
1) stabilizacja agregatów PrPSc (uniemożliwienie przyłączania kolejnych podjednostek) i hamowa-nie konwersji form PrPC do PrPSc,
2) niszczenie i usuwanie formy patogennej.
Z poznanych do tej pory związków o aktywności antyprionowej znakomita większość działa zgodnie z pierwszą strategią. Do związków tych należą m.in.: kurkumina, pochodne akrydyny, 2,5-diamino-1,4-ben-zochinony i naturalne polifenole.
Jednak do tej pory nie dysponujemy lekiem na cho-roby prionowe. Wszystkie związki, które dotąd zbadano pod względem aktywności antyprionowej, są aktywne jedynie in vitro. Brak aktywności in vivo podyktowany jest głównie dwoma przeszkodami:
• brakiem możliwości pokonania przez cząsteczkę
bariery krew-mózg i dotarcia do neuronów (miej-sca docelowego);
• słabą biodostępnością.
Pierwsza z tych przeszkód związana jest z występo-waniem w organizmach ssaków bariery krew-mózg. Jest to fizyczna i biochemiczna bariera pomiędzy naczynia-mi krwionośnynaczynia-mi a tkanką nerwową. Ma ona na celu chronić układ nerwowy przed szkodliwymi czynnika-mi, a także umożliwić selektywny transport substancji z krwi do płynu mózgowo-rdzeniowego. Substancje mogą pokonać tę barierę w jeden z dwóch możliwych sposobów: na drodze dyfuzji (głównie związki drobno-cząsteczkowe) i na drodze transportu aktywnego, przy udziale białek błonowych (peptydy i białka takie jak in-sulina czy oksytocyna).
W mojej opinii istnieją dwie zasadnicze drogi, które być może ułatwią ominięcie tej przeszkody:
1) metoda biologiczna – podanie leku bezpośrednio do rdzenia kręgowego (co wiąże się z niebezpie-czeństwem jego uszkodzenia) lub w obszary, gdzie szczelność bariery krew-mózg jest osłabiona (rejo-ny tylnego płata przysadki mózgowej czy okolice splotu naczyniówkowego) (Krzymowski i Przała, 2005);
2) metoda chemiczna – przyłączenie na drodze synte-zy organicznej grupy zdolnej do pokonania bariery krew-mózg do związku o pożądanej aktywności. Drugim poważnym problemem jest ograniczona biodostępność niektórych związków. W tym przypad-ku zasadniczą rolę odgrywa rozpuszczalność danego
związku w płynach ustrojowych, których głównym składnikiem jest woda.
Najprostszym rozwiązaniem tego problemu jest syn-teza pochodnej danego związku, która będzie wykazy-wała pożądaną aktywność, ale której rozpuszczalność w wodzie będzie dostatecznie dobra. W tym przypadku może się jednak okazać, że zwiększona biodostępność danego związku spowoduje skutki uboczne dla organi-zmu.
Testy na aktywność badanego związku
Istnieje kilka metod sprawdzenia, czy dany związek jest rzeczywiście aktywny pod względem antypriono-wym. Przedstawię dwie, w moim odczuciu, najprostsze metody.
Metoda z wykorzystaniem drożdży (Cox i wsp., 1980) – w tym przypadku wykorzystuje się opisany wy-żej fakt, że „stany prionowe” u drożdży sprzyjają pomi-janiu kodonu stop w obszarze kodującym genu, przez co powstają aktywne, niezmutowane białka. Gdy w genie ADE2, który koduje jeden z enzymów niezbędnych do syntezy adeniny wprowadzi się przedwczesny kodon stop uniemożliwi to powstanie enzymu o odpowied-niej długości. Synteza adeniny nie będzie wtedy moż-liwa i dojdzie do nagromadzenia półproduktu, który jest czerwony. W przypadku „stanów prionowych” na-stępuje supresja kodonu stop, gdyż czynnik terminacji translacji Sup35 jest nieaktywny i powstaje prawidło-wy enzym, a co za tym idzie – nia ma czerwonej bar-wy. Gdy więc badany przez nas związek jest aktywny (związkiem tym nasącza się bibułę i umieszcza się ją na szalce z hodowlą drożdżową) pojawia się czerwone za-barwienie „wyleczonych” komórek (ryc. 7).
