EIN BEITRAG ZUR KENNTNIS DER
WACHSTUMS-UNO GÄRUNGSPHYSIOLOGIE DER
SACCHAROL
YTISCHEN
CLOSTRIDIEN
/
, '1PROEFSCHRIFT
TER VERKRIJGING VAN DE GRAAD VAN DOCTOR IN DE TECHNISCHE WETENSCHAP AAN DE TECHNISCHE HOGESCHOOL TE DELFT, OP GEZAG VAN DE RECTOR MAGNIFICUS DR. O. BOTTEMA, HOOGLERAAR IN DE AFDELING DER ALGEMENE WETENSCHAPPEN, VOOR EEN COMMISSIE UIT DE SENAAT TE VERDEDIGEN OP
I
WOENSDAG 8 JULI 1959, DES NAMIDDAGS TE 2 UUR
DOOR
ARNOJOHANNESSCHOCHER
GEBOREN TE CHUR (ZWITSERLAND)'9,9
DIT PROEFSCHRIFT IS GOEDGEKEURD DOOR DE PROMOTOR PROF. T. O. WIKÉN
DE BEWERKING VAN DIT PROEFSCHRIFT GESCHIEDDE VOOR EEN DEEL AAN DE "EIDG. TECHN. HOCHSCHULE"
Aan mijn ouders Aan mijn vrouw
DIT ONDERZOEK WERD VERRICHT MET STEUN VAN
HET "SCHWEIZ. NATIONALFONDS"
EN
HET DELFTS HOGESCHOOLFONDS.
DE UITGAVE VAN HET PROEFSCHRIFT WERD MOGELIJK GEMAAKT DOOR EEN BIJDRAGE VAN
INHALTSVERZ E ICHNIS
Kapitel 1
Allgemeines zu den Clostridium-Arten. . . .
1. 1 Etwas zur praktischen Bedeutung von Clostridien . . . .
1. 2 Zur Biochemie der Neutralproduktegärung von Clostridien Kap itel 2
Ammoniumsalze und Aminosliuren als Stickstoffquellen und ihr Einfluss auf die Verteilung der Endprodukte der Glukose-dissimilation von Clostridium butyricum . . . " . . . . 2.1 Einleitung. . . " .
2.2 Zur Eignung von Ammoniumsalzen und Aminosliuren" als Stickstoffquellen. . . . .
2.2.1 Aminosliuren. . . . . . . 2.2.2 Ammoniumsalze.- . . . " . . . .
2.2.3 Wechselwirkungen zwischen Ammoniumsalzen und Aminosäuren . . . . 2.2.4 Diskussion der Resultate . . . . 2.3 Zum Einfluss von Ammoniumsalzen und Aminosliuren auf die Verteilung der Dissimilationsprodukte. . " . . . . .
Kapitel 3
Versuche zur Abkllirung der Wirkungsweise einer toxischen Aminosäure bei Clostridium butyricum . . . . 3.1 Einleitung. . . " .
3.2 Die Sonderstellung des D-8er ins unter den das Wachstum von Clostridium butyricum hemmenden "Aminosliuren. . 3.2.1 Gleichzeitige Verabreichung von Metabolit und 3.2.2
3.2.3 3.2.4
Antagonist . . . " . . . . Zusatz der Antagonisten zu wachsenden Kulturen Reversionsversuche . . . .
Quantitative Aminosliurenanalysen in wachsenden" und gehemmten Kulturen . . . . 3.2.5 Die Verbreitung des D-8erin-Effektes. . . . .
3.2.6 Zusammenfassung und Diskussion der Resultate 3.3 Versuche zur Ermittlung der durch D-Serin
beeintrlich-tigten physiologischen Systeme . . . . 3.3.1 Einleitung. . . " . . .
3.3.2 Der Einfluss des D-Serins auf Sporenkeimung und 3.3.3
3.3.4 3.3.5
Sporulierung. . . . .
Der Einfluss des D-Serins auf die Dissimilation der Glukose. . . .
Der Einfluss des D-8erins in der induzierten Enzymbildung. . . . . . . Der Einfluss des D-8erins auf den Nukleinsliure-spiegel . 3.4 Schlussdiskussion . . . . 7 8 11 15 15 16 17 .26 · 28 . 30 .32 .41 · 41 .45 .45 · 51 . 57 · 60 .64 . 69 .71 .71 . 72 .75 .79 84 87
Kapitel 4
Adaptive Enzymsysteme bei Clostridium butyricum ~r. 174 . 89 4.1 Einleitung . . . 89 4.2 Adaptive Enzymsysteme . . . 90 4.3 Die induzierte Biosynthese von ~-Glukosidase in
ruhenden Kulturen . . • . . . 93 4.3. 1 Bedingungen für die Enzym-Jnduktion. . . 93 4.3.2 Inhibitoren der induzierten Biosynthese von
~-Glukosidase . . . 99 4.3.3 Allgemeine Diskussion. . . 102 4.4 Die Induktion von a-Galaktosidase . . . 103 4.4.1 Bedingungen fUr die Enzym-Jnduktion. . . . 103 4.5 Vergleichende Betrachtung der Induzierbarkeit der
adaptiven Enzymsysteme bei Clostridium butyricum Nr. 174 105 Kapitel 5
Einige Bemerkungen zur Wirkungsweise der Oligosaccharidasen von Clostridium butyricum Nr. 174 . . . 107 5.1 a-Glukosidase . . . . . 108 5. 2 ~-Glukosidase . . . • . 109 5.2.1 Der enzymatische Abbau von Cellobiose . . . . 109 5.2.2 Der enzymatische Abbau von Gentiobiose . . . . 110 5.2.3 Bemerkungen zum Transglukosidierungsvermögen
der ~-Glukosldase . . . 110 5. 3 ~ -Fruktofuranosidase . . . 111 5.4 a -Galaktosidase. . . 112 5.4.1 Der enzymatische Abbau von Raffinose . 112 5.4.2 Der enzymatische Abbau von Stachyose . 115 5.4.3 Der enzymatische Abbau von Melibiose. 115 5.4.4 Bemerkungen zur a-Galaktosldase von
Clostridium butyricum Nr. 174 . . . . 115 Kapitel 6 Methodik . . . 116 6.1 Allgemeine Methodik 116 6.1. 1 Zu Kapitel 2 116 6.1. 2 Zu Kapitel 3 118 6.1.3 Zu Kapitel 5 120 6.2 Spezielle Methodik . . • . . . • . . . . . 120 6.2.1 NährlBsungen und die Gewinnung von Zellmaterlal. 120 6.2.2 Gärgefässe... . . . 121 6.2.3 WachstumsD1essungen . . . 122 6.2.4 Das Arbeiten unter anaeroben, aseptischen
Bedingungen . . . • . 123 6.2.5 Zum Einfluss des Wassers auf das Wachstum von
Clostrldium butyricum Nr. 174 124
Zusammenfassung 125
Samen va tting. . . 128
Summary . . . 131
KAPITEL 1
ALLGEMEINES ZU DEN CLOSTRIDIUM-ARTEN
Die Gattung Clostridium Prazmowski ist in der reinen Wis-senschaft, vJie auch vom praktischen Standpunld aus betrachtet, von grosser Bedeutung. Sie umfasst alle anaeroben bis mikro-aerophilen, meistens beweglichen, stäbchenförmigen Bakterien, die sowohl zahlreiche Kohlehydrate, wie auch Proteine und andere Stickstoffverbindungen dissimilieren können und überdies zur Sporenformung befähigt sind. Ber gey's Manual (1957) weist diesem Geschlecht 93 verschiedene Arten zu. Man teilt diese häufig nach ihrer mehr oder weniger ausgeprägten Substratspezifität in zwei grosse Gruppen ein:
1. Vorwiegend saccharolytische Clostridien, alle jene Typen umfassend, die imstande sind durch Dissimilation irgend-welcher Kohlehydrate ihre lebensnotwendige Energie zu gewinnen. Sehr oft können die Angehörigen dieser ca. 55 Spezies zählenden Gruppe eine grosse Anzahl ganz
ver-schiedener Oligo- und Polysaccharide' angreifen. Wie aber Peterson und Fred (1932) gezeigthaben, gibt es ausge-prägte saccharolytische Arten, denen relativ starke pro-teolytische Fähigkeiten zukommen.
2. Vorwiegend proteolytische Clostridien, welche ihren Energiebedarf in erster Linie aus dem Abbau von Proteinen und anderen stickstoffhaltigen Verbindungen, wie z. B. Aminosäuren und Harnstoff, decken. Zu dieser Kategorie darf man nach Be r g e y 9 Arten rechnen.
Alle übrigen Typen lassen sich nicht eindeutig in die vorliegende Gruppierung einreihen.
Berücksichtigt man neben der Heterogenität der Nährsub-strate noch die grosse Variabilität der optimalen Wachstums-temperaturen von 20 - 650 C, ist es ver ständlich , dass man
Clostridien überall antreffen kann. So stammen denn auch die bisher isolierten Reinkulturen aus den verschiedensten Biotopen, wie Abwasser, Boden, Faeces, Fleisch, FrUchte, Kadaver, Käse, Milch, Pflanzen, Wunden, etc., ab (vgl. Donker, 1926; Richard, 1948; Bergey' s Manual, 1957).
