Medycyna Weterynaryjna - Summary Medycyna Wet. 66 (12), 847-851, 2010

Praca oryginalna Original paper

Pocz¹wszy od czasów Hipokratesa srebro by³o stosowane w medycynie jako œrodek dezynfekcyjny w leczeniu ran i oparzeñ, ze wzglêdu na swoje silne dzia³anie antybakteryjne, przy jednoczesnej niskiej toksycznoœci dla organizmu cz³owieka. W³aœciwoœci te przyczyni³y siê w ostatnich latach do zainteresowa-nia tym pierwiastkiem nowej dziedziny nauki – nano-technologii. Nanotechnologia zajmuje siê projektowa-niem, syntez¹ i manipulowaniem materia³ami o, przy-najmniej jednym z rozmiarów, mniejszym od 100 nm. W³aœciwoœci fizyczne, chemiczne i biologiczne takich substancji ró¿ni¹ siê znacz¹co od w³aœciwoœci trady-cyjnych materia³ów, co wynika g³ównie z ich ogrom-nej, w stosunku do objêtoœci, powierzchni. Nanosreb-ro jest obecnie jednym z najczêœciej stosowanych nano-materia³ów, a ³atwoœæ aplikacji sprawia, ¿e rozmaitoœæ

jego zastosowañ roœnie niemal z ka¿dym dniem. Naj-intensywniej eksploatowane jest ono w medycynie, przy uzdatnianiu wody i w produkcji artyku³ów co-dziennego u¿ytku. W medycynie nanosrebro zaprzê-¿ono do walki z potencjalnym ryzykiem zaka¿enia os³abionego organizmu trudnymi do zwalczenia drob-noustrojami, posiadaj¹cymi zdolnoœæ do tworzenia biofilmu na sztucznych powierzchniach, wprowadza-nych do organizmu. Powlekane s¹ nim zatem katetery, sztuczne zastawki, rêkawy teflonowe do naprawy na-czyñ krwionoœnych czy wreszcie endoprotezy. Z tych samych wzglêdów srebro wbudowywane jest w drob-ny sprzêt medyczdrob-ny i stosowane do produkcji opatrun-ków na trudno goj¹ce siê rany, zw³aszcza po rozleg-³ych oparzeniach cia³a. W przypadku drugiej, istotnej dziedziny, wykorzystuj¹cej nanosrebro – uzdatniania

Wp³yw nanocz¹steczek srebra na ¿ywotnoœæ

i aktywnoœæ proliferacyjn¹ jednoj¹drzastych

leukocytów krwi obwodowej i splenocytów mysich

– badania in vitro

JOANNA MA£ACZEWSKA

Katedra Mikrobiologii i Immunologii Klinicznej Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UWM, ul. Oczapowskiego 13, 10-719 Olsztyn

Ma³aczewska J.

In vitro effect of silver nanoparticles on the viability and proliferative response of mice peripheral blood mononuclear cells and splenocytes

Summary

Silver nanoparticles (SNP) have been recently one of the most widely utilized nanomaterials, mostly because of their antimicrobial activity. For some time there has been a great interest in SNP of unconventional medicine, which recommends their use not only as an antimicrobial, but also as an immunostimulant. However, little is known about SNP’s impact on immunocompetent cells in vitro.

The aim of a present study was to investigate the influence of the colloidal nano-silver solution on the viability and proliferative response of mice peripheral blood mononuclear leukocytes and splenocytes in vitro. After isolation cells were cultured in complete RPMI-1640 medium containing 0 (control), 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.2, 0.1 and 0.05 ppm of SNP, for 24 and 48 h to investigate SNP’s impact on cell viability, and for 72 h to evaluate their effect on the proliferative response of cells. Both parameters were assessed using MTT assay.