NA
UK
A
KR
Ó
TK
O
SZK
OŁA
Metoda z wykorzystaniem proteinazy K (Caughey i wsp., 2003) – w metodzie tej wykorzystuje się fakt, że forma PrPC jest podatna na trawienie, natomiast forma PrPSc nie ulega hydrolizie pod wpływem proteinazy K (PK). Komórki zainfekowane prionami (bardzo często są to komórki ScN2a, czyli mysie komórki nerwiaka płodowego) poddaje się działaniu badanego związku w odpowiednim stężeniu, a następnie uzyskuje się lizat komórkowy, który poddawany jest działaniu proteinazy K. Jeśli związek jest aktywny, priony występujące w li-zacie zostają strawione przez PK. Jeśli jest przeciwnie – PK nie strawi prionów (związek jest nieaktywny).
Poszukiwania leków antyprionowych
W części tej opiszę kilka z licznych związków wyka-zujących in vitro aktywność antyprionową.
Prostym i szybkim sposobem weryfikacji dużej ilo-ści związków pod względem zdolnoilo-ści do hamowania tworzenia złogów amyloidowych jest metoda opisana w 2003 r. w Journal of Virology (Kocisko, 2003). Bada-nia te miały na celu wyłonienie klas związków, które mogą być rozpatrywane pod kątem farmakoterapii an-typrionowej. Test został wykonany na bibliotece 2000 związków, które były już stosowane jako leki w leczeniu innych chorób (niekoniecznie neurodegeneracyjnych) lub były znanymi związkami naturalnymi. Metoda po-stępowania była zmodyfikowaną wersją metody z wyko-rzystaniem proteinazy K, którą opisałem w poprzednim rozdziale. Różnica polegała na umieszczaniu zainfeko-wanych komórek na płytce zawierającej 96 wgłębień, a następnie dodawaniem do każdego z wgłębień innego związku w odpowiednim stężeniu.
Dzięki przeprowadzonym badaniom udało się wy-brać 17 najbardziej aktywnych inhibitorów (ryc. 8).
Pośród wyłonionych 17 najbardziej aktywnych in-hibitorów znalazły się związki należące do pięciu klas:
1) polifenole – związki za-wierające wiele grup feno-lowych odpowiadających za właściwości przeciwu-tleniające tych związków; 2) leki antymalaryczne –
związki wykorzystywane w leczeniu malarii – tro-pikalnej choroby pasożyt-niczej;
3) leki antyhistaminowe – związki opóźniające i ła-godzące reakcje alergicz-ne poprzez blokowanie działania receptorów od-powiadających za uwal-nianie histaminy; 4) fenotiazyna i jej
pochod-ne – związki wykorzysty-wane w leczeniu zaburzeń psychicznych;
5) inne.
Ryc. 7. Etapy testu na aktywność antyprionową z wykorzystaniem drożdży
Na podstawie: Bach i wsp., 2003
Ryc. 8. Schemat postępowania podczas badania biblioteki związków
NA
UK
A
KR
Ó
TK
O
SZK
OŁA
Faktem przemawiającym za wiarygodnością uzy-skanych wyników jest to, że dwa spośród 17 wyłonio-nych, najaktywniejszych inhibitorów była znana już wcześniej ze swojej aktywności antyprionowej – były to lowastatyna i chinakryna.
Kurkumina (ryc. 9) jest głównym składnikiem kurkumy – przyprawy azjatyckiej zwanej również szafranem indyj-skim. Stosowana jest również jako żółto-pomarańczowy pigment. Strukturę związku ustalili w 1910 r. Stanisław Ko-stanecki, Janina Miłobędzka i Wiktor Lampe (Miłobędzka i wsp., 1910). Jest ona w kręgu zainteresowań naukowych już od dawna ze względu na szeroką gamę aktywności bio-logicznych: przeciwutleniających, przeciwzapalnych, prze-ciwwirusowych, antybakteryjnych i przeciwgrzybiczych, mogących przydać się w leczeniu nowotworów, cukrzycy, reumatoidalnego zapalenia stawów, Alzheimera i innych przewlekłych chorób.