1. 1 ETW AS ZUR PRAKTISCHEN BEDEUTUNG VON CLO-STRIDIEN
Einige Arten, vor allem des proteolytischen Typus, haben sich als humanpathogen erwiesen. Dazu gehört z. B. Clostridium histolyticum, das zufolge seiner peptonisierenden Eigenschaften Gewebenekrosen erzeugt (Oakley und Warrack, 1950). Auf ähnlichem Prinzip beruhen die durch Clostridium multifer-mentans hervorgerufenen Gasbranderkrankungen (vergleiche St 0 d dar d, 1919). Etwas anderer Art ist die Pathogenität von
Clostridium haemolyticum, welches haemolytische Exoenzyme produziert (vergleiche Mc Clung und Toabe, 1947). Am bekanntesten und auch am gefährlichsten sind die Exotoxine von Clostridium botulinum (H a zen, 1942), dem Erreger des Botulismus, sowie von Clostridium tetani (H 0 11 a nd, 1920),
dem Urheber des Starrkrampfes. Ausnahmsweise können aber auch rein saccharolytische Stämme in der gleichen Welse pathogen sein (z.B. Clostridium fallax, Duthie, 1924). Oft können diese Krankheiten mit spezifischen Antitoxinen auf immunologischem Wege bekämpft werden (z. B. Tetanus). Im Falle des Botulismus ist man aber leider noch nicht so weit, und die einzige Prophylaxe gegen das betroffene Toxin besteht in dessen Fernhaltung vom menschlichen Körper, resp. der vollständigen Säuberung der Nahrungsmittel, die als Trägersub-stanz dieses Organismus in Frage kommen. Damit wurde bereits auf das Problem der Clostridien in der Lebensmittelbereitung hingewiesen.
Abgesehen von der Bereitung spezieller Käsesorten (z. B. in der Schweiz) sind die Clostridien in der Nahrungsmittelindu-strie völlig unerwünscht. SpezielIe Schwierigkeiten bei der Abtötung dieser Keime obliegen vor allem der Konservenindu-strie (vgl. Howard, 1949; Baumgartner und Hersom, 1956). Bei der Haltbarmachung von Fleisch, Gemüsen, Früchten etc. gereichen diese geeigneten Trägersubstanzen flir Clostri-dien in anaerobe Systeme, wo hernach leicht Massenvermeh-rungen stattfinden können. Die resistenten Sporen - solche von Clostridium caloritolerans überleben noch eine Hitzebehandlung von 100 oC während 520 Minuten (Meyer und Lang, 1926) -können nur durch massivere Behandlungen abgetötet werden. Aber auch freigelagerte Lebensmittel, vor allem Fleisch, werden oft durch Anaerobier vergiftet (Grüttner, 1932;
Tuchschneid, 1951).
Neben den pathogenen Spezies gibt es noch eine Vielzahl von saccharolytischen Clostridien, die beim Verderb- von Lebensmitteln im Sinne von Geschmacks-, Farb- und
stenzveränderungen eine wichtige Rolle spielen, so z. B. die in Tabelle 1 aufgefUhrten Arten.
TABELLE 1
Organismus Prozess Symptom Autor
Cl. multifermentans Schokoladen- Scheidung der Hill (1925) herstel1ung
Schokoladen-creme
Cl. beijerinckii Olivengä.rung Schlechter Gililland
Cl. bu~ricum Geruch und Vaughn
1194::1\" Cl. ~robu~ricum Klls ebereitung Spätblähung Frazier 11958\ Cl.thermosaccharo- Konserven- Blähung der Cameron
lyticum, u.a.m. bereitung . BUchsen; käsi- und Esty ger, saurer (1940) Geruch
Anderseits werden aber in der Industrie Clostridium - Arten auch nutzbringend verwendet. Beispiele hierfür sind Clostri-dium felsineum, Cl. haumanii und Cl. pectinovorum, die dank ihres pektinabbauenden Vermögens in der Flachsrösterei wendung finden (vgl. Thaysen und Bunker, 1927). Ver-hältnismässig neu, und vermutlich noch nicht in grosstech-nischem Massstab betrieben, ist die Gewinnung von J>roto-plasten aus Pflanzenabfallmaterial mittels Clostridium roseum. Whi te et al. (1948) gelang in 48-stUndiger Gärung eine
voll-kommene Freilegung der Protoplasten aus Blättern der
verschiedensten pflanzen, wie Bohnen, Luzerne, RUben, Gras etc. Diese Autoren berechneten, dass nach ihrer Methode aus den ca. 2 Mill. Tonnen in den U.S.A. anfallenden Pflanzen-abfallprodukten jährlich 50000 Tonnen an verdaulichem Protein, sowie 20 Tonnen Karotin zurUckgewonnen werden könnten.
Wohl die grösste industrielle Bedeutung erlangten die Clostridien dank ihres Vermögens aus Kohlehydrate·n Butanol, Azeton und Isopropanol zu bilden. Eine grosse Nachfrage îûr Azeton als Lösungsmittel fUr Sprengstoffe (" cordite") und îûr Butanol als Ausgangsstoff fUr das zur Synthese von Gummi verwendete Butadien während des ersten Weltkrieges, gab dabei den Anlass für eine sprunghafte industrielle Entwicklung dieser Gärung, Aber auch der stets steigende Bedarf an orga-nischen Lösungsmitteln in der chemischen Industrie gaben dem Ausbau der Butanol-Azeton-Gärungsbetriebe starke Impulse. So wurden im Jahre 1945 in den U. S. A. 19080 Tonnen Azeton, oder 7,3% der Ges amtproduktion, durch
Gärungen gewonnen (Mc Cutchan und Hickey, 1954).
Shr ev e (1956) meldet, dass im Jahre 1954 87300 Tonnen
Butanol, oder 40
%
der Gesamtproduktion der U. S. A., auf mikrobiologischem Wege gewonnen wurden. Von 1929 - 1952 sind denn auch in den Vereinigten Staaten nicht weniger als 21 Verfahren, basierend auf der Gärtätigkeit saccharolytischer Clostridium-Arten, mit folgender Streuung in der Neutralpro-dukteausbeute patentiert worden (vgl. Be e s c h, 1952):% der
Gesamtgärprodukte Butanol 58 - 85 Äthanol 1 - 10 Azeton 2 - 38 Isopropanol 1 - 35Gegenwärtig dienen fast ausschliesslich Melassenarten als Gärmedium. Halbtechnische Untersuchungen erschlossen aber noch weit mehr industrielle und landwirtschaftliche Abfallpro-dukte, wie Sulfitablaugen (vgl. Wiley et al., 1941;Schoedler,
1954; Gfeller, 1954; Müller, 1957), verzuckertes Holz
(siehe Faith et al., 1950), sowie auch Abfallfrüchte, als Gärsubstrat.
Während nun auf der westlichen Hemisphäre die Bedeutung der Gewinnung organischer Lösungsmittel aufmikrobiologischem Wege im Rückgang begriffen ist, findet bezeichnenderweise in
östlichen Ländern eine starke entgegengesetzte Entwicklung
statt (vgl. Hongo, 1956 und 1957; Nakhmanovich, 1957). Erwähnenswert in diesem Zusammenhang ist eine neue tschechi-sche Arbeit, wonach in kontinuierlicher Clostridium acetobu-tylicum-Gärung sehr hohe Neutralprodukteausbeuten erreicht wurden (Dyr et al., 1958).
Angesichts der grossen wirtschaftlichen Tragweite ist es nicht er staunlich , dass die Literatur betreffend Clostridium-Gärungen sehr umfangreich ist. Da aus ihr der Anstoss zu der vorliegenden Arbeit erfolgte, wird im Folgenden etwas näher auf einige Publikationen, sowie den Gärmechanismus einge-gangen.
1. 2 ZUR BIOCHEMIE DER NEUTRALPRODUKTEGÄRUNG VaN CLOSTRIDIEN
1.2.1 Abgekürztes Gärschema der Clostridium-Gärungen
Es wird heute angenommen, dass auch Clostridien Zucker gemäss dem E mbd e n - Me y e rh 0 f -Schema in
Brenztrauben-säure spalten (siehe Heard et al., 1933; Peldán, 1939; Werkman et al., 1951; vgl. aueh Wolfe et al., 1953;
Th i ma nn, 1955; Kl uyv er, 1956).
Aus der Literatur ergibt sieh hernaeh das folgende verein-fachte Gärsehema (vgl. Kluyver, 1956):
Aktivierte
C H3' CO, COOH E sSlg1aure .
t..
+ CO 2I
CH3'COOH CH3' CO· CH2' COOH
•
-
l
"
CH3'-CO· CH3 + C022Hl
Hieraus ist ersiehtlich, dass ganz versehiedene Endprodukte auftreten können, und dass die neutralen Verbindungen dureh Hydrierung oder Dekarboxylierung aus Säuren entstehen. Reilly et al. (1920), Peterson und Fred (1932), sowie Os bur n et al. (1937) haben denn aueh einen gestaffelten Gärverlauf nachweisen können. Sie unterseheiden eine erste Phase, wo allein Säuren produziert werden, und eine zweite, wo die Umwandlung dieser Säuren stattfindet. Diese Ersehei-nung des zunehmenden und plötzlieh wieder fallenden Säurege-haltes in Clostridium-Medien nennt man" break". Man hat sieh das "break" als Abwehrmassnahme der Zelle gegen die Toxi-zität niederer Fettsäuren in höheren Konzentrationen erkUu·t
(Donker, 1926; Aebi, 1951; Wikên und Zobrist, 1953; vgl. auch Thimann, 1955). Van der Lek (1930)
tigte diese Annahme, indem er durch Zusatz von Ca-Karbonat, welches die gebildeten Fettsäuren neutralisierte, die Produktion von Butanol, Azeton und Isopropanol gänzlich unterdrücken konnte. Gf e 11 e r (1954) und Mü 11 er (1957) haben anderseits in eingehenden Untersuchungen über die Azeton-Butanol-Gärung keine Säureschwelle im obigen Sinne gefunden. Vielmehr zeigte sich bei ihren Versuchen ein gleichzeitiges, kontinuierliches Anwachsen der Neutral- und Säureprodukte. Es ist aber anzu-nehmen, dass diese Abweichungen in genetischen Verschieden-heiten der verwendeten Stämme liegen; denn in beiden Fällen sind die gleichen Enzymsysteme, welche die erforderlichen Kondensationen, Hydrierungen und Dekarboxylierungen vor-nehmen, vorhanden. Es scheint sich bei den Stämmen von Rei lly, Pet er s on, 0 s bu rn und deren Mitarbeitern (vgl. oben) vielmehr urn einen adaptiven Charakter dieser Enzyme zu handeln, während sie bei den von Gf e 11 er und M ü 11 er untersuchten Bakterien aber konstitutiv sind. Es wäre demnach wohl unrichtig, die" break" - Erscheinung als charakteristisch
f1ir Clostridium -Gärungen zu bezeichnen.