Obtained results suggest that SNP have significant influence on the both investigated parameters. High doses of SNP significantly decreased (p < 0.01) the viability (concentrations of 5-20 ppm for splenocytes and 2-20 ppm for leukocytes, respectively) and proliferative response of cells (splenocytes: 5-20 ppm, leukocytes: 10-20 ppm) whereas low SNP’s doses slightly increased (p > 0.05) the viability of cells (splenocytes: 1 ppm, leukocytes: 0.2 ppm) and significantly increased stimulation index of both cell types induced by mitogens (splenocytes: 0.2-0.5 ppm, p < 0.05; leukocytes: 0.1-0.5 ppm, p < 0.01). These experimental data constitute an encouragement for further investigations concerning the possibility of therapeutic use of SNP’s low doses.

wody, stosuje siê zarówno rozwi¹zania na ma³¹ skalê, jak filtry ceramiczne z pow³okami z nanosrebra dla oczyszczania wody pitnej w gospodarstwach domo-wych, jak i rozwi¹zania bardziej globalne, takie jak sprzêty do dezynfekcji wody z basenów i kurortów spa czy uzdatniania wody dla du¿ych obszarów po klê-skach ¿ywio³owych. O ile korzyœci wynikaj¹ce ze sto-sowania nanosrebra w dwóch pierwszych dziedzinach wydaj¹ siê bezdyskusyjne i przewa¿aj¹ nad potencjal-nymi skutkami uboczpotencjal-nymi wprowadzania nowego, nie do koñca przebadanego materia³u, o tyle mniej oczy-wiste wydaje siê adresowanie tego typu produktów do szerokiej rzeszy u¿ytkowników. Dla typowego, deta-licznego konsumenta wytwarzane s¹ bowiem przed-mioty takie, jak: zastawa sto³owa, sztuæce, pojemniki do przechowywania ¿ywnoœci zawieraj¹ce nanosrebro, tkaniny uwalniaj¹ce ten pierwiastek, z których wytwa-rza siê bieliznê i odzie¿ sportow¹ oraz kosmetyki, do których dodano srebro ze wzglêdu na jego dzia³anie antyseptyczne i konserwuj¹ce. Jeszcze wiêksze kon-trowersje budz¹ jednak, nieobjête ¿adn¹ reglamenta-cj¹, produkty medycyny niekonwencjonalnej, jak ko-loidalne roztwory nanosrebra przeznaczone do picia. Producenci tego typu preparatów, powszechnie dostêp-nych choæby w sklepach internetowych, zalecaj¹ co-dzienne spo¿ywanie swoich produktów dla ochrony przed zaka¿eniami, wzmocnienia uk³adu immunolo-gicznego i poprawienia ogólnej kondycji organizmu. Tymczasem niewielka jest wiedza empiryczna na te-mat rzeczywistej skutecznoœci takiej terapii i poten-cjalnego ryzyka stosowania nanosrebra, zwi¹zanego z jego unikatowymi w³aœciwoœciami (4). Przy wpro-wadzaniu na rynek nowych suplementów diety ko-nieczne wydaje siê najpierw gruntowne przebadanie ich dzia³ania, tak in vitro, jak in vivo na modelu zwie-rzêcym. Doniesienia literaturowe na ten temat s¹ jed-nak doœæ sk¹pe, a wyniki badañ ró¿nych zespo³ów nad wp³ywem nanocz¹steczek srebra na aktywnoœæ komó-rek immunokompetentnych pozostaj¹ czêsto we wza-jemnej sprzecznoœci.

Celem badañ by³o okreœlenie wp³ywu komercyjne-go preparatu zawieraj¹cekomercyjne-go nanoczasteczki srebra – „Koloidu srebra (niejonowego)” (Nano-Tech Polska Sp. z o.o.) na ¿ywotnoœæ i aktywnoœæ proliferacyjn¹ jednoj¹drzastych leukocytów krwi obwodowej i sple-nocytów mysich w warunkach in vitro.