Ten niezwykle intensywnie badany związek posiada kilka cech sprawiających, iż stał się on również intere-sującym obiektem badań pod kątem zastosowania jako lek antyprionowy (Demaimay i wsp., 1998):
• Jest strukturalnie podobny do czerwieni Kongo
(ryc. 10) – najbardziej aktywnego, niskocząstecz-kowego inhibitora PrPSc zbadanego do roku 2003: obydwa są związkami płaskimi, zawierającymi dwa pierścienie aromatyczne bądź system pierście-ni aromatycznych połączonych łączpierście-nikami. Bada-nia wykazały, iż płaska struktura pierścieni i łącz-nika są ważne dla aktywności inhibicyjnej.
• Kurkumina jest przeciwutleniaczem – istnieją
przesłanki mówiące, iż ta właściwość związków może mieć korzystny wpływ na aktywność anty-prionową (Kocisko, 2003).
• Kurkumina jest składnikiem ludzkiej diety. Wiele
osób spożywa kurkuminę w dużych ilościach bez oznak jej toksyczności.
Badanie właściwości antyprionowych kurkuminy przeprowadzono zgodnie z metodą wykorzystującą proteinazę K. Okazało się, iż stężenie kurkuminy po-trzebne do 50% inhibicji wynosi 10 nM (jest to tzw. współczynnik IC50). Naukowcy wykonujący opisane badania określili działanie kurkuminy jako silne, nie-odwracalne i selektywne w komórkach ScNB (komórki nerwiaka płodowego zainfekowane prionami) (Cau-ghey, 2003).
Wykonano również badania na chomikach (kurku-mina mieszana była z pokarmem podawanym gryzo-niom) mające na celu wykazanie, czy kurkumina zdol-na jest do inhibicji konwersji (zmiany postaci) białek prionowych wewnątrz organizmu żywego (więc rów-nież czy zdolna jest do pokonania bariery krew-mózg). Niestety kurkumina nie wypadła pozytywnie w tym te-ście, w związku z czym nie jest ona zdolna do działania antyprionowego in vivo (Caughey, 2003).
Podsumowując tę część wykazano, iż kurkumina hamuje akumulację złogów amyloidowych in vitro. Jest więc jednym z najmniejszych (w sensie masy cząstecz-kowej) i najbardziej aktywnych inhibitorów formowa-nia się PrPSc. Niestety, w postaci występującej natural-nie natural-nie jest ona zdolna do pokonania bariery krew-mózg (na co wpływ ma też jej słaba biodostępność). W moim przekonaniu badania nad kurkuminą powinny podą-żać w stronę otrzymania pochodnej, która bez utraty aktywności antyprionowej będzie wykazywała dużo większą biodostępność.
Dendrymery (gr. dendron – drzewo) są związkami, których historia liczy już około 30 lat. Po raz pierwszy zostały zsynte-tyzowane przez niemieckiego chemika Fritza Vögtla w 1978 roku (Buhleier i wsp., 1978). Pod względem chemicznym dendrymery są polimerami cechującymi się budową rozga-łęzioną, trójwymiarową, o kształcie zbliżonym do kuli.
W budowie strukturalnej dendrymerów można wy-różnić wielofunkcyjny rdzeń, od którego promieniście odchodzą „gałęzie” (ramiona) dendrymerów zwane dendronami. Na końcu dendronów znajdują się wolne grupy funkcyjne, które mogą być zmienione przez róż-nego rodzaju podstawniki modyfikujące właściwości chemiczne i fizyczne cząsteczki dendrymeru (Sękowski i wsp., 2008).