1.2.2 Die Kohlehydratquelle und deren Einfluss auf den Gärverlauf
Als Energiequellen kommen für saccharolytische Clostridien sowohl Oligosaccharide (z. B. verschiedene Pentosen, Hexosën und Disaccharide etc.) als auch Polysaccharide (u. a. z. B. Pektin und . Zellulose) in Frage. Von wirtschaftlichen und wissenschaftlichen Motiven gelenkt haben sich die Clostridium-Forscher schon früh die Frage gestellt: Kann ein Organismus Zucker verschiedener Struktur und Konfiguration unter Bildung der artspezifischen Endprodukte abbauen? Oder haben Struktur und Konfiguration einen entscheidenden Einfluss auf die End-produkteverteilung? So hat Rob ins 0 n (1922) die Vergärung einer Reihe von Zuckerarten studiert und folgende Gruppenein-teilung vorgenommen:
Gruppe I: Zucker, deren Dissimilation eine Maximumskurve bezüglich Azidität, also die " break" -Erscheinung zeigt. Rob ins 0 n bezeichnetdies als den no r m al en Gärtypus. Dieser wird durch Glukose, Fruktose, Mannose, Saccharose, Laktose und Stärke bewirkt. Gruppe II: Zucker, deren Dissimilation eine kontinuierliche,
allmählich an die Horizontale asymptotische Azidi-tätskurve aufweist. Diesen abn 0 r men Gärtypus, bei dem die Säurebildungsgeschwindigkeit langsamer ist als in Gruppe I, bewirken Galaktose, Xylose, Arabinose, Raffinose, Melezitose und Inulin. 12
Speakman (1923) bestätigte die Resultate von Robinson und hat auf Grund der sterischen Form folgende Regel abge-leitet: Eine -C-C-Bindung in Zuckern, deren Karbinolgruppen in cis-Form stehen, wird leichter und rascher ge spalten , als jene mit solchen Gruppen in trans-Form. Dieser Mechanismus passte ganz gut in seine sowie Robinsons Versuchser-gebnisse im FalIe von Glukose, Mannose und Xylose, die mit
"break" sehr rasch in Verbindungen mit 2 und 3 C-Atomen abgebaut werden. Auf Galaktose und Arabinose ist er aber mit Vorbehalt anzuwenden. Ebenso gibt er keine Auskunft über die Koppelung mit der Neutralproduktebildung. Erst 1935 haben Langlykke et al. bei 52 verschiedenen Clostridium-Stämmen gezeigt, dass grundsätzlich bei niederen Säureausbeuten höhere Neutralproduktekonzentrationen auftreten und vice versa, dass
also bei Zuckern der" break" -Gruppe in der Phase des zurück-gehenden Säur~~ehaltes die Alkohoie, resp. Ketone entstehen.
In recht guter Ubereinstimmung zu diesen älteren Resultaten fand Zo b ris t (1955) auf Glukose, Mannose und Fruktose eine überwiegende Neutralproduktegärung, auf Galaktose, Xylose, Arabinose, Sorbose, Rhamnose und Ribose praktischnurSäuren. 1.2.3 Die Stickstoffquelle und ihr Einfluss auf
die Verteilung der Gärendprodukte
In den oben zitierten Arbeiten wurden stets dieselben Stickstoffquellen, meist aus Pepton, Hefeextrakt oder Hefeauto-lysat bestehend, verwendet. Einzig bei Zo b ris t (1955) wird vermerkt, dass auf Hefeextrakt die Ausbeuten an Butanol, Azeton und lsopropanol höher seien als auf einem mineralen Medium. Bei Versuchen liber den Einfluss des Kohlehydrat/ Stickstoffverhältnisses auf die " solvent" - Produktion fanden Ful ton et al. (1926), dass bei Werten dieses Verhältnisses von 5 - 10 am meisten Neutralprodukte entstehen. lst der Quotient
< 5 steigt der Azetonanteil auf Kosten des Äthanols,
ist er>
5 tritt das Umgekehrte ein. Wils 0 n et al. (1930) verglichen Proteine, Peptone, Aminosäuren undAmmoniumsalze in ihrer Wirkung in Clostridium-Gärungen. Sie folgerten, dass nur leichte Verschiebungen in der Endprodukteverteilung ein-traten (vgl. auch Osburn und Werkman, 1935). Dab ei handelt es sich, auch gemäss den zitierten Autoren, keines-wegs um eine grundlegende Veränderung oder Beeinflussung der Stoffwechselmechanismen, sondern vielmehr sind diese Erscheinungen den verschiedenenProvenienzen (tierisch/pflanz-lich) der Stickstoffquellen zuzuschreiben. Diese weisen ver-schiedene Gehalte an Wuchsstoffen, sowie andere mehr oderweniger bekannte Sub stanzen , wie z. B. niedere Fettsäuren, auf (ibidem) • Bemerkenswert ist jedoch die Feststellung, dass auch Ammonium-8tickstoff, wenn mit Protein oder Pepton zusammen verabreicht, assimiliert wird (vgl. auch Spe a kma n , 1926; Weyer und Rettger, 1927; u.a.m.).
Zusammenfassend darf man wohl feststellen, dass aus all diesen Arbeiten keineswegs sichere Richtlinien betreffend die Beeinflussung der Dissimilation von Kohlehydraten durch die Form verabreicht~r Stickstoffquellen gezogen werden dürfen (vgl. auch Weizmann und Rosenfeld, 1937), sinddoch die verwendeten Medien bezUglich ihrer chemischen Zusam-mensetzung mehr oder weniger unbekannt. Ebenso blieb der Zustand der stets als gärende Vorkulturen weitergeimpften Mikroorganismen vollkommen unkontrolliert. M c Co Y und Fred (1941), Aebi (1951), sowie Kutzenock und Aschner (1952) zeigten eindrUcklich, wie rasch Neutralproduktebildner zu einseitigen Säureproduzenten degenerieren, wenn man nicht stets wieder frisch pasteurisierte Kulturen, d. h. Sporensuspen-sionen, verwendet.
In der vorliegenden Arbeit wurde denn auch im Lichte neuerer Erkenntnis se begonnen, unter streng kontrollierten Verhältnissen den Stickstoff-Haushalt und dessen Einfluss auf die Gärung bei saccharolytischen Clostridien zu untersuchen.
KAPITEL 2
AMMONIUMSALZE UND AMINOSÄUREN ALS STICKSTOFFQUELLEN UND IHR EINFLUSS AUF
DIE VERTEILUNG DER ENDPRODUKTE DER GLUKOSEDISSIMILATION VON CLOSTRIDIUM
BUTYRICUM
2.1 EINLEITUNG
Bereits in älterer Literatur findet man elmge vage Angaben über die Verwertung von niedermolekularen Stickstoffverbin-dungen durch Clostridien (siehe 1.2.3; Tatum et al..
1933; Speakman. 1926; etc.). Es wurde unter anderem gezeigt, dass Asparagin, Asparaginsäure, Tyrosinund verschie-dene Ammoniurnsalze in Anwel3enheit von bestimmten Proteinen oder Fraktionen daraus assimiliert werden. Es gelang aber nie, auf jenen niedermolekularen Verbindungen eine deutliche Vermehrung des Zellmaterials zu erreichen, ohne dass bestimmte Mengen an Proteinen zugleich anwesend waren. Weizmann und Rosenfeld (1937) wiesen nach, dass sich Clostridiurn acetobutylicurn auf einem Substrat bestehend aus Kohlehydrat, Asparaginsäure und einer geringen Menge einer unbekannten stickstoffhaltigen Verbindung gut vermehrt. Die letzte Substanz gewannen sie durch Dialyse von Hefeautolysat. Sie bezeichneten diesen im Pflanzenreich weitverbreiteten hitzestabilen Stoff als Aktivator. Gemäss Wei z man n und Ros e nf e I d (siehe oben) handelte es sich bei den oben zitier-ten, für das Wachstum erforderlichen Proteinfraktionen, nur urn die Trägersubstanz des Aktivators, weil sie in Mengen-bereichen, in denen ihr Stickstoffgehalt fUr assimilatorische
Zwecke nicht mehr hinreichte, doch noch den Aktivierungs-effekt aufwiesen.
Diese Resultate ermöglichten bereits die Herstellung halbsynthetischer Clostridium -Substrate, bestehend aus Mineral-salzen, Asparaginsäure und dialysiertem Hefeautolysat. Später wurde der Aktivator dûrch Sn e II und Wi 11 iam s (1939) als der Wuchsstoff Biotin identifiziert, und es gelang diesen Forschern, Clostridiurn butylicum unter Zusatz des erwähnten 15
Stoffes auf synthetischem Medium zu zUchten. Diese Arbeit bildete eine wichtige Grundlage îÜT die Zusammenstellung zahlrelcher synthetischer N'ä,hrlösungen für proteolytische und saccharolytische Clostridium-Arten. Ebenso eröffnete sie die M6glichkeit, deren WuchsstoffbedUrfnisse abzuklären.
So haben denn Wikén und Richard (1952; vgl. auch Wi ké n et al., 1952) ein synthetisches Substrat îÜT Clostri-dium butyricum zusammengestellt, das das gleiche Wachstum und die gleiche Verteilung der Gärendprodukte bewirkte wie ein mit Hefeextrakt bereitetes Medium. Diese Nährlösung - in der Folge als Substrat A bezeichnet - diente besonders der Untersuchung von frisch isolierten Clostridium butyricum-• Stämmen (sieheRichard, 1948)auf ihre Eignung zur Butanol-Azeton-Gärung (Wikén und Zobrist, 1953; sowie Zobrist, 1955). Auch die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen dieses Arbeitsprogrammes begonnen. Es wurden fast durchwegs Clo-stridium butyricum-Stämme der Mikrobensammlung des !nstitutes flir landwirtschaftliche Bakteriologie und Gärungsbiologie der Eidgenössischen Technischen Hochschule in ZUrich verwendet.