Materia³ i metody

Materia³ do badañ stanowi³y krew obwodowa i œledzio-ny pobrane od dwudziestu sztuk samców myszy linii NMRI o œredniej masie cia³a 25-30 g, otrzymanych z Katedry Pa-tofizjologii, Weterynarii S¹dowej i Administracji Wydzia-³u Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Warmiñsko--Mazurskiego w Olsztynie. Zwierzêta poddawano narko-zie wnarko-ziewnej z u¿yciem preparatu AErrane (isofluranum, Baxter Poland Sp. z o.o.). Krew do badañ pobierano meto-d¹ punkcji serca, zaœ po skrwawieniu zwierz¹t sekcyjnie pobierano narz¹dy. Materia³ pobrany od 10 sztuk zwierz¹t

przeznaczony zosta³ do oszacowania wp³ywu nanosrebra na ¿ywotnoœæ komórek, zaœ od pozosta³ych 10 do oznacze-nia wp³ywu na ich aktywnoœæ proliferacyjn¹ pod wp³ywem mitogenów. Badania przeprowadzono po uprzednim uzy-skaniu zgody Lokalnej Komisji Etycznej ds. Doœwiadczeñ na Zwierzêtach w Olsztynie (uchwa³a nr 77/2009).

Z badanej krwi izolowano leukocyty przez wirowanie w gradiencie z u¿yciem preparatu Gradisol L (Aqua-Medi-ca). Ten sam preparat u¿yty zosta³ do izolacji splenocytów, po uprzednim przetarciu œledziony przez nylonowe sito o oczkach wielkoœci 60 µm i nawarstwieniu uzyskanego przecieru na gradient. Po izolacji oznaczano ¿ywotnoœæ komórek przy u¿yciu b³êkitu trypanu (Sigma-Aldrich). We wszystkich przypadkach ¿ywotnoœæ komórek wynosi³a po-wy¿ej 95%. Wyizolowane komórki w iloœci 3-5 × 106_/ml

hodowano nastêpnie w pod³o¿u RPMI-1640 (Sigma-Al-drich) z dodatkiem 10% p³odowej surowicy bydlêcej (Sig-ma-Aldrich) i 1% antybiotyku (Antibiotic Antimycotic Solution, Sigma-Aldrich), w 37°C. Pod³o¿e do hodowli ko-mórek zawiera³o, odpowiednio: 0 (kontrola), 20, 10, 5, 2, 1, 0,5, 0,2, 0,1 i 0,05 ppm nanocz¹steczek srebra. Stê¿enia powy¿sze uzyskano mieszaj¹c z pod³o¿em hodowlanym „Koloid srebra (niejonowy)” (Nano-Tech Polska Sp. z o.o.), zawieraj¹cy nanocz¹stki srebra metalicznego zawieszone w wodzie demineralizowanej w stê¿eniu 50 ppm (brak da-nych nt. wielkoœci cz¹stek). Hodowla w obecnoœci badane-go preparatu trwa³a 24 i 48 badane-godzin w przypadku oznaczania ¿ywotnoœci komórek, zaœ 72 godziny dla wyznaczenia aktyw-noœci proliferacyjnej komórek pod wp³ywem mitogenów.

¯ywotnoœæ komórek oraz ich aktywnoœæ proliferacyjn¹ po stymulacji mitogenami – ConA (konkanawalina A) w stê¿eniu 10 µg/ml i LPS (lipopolisacharyd z Salmonella enterica) w stê¿eniu 10 µg/ml (Sigma-Aldrich) szacowano przy pomocy metody MTT (3-[4,5-dimethylthiazoly-2yl]--2,5-diphenyltetrazolium bromide; 3-[4,5-dimetylo-2tiazolilo]--2,5-difenylo-2H-tetrazolinowy bromek), opisanej pierwot-nie przez Mossmanna (5). Wyniki testu odczytywano spek-trofotometrycznie, przy d³ugoœci fali 570 nm, na czytniku Sunrise (Tecan, Austria). Za 100% ¿ywotnoœæ przyjêto œred-ni odczyt gêstoœci optycznej (OD) uzyskany w przypadku komórek kontrolnych, inkubowanych bez dodatku srebra i do wartoœci tej odnoszono pozosta³e odczyty. Przy szaco-waniu aktywnoœci proliferacyjnej komórek wyniki przed-stawiono w postaci indeksu stymulacji limfocytów (SI), gdzie SI wyra¿a stosunek œredniej OD komórek stymulo-wanych mitogenem do œredniej OD komórek niestymulo-wanych (kontrolnych).