Te fraktalopodobne, regularne struktury są stosun-kowo nowymi i wysoce rozgałęzionymi polimerami, mającymi wiele interesujących właściwości. Związki te mogą być wykorzystane m.in. jako: przenośniki leków i genów, czynniki kontrastujące czy wskaźniki różnych jonów metali. Kuliste cząsteczki tych związków odzna-czają się również aktywnością farmakologiczną. Obec-nie dendrymery są intensywObec-nie badane jako czynniki antyprionowe i zabezpieczające przed formowaniem się blaszek amyloidowych (Sękowski i wsp., 2008).
Dendrymery są jedyną, opisaną klasą związków posiadających zdolność do usuwania istniejących pa-Ryc. 9. Struktura kurkuminy
NA
UK
A
KR
Ó
TK
O
SZK
OŁA
togennych form białka prionowego z zainfekowanych komórek (Supattapone i wsp., 2009). Wśród licznych rodzajów dendrymerów największą aktywność anty-prionową wykazują dendrymery poliamidoaminowe (PAMAM) (ryc. 11).
Podczas badań z wykorzystaniem proteinazy K) dendrymery PAMAM zdolne były do selektywnego usuwania PrPSc z komórek ScN2a. Autorzy przypisują badanym związkom następujące cechy, nadające im ak-tywność antyprionową:
• duża gęstość powierzchniowa ładunku (zamiana
grup aminowych na hydroksylowe powoduje za-nik aktywności antyprionowej),
• rozgałęziona struktura.
Mechanizm działania dendrymerów
Aby wyjaśnić w jaki sposób dendrymery zdolne są do niszczenia i usuwania form PrPSc opiszę w pierw-szej kolejności hipotetyczny mechanizm powstawania i akumulacji PrPSc (ryc. 12).
Białka prionowe są syntetyzowane na powierzchni siateczki endoplazmatycznej. Tam też (oraz wewnątrz struktur aparatu Golgiego) odbywają się główne mo-dyfikacje posttranslacyjne – glikozylacja i modyfikacja grup glikozylowych (Otvos i wsp., 2002). Następnym etapem jest transport do powierzchni błony komórko-wej i konwersja PrPC do PrPSc. Konwersja ta może wy-magać interakcji z endogennymi lipidami i polianiona-mi, występującymi prawdopodobnie na powierzchni błony komórkowej. Nieprawidłowo sfałdowania białko zostaje rozpoznane przez białko 1 pokrewne recepto-rowi lipoprotein (LPR1) wraz z tym białkiem otoczone częścią błony komórkowej – powstaje struktura zwana endosomem. Endosom zostaje następnie podzielony na dwie części: jedna zawierająca LPR1 zostaje z powrotem połączona z błoną komórkową, natomiast druga –
za-Ryc. 11. Struktura PAMAM (po lewej) z powiększonym dendronem (po prawej)
Źródło: http://www.dendritech.com/pamam.html Ryc. 12. Hipotetyczny mechanizm biosyntezy białek prionowych Na podstawie: Supattapone i wsp., 2009
NA
UK
A
KR
Ó
TK
O
SZK
OŁA
wierająca błędnie zwinięte białko zostaje połączona z lizosomem – organellum komórkowym zawierają-cym kwaśne enzymy hydrolityczne rozkładające białka, kwasy nukleinowe, węglowodany i tłuszcze (Mizerski, 2004). Ponieważ jednak PrPSc nie podlegają trawieniu przez proteazy dochodzi do ich akumulacji wewnątrz lizosomu i tworzenia złogów amyloidalnych.
Proponowany mechanizm działania dendrymerów zakłada ich działanie wewnątrz lizosomów (ryc. 13). Dendrymery stają się częścią endosomu (wraz z PrPSc i LPR1), a następnie lizosomu. Kwaśne środowisko wnę-trza lizosomu powoduje „aktywację” grup aminowych (powstają kationy) dendrymerów, które denaturują i rozbijają złogi amyloidowe. Nie wykluczone, iż rów-nież enzymy występujące wewnątrz lizosomów pełnią funkcję aktywatorów tego procesu.