2.2 ZUR EIGNUNG VON AMMONIUMSALZEN UND
AMINO-SÄUREN AlS STICKSTOFFQUELLEN
Zunächst wurde ein typischer Essigsäure-Buttersäurebildner, Clostridium Nr. 208, zur Abklärung der StickstoffbedUrfnisse der zu untersuchenden Clostridium butyricum-Art verwendet. Dieser Stamm ermöglichte uns, anhand der Bestimmung der Gesamtaziditätszunahme durch die Gärung Auskunft Uber die Stoffwechselintensität und dadurch ein relatives Wachstumsmass zu erhalten. Diese fUr Clostridien an sich ungewöhnliche Methodik wurde in Anlehnung an die auf dem Gebiete der Milchsäure-bakterien Ubliche Technik fUr unsern Organismus angewendet. Beispielsweise hat Nurmikko (1954) lm Falle von Lacto-bacillus- und Streptococcus-Arten darauf hingewiesen, dass zwischen Zelldichte einer Kultur und der Säureproduktion eine sehr enge Korrelation besteht, weshalb er dieses Kriterium sogar in quantitativen Aminosäuren- und Wuchsstoffbestim-mungen verwendete. Vorversuche mlt unserem einseitigen Säureb ildner, Clostridium Nr. 208, rechtfertigten denn auch die Verwendung der Säureausbeute als approximatives Wachs-tumsmerkmal.
Die Gesamtazidität wurde durch Titration aliquoter Teile des Substrates unter N2-Strom mlt 0,3-n Natronlauge gegen Phenolphthaleinindikator gemessen.
In AnIehnung an die NährIösung von W i ké n et al. (1952) (= Substrat A), die u. a. 19 verschiedene Aminosäuren enthält, wurde folgendes vereinfachtes Medium zusammengestellt:
Substrat B D-Glukose 20,00 g Na2HP04' 2H20 1,78 g KH2P04 1,36 g MgS04' 7H20 0,42 g FeS04' 7H20 0,025 g MnCI· 4H20 0,013 g (+) -Biotin 1,0
r
H20 destilliert ad 1000 mIDer pH-Wert wurde vor der fraktionierten Sterilisation auf 6,8 - 6,9 eingestellt. Die Stickstoffquelle wurde gemäss den unten angegebenen Versuchsbedingungen variiert.
Das verwendete Sporenmaterial wurde auf einem durch Wik é n et al. (1952) modifizierten Bouillonagar nach Kar ni c k i und Dorner (1934) gewonnen:
Substrat C Fleischabsud
Pepton .. Witte" für bakteriologische Zwecke Pepton .. Merek" fUr bakteriologische Zwecke Hefeextrakt "Difco" für bakteriologische Zwecke D-Glukose Agar pH 2.2.1 Amino säur en 1000 mI 10,0 g 5,0 g 5,0 g 20,0 g 20,0 g 6,8 - 6,9
Aus der Literatur (siehe oben) war bekannt, dass Aspara-ginsäure Clostridium-Arten zu gutem Wachstum bringen kann. Daher trachteten wir diese als Bezugsaminosäure zum Ver-gleich der Wirkungen aller übrigen zu prüfenden Aminosäuren zu wählen.
Die beimpften Substrate wurden je in 7 -facher Parallele in der geläufigen Du r ham -Anordnung(= Kulturröhrchen, das ein kleines, mit der Öffnung nach unten gerichtetes
Reagenz-gläschen zum Auffangen der Gärgase. enthält) bei 37
°c
ca. 150Stunden bebrütet, wonach die Gasentwicklung beendet, sowie das Zellmaterial bereits sedimentiert war. Sobald gemäss letzteren Kriterien das Wachstum abgeschlossen war, wurden die Inhalte der sieben Reagenzgläser zusammengegossen und
titriert. Dieses Vorgehen versprach einen möglichst guten
Durchschnitt zu Hefern. Anderseits wurde es aber zufolge der
in gewissen Fällen grossen Streuung der Parallel en die Ursache von verschiedentlich auftretenden Unstetigkeiten in den nach-folgend gezeichneten Kurven. Zur Feststellung des Nullwertes der Azidität der Substrate führten wir jeweils eine gleichbe-handelte unbeimpfte Probe mit.
Für Details über die angewendete Technik siehe Kapitel Methodik.
Vergleich der Wirkung der DL-Asparaginsäure mit derjenigEm des Substrates A
Wie oben erwähnt, wollen wir in der Folge die Wirkungen der zu prüfenden Stickstoffquellen mit derjenigen von DL-As-paraginsäure vergleichen, d. h. nur mit einer der 19 Amino-säuren des synthetischen Clostridium-Substrates A. Es schien daher angebracht, zu untersuchen, ob dies gerechtfertigt i8t
und im weiteren zu prüfen, ob die DL-Asparaginsäure bei
Clostridiwu Nr. 208 die gleiche Wirkung aufweist, wie sie Weizmann und Rosenfeld (1937)u.a.m. im FalIe vonClo-stridium acetobutylicum fanden.
dA
(Zunahme der Gesamtazidität durch die Gärung in
mM Säure/Liter Substrat) Substrat A
Substrat B + 40 mM
DL-Asparagin-säure/Liter Substrat
Substrat B ohne gebundenen Stickstoff
43,35 30,60 5,51
Die Resultate bestätigen die Ergebnisse von Wei z man n et al., sowie Pet ers 0 n et al. (1932) mit Clostridium ace-18
tobutylicum-Stämmen. Ferner zeigen sie, dass die Wirkung der DL-Asparaginsäure jener des Substrates A ziemlich nahe kommt, wodurch ihre Wahl als Basis zur Beurteilung der Eignung von weiteren StickstoffqueUen wohl angebracht ist. Der relativ hohe dA-Wert auf Substrat B ohne Stickstoff-quelle ist etwas auffallend. Da die se Erscheinung in späteren Versuchen immer wieder auftritt, soU hier gleich auf eine Erklärung hingewiesen werden. Das Sporenmaterial, das den Substraten zugeführt wurde, stammte bekanntlich von Schräg-agarröhrchen mit Substrat C. Darin wurden die Kolonien in wenig destilliertem Wasser suspendiert. Die so hergestellte Suspension wurde wohl noch stark verdünnt (siehe Kapitel Methodik), vermutlich sind aber während des Suspendierungs-vorganges doch stickstoffhaltige Verbindungen des Nähragars in Lösung gegangen. Ein solcher Anteil mag den Zellen zu ger ingem Wachstum verholfen haben, woraus denn auch die Säureproduktion resultierte.
Glyc in
Das Glycin ist, wie Fig. 1 zeigt, als StickstoffqueUe untauglich. Schon in kleinsten Konzentrationen lbewirkt es eine geringere Säureproduktion als in der Serie ohne gebundene Stickstoffquelle
40 10 120 180 Gl)'Cln in mM pro 1000"", Suttstra'
Fig. 1.
Wachstum von Clostridium-Stamm Nr. 208 in SubstratB mit Zusatz von
A: steigenden Mengen Glycin B: 40 mM
DL-Asparagin-säure + steigenden Mengen Glycin
erzielt werden konnte. Eine ganz geringe Gasentwicklung,
selbst bei einer Glycinmenge von 140 mM/Liter (nach
75 Stunden), lässt jedoch annehmen, dass die Sporenkei-mung nicht beeinflusst wurde. GegenUber DL-Asparaginsäure scheint sich Glycin als kompetitiver Inhibitor zu verhalten. DL-Serin
Die Maximumkurve, die in Fig. 2 die Wirkung des DL-Ser ins beschreibt, ist äusserst interessant. Auf 1 - 10 mM Serin/Liter findet mit zunehmender Serinkonzentration eine zunehmende Säureproduktion statt. Bei grösseren Aminosäure-mengen nimmt letztere aber rapid ab. Diese Erscheinung ist
OL· S.rin in mM pro 1000 ml S4.1b.trat
Fig. 2.
Wachstum von Clostridium-Stamm Nr. 208 in Substrat B mit Zusatz von
A: steigenden Mengen
DL-Serin B: 40 mM
DL-Asparagin-säure + steigenden Mengen DL-Serin
umso erstaunlicher, als sie in kleinen Mengenbereichen der Aminosäure auftritt. GegenUber DL-Asparaginsäure wird bis ca. 40 mM/Liter eine synergistische, in höheren Serinkonzentra-tionen jedoch eine antagonistische Wirkung erzielt. Die Ver-mutung, dass eine Wechselwirkung zwischen den Isomeren des Serins vorliegt, wird im folgenden Versuch bestätigt.
DL-, D- und L-Serin
Das L-Serin erweist sich in allen geprUften Konzentrationen (siehe Fig. 3) als stark wachstumsstimulierende Aminosäure, während die D-Isomere toxisch wirkt. Die Säurezunahme in den Razemat-Serien, die bei 20 mM weit höher liegt als auf L-Serin allein, weist aber auf eine vorläufig unerk1ärliche,
komplizierte Wechselwirkung hin. Das D-Serin würde im
Razemat bei niedrigen Konzentrationen die Wirkung des L-Serins 20
erhöhen und erst nach der Überschreitung einer bestimmten Menge das Wachstum hemmen. Ein direkter Antagonismus zwischen den zwei Isomeren kano zufolge der Anwesenheit beider Stoffe in äquivalenten Mengen nicht vorliegen. Der Konzentrationsbereich, in welchem die D-Komponente des Razemates inhibitorisch wird (siehe Fig. 3, Kurve A), scheint eher durch das Verhliltnis D-Serinmenge zur Zellen- resp.
4.
Slr!n in mM pro 1000 mi. Sub.tr.t
Fig. 3.