Dane analizowano statystycznie przy u¿yciu jednoczyn-nikowej analizy wariancji (ANOVA). Istotnoœæ ró¿nic miê-dzy grupami weryfikowano przy pomocy testu Bonferroni przy p < 0,05 i p < 0,01.

Wyniki i omówienie

Nanocz¹steczki srebra u¿yte w doœwiadczeniu wp³y-wa³y na ¿ywotnoœæ badanych komórek w stopniu za-le¿nym od dawki i czasu inkubacji. Wysokie stê¿enia cz¹stek (20 i 10 ppm) dzia³a³y cytotoksycznie ju¿ po up³ywie 24 godz. inkubacji, obni¿aj¹c ¿ywotnoœæ leu-kocytów, odpowiednio, o 72,6 i 58,8% (p < 0,01), zaœ splenocytów o 62,8 i 50,9% (p < 0,01) w stosunku do

kontroli. Po 48-godzinnej ekspozycji cytotoksyczne dzia³anie wykazywa³y równie¿ ni¿sze stê¿enia nano-cz¹stek. W przypadku leukocytów statystycznie istot-ny spadek ¿ywotnoœci komórek (p < 0,01) obserwo-wano przy stê¿eniach 2-20 ppm, zaœ nasilenie procesu by³o proporcjonalne do u¿ytego stê¿enia preparatu – przy stê¿eniu 2 ppm ¿ywotnoœæ komórek ulega³a obni¿eniu o 22%, przy stê¿eniu najwy¿szym o 81,5%. Splenocyty cechowa³a mniejsza wra¿liwoœæ – toksycz-ne okaza³y siê dawki 5-20 ppm (p < 0,01). Jednoczeœ-nie po 48 godz. inkubacji obserwowano proliferacjê komórek pod wp³ywem niskich stê¿eñ preparatu, manifestuj¹c¹ siê wzrostem ich ¿ywotnoœci o 11,9% w stosunku do kontroli w przypadku leukocytów (stê-¿enie 0,2 ppm) i 12,5% w przypadku splenocytów (stê¿enie 1 ppm), jednak uzyskany efekt nie by³ staty-stycznie istotny (p > 0,05) (tab. 1, 2).

Choæ w dostêpnej literaturze pojawiaj¹ siê prace traktuj¹ce o wp³ywie nanocz¹stek srebra na ¿ywotnoœæ ró¿nych typów komórek in vitro, doniesienia o ich dzia³aniu na komórki immunokompetentne s¹ nielicz-ne, a tylko jedna publikacja opisuje wp³yw nanosrebra na ludzkie leukocyty krwi obwodowej (9). Jej autorzy zanotowali znacz¹ce obni¿enie ¿ywotnoœci komórek po 72 h inkubacji z wysokimi dawkami nanocz¹stek – od 15 ppm. Ni¿sze stê¿enia nie wywiera³y statystycz-nie istotnego efektu, choæ podobstatystycz-nie, jak w nistatystycz-niejszej pracy, stê¿enie 1 ppm mia³o niewielkie dzia³anie pro-liferacyjne. Bardziej wra¿liwe na cytotoksyczne od-dzia³ywanie nanosrebra by³y natomiast ci¹g³e linie ko-mórek ¿ernych – mysie makrofagi otrzewnowe (RAW 264.7) wykazywa³y znacz¹cy spadek ¿ywotnoœci ju¿ pod wp³ywem tak niskiej dawki nanosrebra, jak 1.6 ppm, zaœ dla linii ludzkich monocytów (THP-1) daw-ka EC₅₀ nanocz¹stek srebra powleczonych PVP