Reasumując, dendrymery jako jedyne, dotąd opisa-ne związki zdolopisa-ne są do usuwania z komórek
patogen-nych form białka prionowego. Ich działanie umożliwia ich akumulacja wewnątrz lizosomów (gdzie akumulują się również PrPSc) oraz kwasowe środowisko tych orga-nelli komórkowych.
Wyzwania jakie stoją przed naukowcami badający-mi dendrymery pod względem aktywności antypriono-wej to:
• sposób dostarczania leków do organizmu,
• zwiększenie ich biodostępności,
• uniknięcie potencjalnych, neurologicznych
skut-ków ubocznych wynikających ze stosowania den-drymerów jako leku.
Podsumowanie
Podobnie jak tytułowa nowela „Strange Case of Dr Jekyll and Mr Hyde” kojarzona jest z portretem
podwój-nej osobowości, tak białka prionowe mogą stanowić molekularny przykład dwoistości natury. Dodatkowo pytanie, czy Jekyll pokonał Hyde w powieści Stevenso-na, w przypadku białek prionowych może brzmieć: czy jesteśmy w stanie „pokonać” patogenną postać białka prionowego? Jak na razie trudno jest odpowiedzieć na to pytanie ponieważ biologia i biochemia białek priono-wych, jak również aspekty fizykochemiczne związków o aktywności antyprionowej nie są w pełni wyjaśnione. Problemy te są zatem często poruszane w pracach na-ukowych z pogranicza wyżej wymienionych dziedzin nauki i jedynie interdyscyplinarne podejście do tego zagadnienia może zaowocować wymiernymi osiągnię-ciami.
Z pewnością wyjaśnienie zagadki jaką postawiła przed nami natura – białka prionowe – przyczyni się znacząco do rozwoju światowej nauki oraz myśli bio-chemicznej.
Literatura
Pruisner SB (1982). Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216(4542):136-44
Jackson GS, Clarke AR. (2000). Mammalian prion proteins. Curr
Opin Struct Biol. 10: 69-74
Rachidi W, Vilette D, Guiraud P, Arlotto M, Riondel J, Laude H, Leh-mann S, Favier A (2003). Expression of prion protein increases cellular copper binding and antioxidant enzyme activities but not copper delivery. J Biol Chem. 278:9064-9072
Bal J (2011). Biologia molekularna w medycynie. Warszawa: Wydaw-nictwo Naukowe PWN
Vanik DL, Surewicz WK (2002). Disease-associated F198S mutation increases the propensity of the recombinant prion protein for conformational conversion to scrapie-like form. J. Biol. Chem. 277:49065-49070
Allison LA (2009). Podstawy biologii molekularnej. Warszawa: WUW Prusiner SB (1998). Prions. Proc Natl Acad Sci USA. 95:13363-83 Schenkein J (2006). Self Management of Fatal Familial Insomnia.