Wachstum von Clostridium-Stamm Nr. 208 in Substrat B mit steigenden Mengen Serin:
A: DL-Serin B: L-Serin C: D-Serin
Sporenmenge (hier konstant) bestimmt zu werden. Mit elmger Sicherheit zeigen diese Resultate allein, dass die negative Wirkung des D-Serins sehr vermutlich unabhängig von der anwesenden guten Stickstoffquelle erfolgt. Die merkwürdige Stimulierungserscheinung des Razemates (siehe Fig. 3, Kurve A bei 20 mM) könote als Aktivierung der D-Aminosäureoxydase durch die entsprechende L-Form der Aminosäure in niederen Konzentrationen, gemäss Befunden von E dl ba eh e r und Wis s (1945) mit Schweinsnierenextrakt bezüglich mehrerer Aminosäuren gedeutet werden.
Die Resultate eines weiteren Experimentes, die in Fig. 4 wiedergegeben sind, bestätigen die oben gemachten Auslegungen und zeigen überdies, dass auf dem Gemisch von DL-Aspara-ginsäure und L-Serin eine fast viermal höhere Säureausbeute als auf dem Substrat A erzielt werden kano.
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i
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e E 40 ~ .!iii o 40 80Strin in mM pro 1000 mi. Substrat
DL-Alanin
Fig. 4.
Wachstum von Clostridium-Stamm Nr. 208 in Substrat B mit 40 mM Asparaginsäure /Liter und mit Zusatz von steigenden Mengen Serin: A: DL-Serin
B: L-Serin
C: D-Serin
Das DL-Alanin ist gemäss Fig. 5, Kurve A, eine das Wachs-turn stark aktivierende Aminosäure. Schon bei 1 mM pro Liter vermag es eine grosse Säureproduktion zu bewirken, die mit
Ol-.leM'I In mH pro 1000ml Substrat
22
Fig. 5.
Wachstum von Clostridium-Stamm Nr. 208 in Substrat B mit Zusatz von
A: steigenden Mengen DL-Alanin B: 40 mM
DL-Asparaginsäu-re + steigenden Mengen DL-Alanin
zunehmender Alaninkonzentration nur noch schwach erhöht wird. Abnorm erscheint im vorliegenden Fall das Fehlen eines eindeutigen Maximums der Säureausbeute in Abhängigkeit der
Aminosäurenkonzentration. Diese Tatsache deutet auf die
Móglichkeit hin, dass dem Alanin in höheren Konzentrationen
spezielIe " precursor" -Eigenschaften flir Vitaminsynthesen
(B-Komplex) zukommen. Diese Annahme wird besonders durch den Umstand unterstützt, dass in industriellen Clostridium-Gärungen in den Gärrückständen je Substrat variierende Mengen an Vitaminen, vor allem des B-Komplexes, anfallen (vgl. Be e s c h, 1952). Deren Menge erreicht bei bestimmten Gär-verfahren eine ansehnliche Höhe, so dass Clostridium-Gärrück-stände in der Landwirtschaft bereits als spezielles
Vitamin-futter Verwendung finden. Daneben vermag ex-Alanin in
grös-seren Mengen bei Streptococcus lactis, einem Pyridoxin-hetero-trophen Organismus, den Bedarf an Vitamin B6 zu ersetzen
(Snell und Guirard, 1943; Kihara und Snell, 1952).
Einen ähnlichen Mechanismus fanden Wi ké n und Agh t e (1958)
bei Saccharomyces cerevisiae Hansen mit ~ -Alanin.
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Wachstum von Clostridium-Stamm Nr. 208 in Suhstrat B mit Zusatz von steigenden Mengen Alanin: A: L-Alanin B: D-Alanin 56 !" :~ '"
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1 " -40 80Alanin In mM pro 1DOOml Substrat Fig. 6a.
Wachstum von Clostridium-Stamm Nr. 208 in Substrat B mit Zusatz von 40 mM DL-Asparaginsäure/Liter und steigenden Mengen Alanin:
A: L-Alanin B: D-Alanin
Gegenüber DL-Asparaginsäure verhält sich das DL-Alanin ebenfalls über einen sehr weiten Konzentrationsbereich syner-gistisch.
D- und L-Alanin
Die beiden Formen als alleinige Stickstoffquellen verabreicht, erzielen bei Clostridium Nr. 208 etwa gleiches Wachstum (Kur-ven A und B, Fig. 6). Die ZeIlen verwerten also beide Isomeren gleich gut, was auf das Vorhandensein von beiden Formen entsprechenden De- oder Transaminasen, oder aber der in der Literatur sehr bekannten Alaninrazemase (vgl. hierzu Th 0 r ne und Molnar , 1955; Meister , 1957), scbliessen lässt. Zwischen der DL-Asparaginsäure und dem D-Alanin besteht aber ein Antagonismus, so dass bei den verschiedenen Konzen-trationen der letzten Aminosäure im Gemisch (Fig. 6a, Kurve B) durchschnittlich ziemlich weniger Säure produziert wird, als auf den einzelnen Komponenten allein. L-Alanin im Verband mit DL-Asparaginsäure verhält sich zu letzterer Verbindung in tieferen Konzentrationen synergistisch, um aber in höheren hemmend zu wirken (Fig. 6a, Kurve A).
DL-, D- und L-Leucin
Die Erkenntnisse der vorgehenden Versuche veranlassten uns, nun gleich die getrennten Isomeren allein in Konzentra-tionen von 20 - 80 mM/Liter zu prüfen. Der DL- und L-Form des Leucins ist gemäss Kurven A und B in Fig. 7 eine recht gute Förderung des Wachstums eigen, wogegen sich die D-Kom-ponente vor allem in höheren Konzentrationen als Wachstums-inhibitor erweist (siehe Fig. 7, Kurve C).
Im Verband mit 40 mM DL-Asparaginsäure pro Liter bewirkt D-Leucin in kleineren Mengen (20 - 60 mM/Liter) eine sehr hohe Säureproduktion, die jene auf der ersten Aminosäure allein bei weitem übertrifft. Das Wachstum auf
DL-Asparagin-säure erfährt also durch die Verabreichung. kleiner D-Leucin-mengen eine deutliche Förderung. In höheren Konzentrationen dieser Aminosäure tritt aber ein entgegengesetzter Effekt ein (siehe Fig. 8, Kurve C). DL-, resp. L - Leucin haben als Gemischpartner von DL-Asparaginsäure einen synergistischen Einfluss auf die von dieser Aminosäure allein erzielte Wachs-tumswirkung (siehe Fig. 8, Kurven A und B).
Asparaginsäure, Histidin, Tryptophan undTyrosin Der in TabelIe 2 wiedergegebene Versuch zeigt, dass der L- und DL-Asparaginsäure gleiche Wirkung zukommt.
Die Säureproduktion auf Histidin übertrifft sowohl im Falle 24
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00 80 ~cln in mH pro 1000ml Substr. Fig. 7.Wachstum von
Clostridium-Stamm Nr. 208 in Substrat B
mit Zusatz von steigenden Mengen Leucin: A: DL-Leucin B: L-Leucin C: D-Leucin go
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Fig. 8.
Wachstum von Clostridium-Stamm Nr. 208 in Substrat B mit 40 mM DL-Asparaginsäu-re und Zusatz von steigenden Mengen Leucin:
A: DL-Leucin
B: L-Leucin
C: D-Leucin
TABELLE 2
Sllureproduktlon au! Substrat B bel Verabrelcbung von Je 30 mM verschledener Stlckstoffquellen pro Liter
dA
Stlckstoffquelle (Zunahme der Gesamtazldltllt durch die Gärung In
mM/Liter Substrat) DL-Asparaginsllure 29,6 L-Asparaginsäure 30,9 DL-Hlstldln 7,7 L-Histidln 8,0 D-Histldln 6,9 DL-Tryptophan 6,3 D-Tryptophan 3,1 L-Tryptophan 13,1 L-Tyrosln 16,9
ohne gebundenen Stlckstoff 4,5
des Razemates, als auch der getrennten Isomeren, diejenige der Kulturen ohne Zusatz von gebundenem Stickstoff nur sehr gering. Eine Hemmung der Stoffwechselprozesse scheint nicht vorzuliegen, es ist eher anzunehmen, dass die se Aminosäure durch Clostridium Nr. 208 überhaupt nicht verwertet werden kann und sich gegenüber diesem Organismus indifferent verhält.
Im Falle des Tryptophans liegt ein Antagonismus zwischen der D- und L-Komponente vor, wobei der rechtsdrehenden Form die inhibitorische Wirkung zukommt.
L-Tyrosin darf als recht guterWachstumsstimulant angesehen.
werden.
2.2.2 Ammoniumsalze
Ammonium sulfa t und Ammoniumaz etat
Die bis anhin verwendete Titration zur Bestimmung der Zunahme der Gesamtazidität (= dA in mM/Liter) würde im Falle des Azetates einen zu hohen Wert liefern, da auch jene Säure (= u in mM/Liter), die durch die Assimilation des Ammoniums aus dem Ammoniumazetat ent standen ist, miter-.
fasst wird. In diesem Falle setzt sich dA wie folgt zusammen:
1. dA=x+u
wobei x die durch Glukosedissimilation produzierte Säure in mM/Liter bezeichnet.
Um diesem Umstand Rechnung zu tragen, wurde zusätzlich noch eine Bestimmung der wasserdampfflüchtigen Säuren in einer durch Wikén et al. (1950) modifizierten Markham-Apparatur vorgenommen. Vor der Destillation wurde eine aliquote Me-diummenge mit konzentrierter Schwefelsäure bis zu kräftiger Blaufärbung von Kongorotpapier angesäuert. Die Titration des aufgefangenen Destillates erfasste folglich alle durch Gärung entstandenen wasserdampfflüchtigen Säuren und die ursprünglich als Ammoniumazetat in die Nährlösung gebrachte Essigsäure. Durch diese Titration wurde daher bestimmt:
a) die aus der Glukosedissimilation entstandene Säure (=x in mM/Liter) und
b) die totale, ursprünglich als Salz dem Substrat beigegebene Essigsäure (= a in mM/Liter j vgl. die unten hierzu
gemachte Einschränkung).