wyno-si³a 2,4 µg/ml (2, 7). Ni¿sza wra¿liwoœæ hodowli pier-wotnych w porównaniu z liniami ci¹g³ymi jest zjawi-skiem oczywistym, jednak¿e wyniki badañ w³asnych wskazuj¹ na stosunkowo wysok¹ wra¿liwoœæ œwie¿o izolowanych komórek mysich, porównywaln¹ raczej z wra¿liwoœci¹ ci¹g³ych linii komórkowych. Rozbie¿-noœæ ta mo¿e wynikaæ z gatunkowej ró¿nicy wra¿li-woœci komórek, choæ bardziej prawdopodobny wyda-je siê odmienny efekt dzia³ania ró¿nych badanych pre-paratów z nanosrebrem. Trudno natomiast na podsta-wie wyników testu MTT, stosowanego w badaniach w³asnych, dywagowaæ nad mechanizmem toksyczne-go dzia³ania nanosrebra, jako ¿e test ten jedynie po-œrednio ocenia wp³yw substancji na aktywnoœæ mito-chondriów, nie daj¹c szczegó³owego wgl¹du w sub-komórkowy mechanizm ich dzia³ania. Mo¿na jednak zak³adaæ, ¿e podobnie jak w badaniach innych auto-rów, zanotowane obni¿enie aktywnoœci mitochondriów wi¹za³o siê z wywo³aniem przez nanosrebro stresu oksydacyjnego w komórce. Istotny wzrost poziomu reaktywnych form tlenu, wskazuj¹cy na rozwój stresu oksydacyjnego pod wp³ywem nanosrebra zanotowa-no w linii ludzkich mozanotowa-nocytów (THP-1), zaœ w my-sich makrofagach (RAW 264.7) obserwowano spadek poziomu dysmutazy ponadtlenkowej i wewn¹trzko-mórkowego glutationu, które s¹ wa¿nymi sk³adowy-mi systemu komórkowej obrony antyoksydacyjnej oraz zwiêkszony poziom metaloproteinaz, uczestnicz¹cych w degradacji komórek pod wp³ywem stresu oksyda-cyjnego (2, 7). Wyczerpanie mo¿liwoœci systemu ochronnego komórki prowadzi do uruchomienia kas-kady kaspaz i apoptozy komórek na drodze mitochon-drialnego szlaku œmierci komórki, co potwierdzili Fold-bjerg i wsp. (2) w linii ludzkich monocytów (THP-1) inkubowanych z nanosrebrem.

Tab. 2. Wp³yw nanocz¹steczek srebra na ¿ywotnoœæ jednoj¹drzastych leukocytów krwi obwodowej myszy

Objaœnienia: jak w tab. 1

s a z C ij c a b u k n i WskaŸ kni ) m p p ( a r b e r s k e t s ¹ z c o n a n e i n e ¿ ê t S ) K ( 0 20 10 5 2 1 0,5 0,2 0,1 0,05 . z d o g 4 2 M 100 27,4* 41,2* 84,7 95,2 99,8 97,4 101,1 100,5 99,3 D S 6,7 4,0 3,7 6,5 7,1 4,5 3,7 7,2 5,1 3,9 . z d o g 8 4 M 100 18,5* 19,5* 44,7* 78* 89,9 95,5 111,9 95,0 104,7 D S 5,9 2,5 3,5 4,5 11,0 7,4 3,6 6,9 4,1 5,3

Tab. 1. Wp³yw nanocz¹steczek srebra na ¿ywotnoœæ splenocytów mysich

Objaœnienia: M – œrednia; SD – odchylenie standardowe; K – komórki kontrolne inkubowane bez dodatku nanocz¹stek; * – ró¿nica statystycznie istotna w stosunku do kontroli przy p < 0,01

s a z C ij c a b u k n i WskaŸ kni ) m p p ( a r b e r s k e t s ¹ z c o n a n e i n e ¿ ê t S ) K ( 0 20 10 5 2 1 0,5 0,2 0,1 0,05 . z d o g 4 2 M 100 37,2* 49,1* 82,3 99,5 102,4 99,8 100,7 99,7 99,2 D S 6,1 4,1 3,7 9,1 7,4 5,2 4,5 3,2 2,7 5,6 . z d o g 8 4 M 100 26,5* 37,4* 39,7* 98,7 112,5 103,4 101,8 102,0 98,0 D S 7,2 2,2 5,1 4,5 2,1 11,0 8,1 7,5 4,0 3,5