Part 1: What Is FFI? Medscape General Medicine. 8(3):65 Collinge J, Whitfield J, McKintosh E, Beck J, Mead S, Thomas DJ,
Alpers MP (2006). Kuru in the 21st century—an acquired human
Ryc. 13. Mechanizm działania dendrymerów
Na podstawie:
NA
UK
A
KR
Ó
TK
O
SZK
OŁA
prion disease with very long incubation periods. Lancet. 9528 (367):2068–2074
Epstein RJ (2005). Biologia molekularna człowieka. Lublin: Wyd. CZELEJ
Wawrzycka D (2011). Drożdże jako model w badaniach chorób neurodegeneracyjnych. Postępy Hig Med Dosw (online). 65:328-337 Derkatch IL, Bradley ME, Hong JY, Liebman SW (2001). Prions
af-fect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)]. Cell. 106(2):171-82
Bach S, Tribouillard D, Talarek N, Desban N, Gug F, Galons H, Blon-del M (2006). A yeast-based assay to isolate drugs active against mammalian prions. Methods. 39: 72–77
Cox BS, Tuite MF, McLaughin CS (1988). The psi factor of yeast: a problem in inheritance. Yeast 4:159-178
Stansfield I, Jones KM, Kushnirov VV, Dagkesamanskaya AR, Po-znyakovski AI, Paushkin SV, Nierras CR, Cox BS, Ter-Avanesyan MD, Tuite MF (1995). The products of SUP45 (cRF1) and SUP35 genes interact to mediate translation termination in
Saccharomy-ces cerevisiae. EMBO J. 14(17):4365-4373
Uptain SM, Lindquist SL (2002). Prions as protein-based genetic ele-ments. Annu Rev Microbiol. 56:703-741
Silhankova L (1972). Joined suppression of rough phenotype and of red colour of ade2-1 mutants in Saccharomyces cerevisiae. Folia
Microbiol. 17(6):479-489
True HL, Berlin I, Lindquist SL (2004). Epigenetic regulation of translation reveals hidden genetic variation to produce complex traits. Nature 431(7005):184-187
Clare R, Trevitt and John Collinge (2006). A systematic review of prion therapeutics in experimental models. Brain. 129:2241-2265 Krzymowski T, Przała J (2005). Fizjologia zwierząt: podręcznik dla
studentów wydziałów medycyny weterynaryjnej, wydziałów biolo-gii i hodowli zwierząt akademii rolniczych i uniwersytetów.
War-szawa: Państwowe Wydawnictwo Rolnicze i Leśne
Cox BS, Tuite MF, Mundy CJ (1980). Reversion from suppression to nonsuppression in SUQ5 [psi+] strains of yeast: the classificaion of mutations. Genetics. 95(3):589-609
Bach S, Talarek N, Andrieu T, Vierfond JM, Mettey Y, Galons H, Dor-mont D, Meijer L, Cullin C, Blonde M (2003). Isolation of drugs active against mammalian prions using a yeast-based screening assay. Nature Biotechnology. 21:1075 – 1081
Caughey B, Raymond LD, Raymond GJ, Maxson L, Silveira J, Baron GS (2003). Inhibition of Protease-Resistant Prion Protein Accu-mulation In Vitro by Curcumin. J Virol 77: 5499-5502
Kocisko D, Baron GS, Rubenstein R, Chen J, Kuizon S, Caughey B (2003). New Inhibitors of Scrapie-Associated Prion Ptotein For-mation in a Library of 2,000 Drugs and Natural Products. J Virol. 77:10288-10294
Miłobędzka J, Kostanecki S, Lampe V (1910). Zur Kenntnis des
Curcumins. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft. 43(2):2163–2170
Demaimay R, Harper J, Gordon H, Weaver D, Chesebro B, Caughey B (1998). Structural aspects of Congo red as an inhibitor of protease resistant prion protein formation. J Neurochem. 71:2534–2541. Buhleier E, Wehner W, Vögtl F (1978). „Cascade“ and
„Nonskid--Chainlike” syntheses of molecular cavity and topologies.
Synthe-sis. 2:155–158
Sękowski S, Miłowska K, Gabryelak T (2008). Dendrimers in bio-medical sciences and nanotechnology. Postepy Hig Med Dosw. 62:725-733
Supattapone S, Piro JR, Rees JR (2009). Complex Polyamines: Unique Prion Disaggregating Compounds. NIH. 8:323-328
Otvos L Jr, Cudic M, (2002). Post-translational modifications in prion proteins. Curr Protein Pept Sci. 3(6):643-52.
Mizerski W (2004). Tablice biologiczne. Warszawa: Wydawnictwo Adamantan
Molecular Dr. Jekyll and Mr. Hyde
Kamil Lisiecki
Prion proteins are as yet very poorly known family of pro-teins. However, their unique characteristics make them, since their discovery (which was rewarded with the Nobel Prize) intensively investigated object. In addition, a sur-prising nature of prion proteins – proteins with two faces – makes them an extremely interesting biological curios-ity.
Key words: prion, prion diseases, PRNP, antiprion activity, Creutzfeldt-Jacob disease, BSE, curcumin, dendrimers, yeast