Um die Resultate auf eine Grundlage zu bringen, die einen Vergleich mit den früheren Versuchen erlaubt, waren wir bestrebt, das Wachstum nur anhand der aus der Glukosedis-26
similation stammenden Säure zu beurteilen. Bezeichnet man nun die bei der Wasserdampfdestillation bestimmte Säure mit fS
(in mM/Liter), so lässt sich folgende Beziehung aufsetzen:
2. fS x + a
daraus folgt: x fS a
Der so ermittelte Wert x gibt hinlänglich Auskunft über die Säureproduktion, die allein aus dem Glukoseabbau erfolgte. Wie wir später sehen werden, wird im Gemisch Glukose plus Essig-säure, letztere ebenfalls dissimiliert. Wenn man also x wie oben angegeben berechnet, vernachlässigt man die gesamte Dissimilation von ursprünglich zugeÏtigter Essigsäure und das dadurch bedingte Wachstum. Das berechnete x liefert somit einen etwas zu tiefen Wert der Säureproduktion als Merkmal des Wachstums. Urn in diesem Zusammenhang ein Mass für die zusätzlich der Dissimilation zur VerÏtigung stehenden Essigsäure zu erhalten, berechneten wir u aus Gleichung 1.:
u = d A - x
Die Grösse u liefert überdies noch ein Mass für den assi-milierten Ammoniumstickstoff, da dieser der freigesetzten Essigsäure äquivalent ist.
TABELLE 3
Säureproduktion auf Substrat B mit je 50 mM des betreffenden Salzes pro Liter, in mM pro Liter (Durchschnitt von 7 Parallelen) Serie
dA
Nr. fS x u
1 Ammoniumsulfat 12,45 12,67
2 Ammoniumazetat 48,10 62,35 12,35 35,75 3 ohne gebundenen Stickstoff 4,31 4,25
Das Ammoniumsulfat stellt gemäss .. obiger Tabelle eine mittelmässige Stickstoffquelle dar. Die Ubereinstimmung des dA- und fS-Wertes zeigt, dass Clostridium-Stamm Nr. 208 nur leichtflUchtige Säuren produziert, die durch Titration des Gärsubstrates voll erfasst werden.
Die Azetatserien liefern, betrachtet man nur die durch Glukoseabbau produzierte Säure (x), dasselbe Resultat wie jene mit Sulfat (dA und fS). In allen azetatenthaltenden Kulturröhrchen war aber eine, schon dem Auge sichtbare, grössere Zellmenge 27
vorhanden als in den Parallelen mit Sulfat. Es fand also demzufolge in Serie 2 grösseres Wachstum statt als in Serie 1 (Tabelle 3), was auf eine verschiedene Assimilationsrate der an sich in beiden Versuchen gleichen Stickstofform schliessen lässt. Der Unterschied des Wachstums in den zwei Serien wäre daher allein der Wirkung der Anionen der betreffenden Ammon-iumsalze zuzuschreiben. Da ursprünglich die Energie- und Kohlenstoffquelle (110 mM Glukose pro Liter) in stark über-schüssigem Mass ins Substrat gegeben wurde, kann die freige-wordene Essigsäure (35,75 mM/Liter) kaum als blosse Ergän-zung derselben betrachtet werden. Vielmehr muss dem Azetat eine besondere Wachstumsstimulierung eigen sein. Diese Interpretation ist denn in der Literatur auch ziemlich verbreitet (vgl. Snell, Tatum etal.,1937; Snell,Strong et al., 1937. und Guirard et al., 1946).
Die wichtigste Erkenntnis dieses Versuches ist aber, dass Clostridium-8tamm Nr. 208 imstande ist, seinen Stickstoff-bedarf aus anorganischen Stickstoffquellen zu decken. Man darf ihn deshalb als Stickstoff-autotrophen Organismus bezeichnen. 2.2.3 Wechselwirkungen zwischen
salzen und Aminosäuren
Ammonium-Die neue Perspektive der Stickstoff-Autotrophie brachte die Frage mit sich: Wie verhalten sich die Clostridium-Zellen, wenn sie gleichzeitig eine Aminosäure und Ammoniumionen als Stickstoffquellen erhalten?
Bildet eine Aminosäure di.e einzige Stickstoffquelle, muss man notgedrungen annehmen, dass zu deren Umwandlung in arteigene Aminosäuren Enzymsysteme wie Razemasen, Trans-aminasen und DeTrans-aminasen gebraucht werden. Für solche Vor-gänge benötigt die Zelle verschiedene organische Säuren, vor allem Ketosäuren, welche als Akzeptoren der Aminogruppen fungieren und die zum grossen Teil als Zwischenstuf~n des Kohlehydratabbaues auftreten ( vgl. Meister , 1957). Da
demgemäss letztere "Stickstoff-Akzeptor-Säuren" in der Zelle unabhängig von der Form der verabreichten Stickstoffverbin-dungen vorhanden sind, interessierte es, ob deren Aminierung vorzUglich mittels anorganischem oder organischem Stickstoff erfolge. In den Ammoniumazetatserien konnte anhand des Wertes u (aus Gleichung 1. und 2.) die selektive Assimilation der Stickstoffquellen beurteilt werden.
In Serie 1 (Tab. 4) liefert der Glukoseabbau unter Assimi-lation einer 35,75 mM Azetatj Liter äquivalenten Menge AmmoD-iumstickstoff 12,35 mM Säuren pro Liter. Auf L-8erin wird 28
Serie Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 TABELLE 4
Säureproduktion nach beendeter Gärung Aminosäuren zu je 40 mM pro Liter Ammoniumsalze zu je 50 mM pro Liter
Jeder Wert stellt den Durchschnitt Uber 7 Parallel en dar.
N-Quelle dA fS x u Ammoniumazetat 48,10 62,35 12,35 35,75 L-Serin 30,65 29,85 Ammoniumazetat + L-8erin 58,62 89,12 39,12 19,50 L-Leucin 22,37 23,15 Ammoniumazetat + L-Leucin 50,50 86,33 36,33 14,17 D-Serin 1,60 1,29 Ammoniumazetat + D-Serin 1,28 49,52 0,0 1,28 Glycin 3,12 3,24 Ammoniumazetat + Glycin 17,25 57,90 7,90 9,35 D-Tryptophan 0,47 Ammoniumazetat + D-Tryptophan 26,20 51,80 1,80 24,40 Ammoniumsulfat 12,45 Ammoniumsulfat + L-8erin 18,85 Ammoniumsulfat + L-Leucin 15,67 Ammoniumsulfat + D-Serin 1,92 Ammoniumsulfat + Glycin 10,22 Ammoniumsulfat + D-Tryptophan 9,57 ohne gebundenen SUckstoff 5,51
eine Säurenmenge von 30,65 mM/Liter gebildet (Serie 2). Verabreicht man nun ein Gemisch beider Stickstoffverbindungen (Serie 3), steigt die Säurenausbeute auf 39,12 mM/Liter. Es findet folglich auf diesem Substrat stärkeres Wachstum statt als auf den einzelnen Mischkomponenten allein, was mit andern Worten bedeutet, dass mehr Protein aufgebaut wurde. Betrachtet man nun die Mengen assimilierten Ammoniumstickstoffes in den betroffenen Serien, erkennt man, dass in Serie 3, wo das massivste Wachstum stattfand, nur 54% des auf Ammoniumaze-tat allein (Serie 1) umgesetzten Stickstoffes verbraucht wurden.
Dies bedeutet, dass der Stickstoffbedarf fdr die vermehrte
Proteinsynthese der Serie 3 zum weit grösseren Teil mlt L-Serin als mlt Ammoniumionen gedeckt worden ist.Im Parallel-falIe des L-Leucins (Serie 5) tritt eine noch geringere Auf-nahme von Ammoniumionen gegenüber der Serie 1 ein, nämlich ca. 40%, wobei aber das Wachstum wesentlich stärker ist als
in Serie 1. Diese Resultate zeigen eine deutliche Bevorzugung
geeigneter Aminosäuren gegenüber Ammoniumstickstoff durch Clostridium Nr. 208.
Die linksdrehenden Isomeren des Serins und Leucins, die sich bereits früher als gute Stickstoffquellen und als Synergisten derWirkung der DL-Asparaginsäure erwiesen, stellengegenüber dem Ammoniumsulfat nur schwach positive Effektoren dar. Wie Serien 11 und 12 zeigen, vermögen sie in Verband mit Ammoniumsulfat wohl die Wirkung dieses Salzes allein zu über-treffen, wobei die Säureproduktion aber doch noch wesentlich unter derjenigen in den Serien 2 Serin allein) und 4 (L-Leucin allein) bleibt. Dem Sulfation ist demzufolge irgendeine Hemmungswirkung von physiologischen Prozessen eigen.
Glycin, D-Serin und D-Tryptophan, die früher als Hemmer des Wachstums von Clostridium-Stamm Nr. 208 erkanntwurden, zeigen gegenüber den Ammoniumsalzen grundsätzlich die gleiche Wirkung wie gegenüber den Aminosäuren.
Auf dem Gemisch Glycin plus Azetat findet ei ne stark
redu-.zierte Säureproduktion, sowie eine schwache Ammonium-As-similation statt. Interessanterweise unterdrückt das D-Trypto-phan die Säurebildung durch Glukosedissimilation sehr stark, hemmt aber das Wachstum, beurteilt an der anfallenden Zellmasse, nicht in gleichem Ausmass. TabelIe 4 (Serie 11) zeigt in Bestätigung dessen, dass eine ansehnliche Menge Azetat umgesetzt wurde. Gegenüber Ammoniumsulfat zeigen beide Aminosäuren etwa gleich starke Hemmungswirkungen
(Serien 15 und 16).