Zaobserwowany w badaniach w³asnych wp³yw na-nosrebra na ¿ywotnoœæ komórek nie pokrywa³ siê w pe³ni z jego oddzia³ywaniem na proliferacjê komó-rek pod wp³ywem mitogenów. Dwie najwy¿sze dawki (20 i 10 ppm) hamowa³y, co prawda, znacz¹co pro-liferacjê obu typów komórek pod wp³ywem ConA (p < 0,01), nie wp³ywa³y jednak istotnie na prolifera-cjê stymulowan¹ LPS (p > 0,05), choæ indeks stymu-lacji komórek inkubowanych ze srebrem by³ ni¿szy od indeksu komórek kontrolnych. Znacz¹cy spadek proliferacji komórek pod wp³ywem LPS zanotowano tylko w przypadku splenocytów i wy³¹cznie przy dawce 5 ppm (p < 0,01). Z kolei niskie, nietoksyczne stê-¿enia nanocz¹stek srebra wp³ywa³y korzystnie na ba-dany parametr. Stymulacjê proliferacji splenocytów pod wp³ywem ConA obserwowano przy dawkach 0,2 (p < 0,01) i 0,5 ppm (p < 0,05), zaœ leukocytów przy dawkach 0,1-0,5 ppm (p < 0,01). W obu typach komó-rek efekt by³ najsilniej wyra¿ony przy stê¿eniu 0,2 ppm. Natomiast na proliferacjê stymulowan¹ LPS korzyst-nie wp³ywa³y dawki 0,2 i 0,5 ppm w przypadku leuko-cytów (p < 0,01) i 0,2 ppm w przypadku splenoleuko-cytów (p < 0,05) (tab. 3, 4).

Badania innych autorów potwierdzaj¹ niekorzystny wp³yw wysokich dawek nanosrebra na proliferacjê komórek immunokompetentnych – stê¿enie 10 ppm znacz¹co obni¿a³o aktywnoœæ proliferacyjn¹ leukocy-tów krwi obwodowej cz³owieka i mysich makrofagów. W ¿adnej z cytowanych prac nie wykazano jednak sty-mulacji proliferacji przy ni¿szych dawkach cz¹stek (9, 11). Co prawda, inkubacja leukocytów cz³owieka z na-nosrebrem w stê¿eniach 1-5 ppm wi¹za³a siê z pod-wy¿szeniem indeksu stymulacji komórek pod wp³y-wem fitohemaglutyniny, jednak uzyskany efekt nie by³ statystycznie istotny (9). W tym przypadku

rozbie¿-noœæ uzyskanych wyników z wynikami badañ innych autorów z ca³¹ pewnoœci¹ umotywowaæ mo¿na zakre-sem stosowanych stê¿eñ, bowiem w obu cytowanych pracach najni¿sza badana dawka nanocz¹stek wyno-si³a 1 ppm, a korzystny efekt dzia³ania nanosrebra w badaniach w³asnych odnotowano przy dawkach kil-kakrotnie ni¿szych (0,1-0,5 ppm). Mimo braku korzyst-nego dzia³ania na proliferacjê, inni autorzy wykazali jednak wp³yw nanosrebra na aktywnoœæ komórek im-munokompetentnych, choæ przedstawione przez nich wyniki nie s¹ zgodne. Yen i wsp. (11) obserwowali zmiany morfologii mysich makrofagów, bêd¹ce wi-doczn¹ oznak¹ aktywacji komórek, zaœ Shin i wsp. (9) zanotowali spadek produkcji cytokin prozapalnych (IL-5, INF-ã, TNF-á) przez leukocyty krwi obwodo-wej cz³owieka stymulowane PHA pod wp³ywem na-nocz¹stek. Z drugiej natomiast strony, Santoro i wsp. (8) oraz Park i wsp. (7) wykazali wzrost poziomu cy-tokin prozapalnych w hodowli mysich makrofagów pod wp³ywem nanosrebra. O ile w pierwszym przy-padku obserwowany efekt nie by³ statystycznie istot-ny, o tyle wg Park i wsp. (7) dzia³anie prozapalne nano-srebra, wyra¿one wzmo¿on¹ produkcj¹ NO i TNF-á oraz nasilon¹ ekspresj¹ genów TNF-á, by³o niezaprze-czalne. Tymczasem nieliczne doœwiadczenia przepro-wadzone na zwierzêtach wykaza³y wy³¹cznie dzia³a-nie przeciwzapalne nanosrebra, w zakresie modulacji ekspresji cytokin (obni¿enie ekspresji cytokin proza-palnych, wzmo¿ona ekspresja przeciwzapalnych) i nasi-lonej apoptozy komórek zapalnych. Efekt taki obser-wowano na œwiñskim i mysim modelu kontaktowego zapalenia skóry oraz mysim modelu ran pooparzenio-wych, po zastosowaniu zewnêtrznych opatrunków i kremów z nanosrebrem (1, 6, 10).