Erneut nimmt das D-Serin in TabelIe 4 eine Sonderstellung ein, indem es das Wachstum auf Ammoniumazetat und -sulfat fast vollkommen hemmt. Serie 7 zeigt überdies, dass jegliche Assimilation von Azetat unterbleibt. Diese Tatsache weist auf das Vorhandensein eines ganz anderen Hemmungsmechanismus als im Falle der übrigen geprüften, das Wachstum hemmenden , Aminosäuren hin.
Die Wirkungsbilder, die bestimmte Aminosäuren früher als Gemischpartner der DL-Asparaginsäure zeigten (vgl. 2.2.1), bleiben im Verband mit anorganischen Stickstoffverbindungen voll erhalten.
2.2.4 Diskussion der Resultate
Clostridium butyricum Prazmowski Stamm Nr. 208 ist bezüglich Stickstoff in dem Sinne autotroph, dass er imstande ist, seinen Stickstoffbedarf aus Ammoniumsalzen zu decken.Wie aus Resultaten von Rosenblum und Wilson(1949)hervorgeht, besteht die Autotrophie überdies im erweiterten Sinne des Begriffes. Es gelang nämlich diesen Forschern nachzuweisen, dass ein Stamm der gleichen Art auf einem Trypton-haltigen Medium molekularen Stickstoff zu binden vermag.
Trotz seines Stickstoff-autotrophen Charakters bevorzugt Clostridium Nr. 208 gewisse Aminosäuren gegenüber Am-moniumionen als Stickstoffquellen. Infolgedessen bewerkstelligt
die Zelle entweder Vorgänge wie Deaminierung,
Transaminie-rung und RazemisieTransaminie-rung von Aminosäuren leichter als de nov"
Aminierungen mit NH4 -Ionen, oder aber sind die Bedingungen für die Aufnahme dieser organischen Verbindungen durch die Bakterienzellen günstiger.
DL- und L-Asparaginsäure, L-Serin, DL-, D-und L-Alanin ,
DL- und L-Leucin, L - Tryptophan, L - Tyrosin und Ammon-iumazetat als einzige Stickstoffquellen verhelfen Clostridium Nr. 208 zu recht gutem Wachstum. Ihre optimale Konzentration liegt ungefähr im Bereiche von 40 - 80 mM pro Liter. Mit Ausnahme des L-8erins vermögen aber die einzelnen Verbin-dungen die Wirkung eines Gemisches von 19 Aminosäuren (vgl. Substrat A) nicht zu ersetzen. Dagegen kommt diese
Eigen-schaft Medien, die DL-Asparaginsäure plüs je DL- oder L-Serin, DL- oder L-Alanin, DL-, D- oder L-Leucin enthalten, zu. Meistens wird die Wirkungvon SubstratA durch dieseMischungen beträchtlich übertroffen. Die Erscheinung, dass Mikroben auf dem Gemisch von zwei Aminosäuren, von welchen jede allein verabreicht nur spärliches Wachstum bewirkt, sehr gut gedeihen, wurde schonverschiedentlich erkannt (vgl. u.a.Ri pp el- Balde s und Köhler, 1943). Arbeiten von Stickland (1935) und Wood s (1936) zeigen, dass solchen Reaktionen bei Clostri-dien eine gekoppelte Deaminierung der beiden Aminosäuren zugrunde liegt. Eine Säure wird oxydativ , die andere reduktiv
deaminiert. Im FalIe der sehr starken Wachstumsstimulierung
des Clostridium -Stammes Nr. 208 durch L-Serin als einzige Stickstoffquelle lässt sich die se Theorie aber nicht direkt applizieren. Immerhin könnte es aber ein Hinweis auf eine Stickland-Reaktion an ein und derselben Aminosäure sein, wie sie beispielsweise auch für Clostridium propionicum u. a. m.
in den Arbeiten der SchU\~ von Bar k e r nachgewiesen wurde
(vgl. zusammenfassende Uber sicht bei Wik én, 1957). Auch die Gemische von Ammoniumazetat und L-Serin, resp.
Ammon-iumazetat und L-Leucin, sind dem Substrat A betreffend
Wachstum von Clostridium Nr. La ebenbUrtig.
DL-Serin, DL-, D- und '. -Histidin, DL-1):'yptophan,
sowie Ammoniumsulfat, sind als .. weitrangige Stickstoffquellen
zu bezeichnen; denn sie geben nur zu geringem Wachstum
An-lass, zeigen aber anderseits keine eindeutigen Inhibitoreigen-schaften.
Als Inhibitoren des Wachstums erwiesen sich Glycin, D-8erin,
D-Leucin und D-Tryptophan. Allein verabreicht hemmten die se
Aminosäuren jegliches Wachstum, nicht aber die Sporen-keimung. GegenUber DL-Asparaginsäure, Ammoniumazetat und
-sulfat verhielten ,sie sich mit Ausnahme des D-Serins wie
kompetitive Inhibitoren. Dies bedeutet, dass ihre Hemmwirkung mit steigender Menge einer das Wachstum ermöglichenden Stickstoffquelle vermindert wird. Bei dem Gemisch D-Leucin plus Asparaginsäure tritt bei kleinen Konzentrationen der ersten Säure sogarein Synergismus auf, d. h. es findet stärkeres Wachstum statt, als auf der letztgenannten wachstumsstimulie-renden Säure allein. Erst in hBheren Konzentrationen (60 mM/
Liter und mehr) verhält sich D-Leucin als Antagonist der DL-Asparaginsäure.
Grundsätzlich gleiche EinflUsse zeigten die negativen Effek-toren gegenUber Ammoniumazetat und -sulfat.
Ganz anderer Natur lst die Hemmwirkung des D-Serins.
Es lässt sich in diesem Falle kein Anzeichen' einer kompetitiven
Hemmung erkennen, da z. B. im Raz'emat dies er Säure schon
bei 20 mM pro Liter eine starke, durch die D-Komponente
verursachte Hemmung der Stoffwechselaktivität der Kultur
auftritt. Ebensowirddie Säureproduktion von Clostrigium-Stamm Nr. 208 auf Ammoniumazetat und -sulfat, sowie auf DL-Aspara-ginsäure durch diesen Stoffen noch nicht äquimolare Mengen von D-Serin gänzlich gehemmt. Daraus wurde der Schluss
gezogen, dass das D-Serin eine direkte, von den Ubrigen
anwesenden Stickstoffquellen mehr oder weniger unabhiingige, physiologische Wirkung ausUbe. Diesem sehr auffallenden Effekt wollen wir im Folgenden unser Interesse widmen.
Eine eingehendere Diskussion Uber Wechselwirkungen von Ammoniumsalzen, AminQsäuren und Peptiden bei butylogenen
und vorwiegend fettsäurebildenden
Clostridium-butyricum-Stämmen findet sich bei Wik é n und Mitarbeiter (1959).
2.3 ZUM EINFLUSS VON AMMONIUMSALZEN UND AMINO-SÄUREN AUF DIE VERTEILUNG DER DJSSIMILATIONS-PRODUKTE
In den folgenden Versuehen wurde ein Neutralproduktebildner
(Clostridium 'Nr. 174), der sieh bezUglich Stiekstoffbedarf
prak-tisch gleich verhlUt wie Clostridium Nr. 208 (siehe Wikên und Mitarbeiter, 1959), verwendet. Die Gärungen wurden in
250 mI Kugelversohlusskolben nach Wik ê n et al. (1950)
durchgefUhrt. Dte ausgegorenen Medien sind auf verschiedene Endprodukte der Clostridium-Gärungen quantitativ untersucht worden. Was die diesbezUglichen Analysenmethoden anbelangt, sei auf Kapitel Methodik verwiesen.
Die Konzentrationen der geprüften Stiekstoffverbindungen wurden fUr alle Paralleien so gewählt, dass sehliesslieh in jeder Serie eine 30,2 mM Stiekstoff (N2) entspreehende Menge vorhanden war.
Aus den Tabellen 5 und 6 lässt sieh die folgende Abstufung des prozentualen Glukoseumsatzes auf den versehiedenen Substraten bereehnen (vgl. aueh die graphisehe Darstellung in Figuren 9 und 10): Substrat A 47% Ammoniumazetat + L- Leuein 40% Ammoniumazetat 35% Ammoniumazetat + L-Serin 30% Ammoniumsulfat + L-Serin 28% Ammoniumsulfat + L-Leucin 28% L-'Serin 19% L-Leucin 16% Ammoniumsulfat 13%
Diese Resultate zeigen, dass in Abhängigkeit von der Art der Stickstoffquelle variabie Mengen von Glukose vergoren werden. Wenn z. B. auf Ammoniumsulfat (vgl. Fig. 9 und 10) durch die Gärung 13%, auf Ammoniumazetat aber 35% der ursprüngliehen Glukose versehwinden, deutet dies darauf hin, dass die letzte Stickstoffverbindung eine wesentlich bessere Stickstoffquelle ist und ein Vielfaches des Wachstums gegen-über der ersten ermöglieht. Unter diesem Gesichtspunkt be-trachtet stehen die Ergebnisse der Tabellen 5 und 6 bezüglich der Eig,nung der geprüften Stoffe als Stickstoffquelle in ziemlich guter Ubereinstimmung zu den früheren Resultaten mit Clo-stridiumNr. 208.
Die Tabellen 5 und 6 (ebenso Fig. 9 und 10) zeigen, dass in allen Serien die charakteristischen Endprodukte der Clostri-dium-Gärung auftreten. Die Serien mit Ammoniumazetat lassen durchwegs eine höhere Säureproduktion als in allen übrigen Serien sehen. Zudem sind sie durch einen relativ hohen
Essig-säuregehalt gekennzeichnet. Ein Vergleich der Essigsäurewerte vor und naeh der Gärung in Tabelle 5 zeigt aber, dass ansehnliehe Mengen dieser Säure durch den Gärprozess umge-setzt wurden. Gfeller (1954), sowie Gfeller et al. (1955), haben in diesem Zusammenhang nachgewiesen, dass die But-tersäureproduktion von Clostridium beijerinckii durch Zusätze von Essigsäure erheblieh zunimmt. In Bestätigung dieses Befundes kann im vorliegenden Beispiel beobaehtet werden, dass der prozentuale Buttersäureanteil der gesamten
I:.:l
""
Serie-Nr. . N-QueUen pH D- Glukose Buttersäure Essigsäure Ameisensäure Butanol Azeton + Isopropanol Äthanol TABELLE 5 Serien 1. - 8.: Substrat B; Serie 9.: Substrat AAlle N-Quellen zu 30,2 mM Stickstoff (N2) pro Liter (bel Gemischen je 15,1 mM pro Komponente) BebrUtungszeit: ca. 200 Stunden
x = mittlere Menge des betreffenden Stoffes in mM pro Liter, berechnet aus den Analysenwerten von drei gleichzeitigen, parallel gefUhrten Gärungen
5 = mittlere Abweichung vom Mittelwert, berechnet mittels Streuungsquadraten
1. 2. 3. 7. 8. 9.
NH4-Azetat NH4 -Azetat L (-) -Serin + NH -Azetat + L(-) -8erin L (-) - Leucin Substrat A
L
1-)
-Leucinunver- vergoren unver- vergóren unver- vergoren unver- vergoren unver- vergoren unver- vergoren
goren x 5 goren x I s goren x 5 goren x 5 goren x 5 gor en ië 5
6,42 5,02 0,02 6,70 4,91 10,01 6,28 4,83 0,03 6,50 5,00 0,00 6,68 5,06 0,03 6,40 4,70 0,02 125,10 81,50 1,50 160,00 112,3C 1,20 152,20 91,00 0,00 168,30 136,40 2,61 134,70 112,60 1,20 146,70 77,70 7,80 I 0,00 34,06 2,82 0,00 40,5E 3,51 0,00 30,10 1,69 0,00 4,93 1,36 0,54 3,51 0,20 0,00 25,29 3,29 , 56,00 31,06 1,42 37,80 24,9C 1,21 39,10 24,30 4,30 2,88 12,61 3,50 1,52 8,87 1,75 37,40 28,91 3,65 0,25 0,00 0,00 3,60 2,3C 1,85 3,30 2,30 1,40 0,24 0,55 0,13 0,00 0,14 0,02 2,58 2,94 0,04 0,72 9,41 3,47 0,00 9,4E 1,60 0,34 3,47 1,18 0,00 0,00 0,00 0,11 0,54 0,27 0,33 P.5,30 2,52 0,02 0,96 0,17 --- 4,16 0,17 --- 2,77 0,12 0,41 2,62 0,12
---
2,93 0,10 2,12 4,12 0,60 2,62 1,91 1,45 5,16 2,37 0,03 1,65 1,99 0,03 3,45 3,90 0,65 5,40 3,88 1,12 4,27 0,00 0,00 - - - ---C.:l 1:11 Serie-Nr. N-Quellen pH D-Glukose Buttersllure Esslgsäure Amelsensäure Butanol Azeton + Isopropanol Äthanol TABELLE 6 Serlen 4. - 8.: Substrat B; Serie 9.: Substrat A
Alle N-Quellen zu 30,2 mM Stickstoff (N2) pro Liter (bel Gemischen je 15,1 mM pro Komponente) BebrUtungszelt: ca. 200 Stunden
x
= mlttlere Menge des betreffenden Stoffes In mM pro Liter, berechnet aus den Analysenwerten von drel glelchzeltlgen, parallel gefUhrten Gärungens = mlttlere Abwelchung vom Mlttelwert, berechnet mlttels StreuUDgsquadraten
4. 5. 6. 7. 8. 9.
(NH4)2S04 (NH4)2S04 + (NHf-2S04 + L (-) -Berin L (-) -Leucln Substrat A
LH -Ser In L -) -Leucln
unver- vergoren unver- vergoren unver- vergoren unver- vergoren unver- vergoren unver- vergoren goren x s goren x s gor en
x
s goren x s goren x s goren ii s6,47 4,57 0,01 6,54 4,64 0,02 6,48 4,46 0,03 6,50 5,00 0,00 6,68 5,06 0,03 6,40 4,70 0,02 124,50 108,00 0,33 155,60 111,50 3,51 146,70 105,60 2,72 168,30 136,40 2,61 134,70 112,60 1,20 146,70 77,70 7,80 0,30 6,36 0,21 0,44 13,16 0,88 1,23 9,52 0,95 0,00 4,93 1,36 0,64 3,51 0,20 0,00 25,29 3,29 2,63 4,04 0,10 0,91 5,13 0,24 0,79 4,18 1,00 2,88 12,61 3,50 1,52 8,87 1,75 37,40 28,91 3,65 0,00 2,35 0,99 0,00 1,43 1,00 0,12 1,08 0,11 0,24 0,55 0,13 0,00 0,14 0,02 2,58 2,94 0,04 0,00 0,30 0,01 0,00 1,94 0,32 0,00 0,88 0,04 0,00 0,00 0,00 0,11 0,54 0,27 0,33 15,30 2,52 0,00 0,28 0,10 --- 0,35 0,08
---
0,39 0,08 0,41 2,62 0,12---
2,93 0,10 2.12 4,12 0,60 1,84 1,91 0,20 1,51 1,55 0,18 1,81 1,69 0,19 3,45 3,90 0,65 5,40 3,88 1,12 4,27 0,00 0,0036 70 r L ~ ..J 60 r-0 L Q. :!: 50 r-E 40 ~ 30 -20 r-10 r-Serie-Nr 70 L 1l :3 60 o Q. 50 :!: E 40 30 20 10 Fig.9
~
h
In
1 2 3 ' 5 1 2 3 ' 5 , 2 J , 5 1. 2. 3. Fig.10 Serie-Nr. 4. 5. 6. 7. Fig. 9 und 10.h
1 2 3 , 5 9. 8.Graphische Darstellung von Werten der Tabellen 5 und 6. dissimilierte Glukose 9. 1 2 3 4 5 Buttersäure Essigsäure Butanol Azeton + Isopropanol
~
GlIrendproduktedukte mit zunehmender Azetatkonzentr"Mi0n....steigt (Serien 9, 2, 3 und 1, Fig. 9). Man darf daraus wohl auf eine Umwand-lung der Essigsäure in Buttersäure, wie dies auch aus dem Gärschema des 1. Kapitels (1. 2.1) hervorgeht, schliessen.
Aus den Tabellen 5 und 6, sowie den Figuren 9 und 10, sticht ferner der geringe Anfall an Gärprodukten, verglichen mit der dissimilierten Menge an Glukose, bei allen nicht azetatenthaltenden Serien hervor. Zu einem grossen Teil darf dafür sicher das Fehlen der Essigsäure verantwortlich gemacht werden. Es ist aber möglich, dass im FalIe der Substrate 4. - 8. grössere Mengen an Gärgasen, oder analytisch nicht erfasste Produkte auftraten.
Eine direkte Beurteilung der Verteilung der Endprodukte kann nur in Abhängigkeit der umgesetzten Glukose vollzogen werden. Verschiedene Umstände erschweren aber eine absolute Betrachtung der Resultate. Einerseits ist es nicht möglich eme genaue Kohlenstoffbilanz aufzustelIen, weil die Menge an assi-milierter Glukose nicht erfasst wurde. Anderseits hat man in den Serien 1., 2., 3. und 9. dem Substrat grössere Mengen an Essigsäure zugefdgt, die zum Teil in andere Gärprodukte umgewandelt wurden. Der Ursprung der am Ende der Gärung bestimmten Essigsäure kann demzufolge nicht festgestellt werden. Ferner ist die in Clostridium-Gärtlngen stets erhebliche Menge an Kohlendioxyd unbekannt, ebenso die mit den Gärgasen entwichenen andern Endprodukte.
Diese Gründe zwangen uns die Art und Weise der Verteilung der einzelnen Dissimilationsprodukte relativ zur gesamten Menge der analysierten Verbindungen, resp. zur umgesetzten Glukose ,
zu beurteilen. Die dementsprechend berechneten Werte, die .in den Figuren 11 und 12 vorliegen, stellen selbstverständlich ein wilIkürliches Vergleichsmass dar. Sie beruhen aus den oben aufgezählten Gründen nicht auf einer stöchiometrischen Bilanz und sind daher mit entsprechender Vorsicht zu hand-haben.
. Aus Figuren 11 und 12 sticht eine deutliche vom Substrat abhängige Verschiedenheit der prozentualen Endproduktever-teilung hervor, deren wichtigste Merkmale kurz erwähnt wer-den sollen.
Auf den azetatenthaltenden Medien (Serien 1. - 3. und 9., Fig. 11) ist der bereits ob en diskutierte Effekt dieser Ver-bindung im überwiegenden Buttersäureanteil wieder zu erkennen.
Der prozentuale Anteil von Essigsäure und Azeton plus Isopro-panol des L-Serin-haltigen Gärsubstrates ist auffallend hoch, dagegen wird auf diesem Medium kein Butanol gebildet. Das L-Leucin zeitigt eine ganz ähnliche Wirkung, jedoch rállt hier
38 60 -50 f-40 f30 -20
-10 f-h~
~
h
1234 1234 1234 1234 1234 1234 Sprie-Nr. 1. 2. 3. 7. 8. 9. Fig. IloDarstellung der prozentualen Anteile einzelner Produkte von der Gesamtheit der
Gärend-produkte auf millimolarer Basis 1 : Buttersäure
2 : Essigsäure 3 : Butanol
60 I-50 I-40 I-30 I-20 I-10
I-Hl
h
h
h
1234 1234 1234 1234 1234 1234 Serie-Nr. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Fig. 12.Darstellung der prozentualen Anteile einzelner
Produkte von der Gesamtheit der
Gärend-produkte auf millimolarer Basis
1 Buttersäure
2 Essigsäure
3 Butanol
4 Azeton + Isopropanol