Objaœnienia: jak w tab. 1

Tab. 4. Wp³yw nanocz¹steczek srebra na aktywnoœæ proliferacyjn¹ jednoj¹drzastych leukocytów krwi obwodowej myszy stymulowanych mitogenami (SI)

n e g o ti M WskaŸ kni Stê¿enienanocz¹steksrebra(ppm) ) K ( 0 20 10 5 2 1 0,5 0,2 0,1 0,05 A n o C )l m / g µ 0 1 ( M 1,295 0,919* 0,963* 1,104 1,335 1,433 1,621* 2,183* 1,706* 1,343 D S 0,148 0,117 0,086 0,154 0,184 0,209 0,277 0,239 0,172 0,176 S P L )l m / g µ 0 1 ( M 1,203 1,083 1,018 1,035 1,182 1,053 1,505* 1,798* 1,392 1,239 D S 0,134 0,161 0,081 0,110 0,173 0,101 0,114 0,136 0,132 0,128

Tab. 3. Wp³yw nanocz¹steczek srebra na aktywnoœæ proliferacyjn¹ splenocytów mysich stymulowanych mitogenami (SI)

Objaœnienia: jak w tab. 1; ** – ró¿nica statystycznie istotna w stosunku do kontroli przy p < 0,05

n e g o ti M WskaŸ kni Stê¿enienanocz¹steksrebra(ppm) ) K ( 0 20 10 5 2 1 0,5 0,2 0,1 0,05 A n o C )l m / g µ 0 1 ( M 1,505 1,022* 1,075* 1,370 1,682 1,747 1,832** 2,080* 1,743 1,71 D S 0,166 0,184 0,068 0,165 0,154 0,173 0,334 0,198 0,156 0,290 S P L )l m / g µ 0 1 ( M 1,199 0,980 0,923 0,844* 1,094 1,223 1,503** 1,129 1,204 1,303 D S 0,125 0,131 0,255 0,093 0,198 0,150 0,239 0,247 0,161 0,265

Pomimo pewnych rozbie¿noœci uzyskanych wyni-ków, zarówno badania w³asne, jak i innych autorów, wskazuj¹, ¿e nanocz¹steczki srebra wywieraj¹ znacz¹-cy wp³yw na ¿ywotnoœæ i aktywnoœæ komórek immu-nokompetentnych in vitro. Ich dzia³anie uzale¿nione jest jednak od du¿ej iloœci zmiennych (pochodzenie komórek i samych nanocz¹steczek, wysokoœæ dawek, czas ekspozycji), które nale¿a³oby uwzglêdniæ przy ocenie skutecznoœci dzia³ania nanosrebra jako poten-cjalnego terapeutyku. Dodatkowo fakt, ¿e wysokie dawki nanosrebra wykazuj¹ dzia³anie cytotoksyczne, dyktuje ostro¿ne podejœcie do niego jako suplementu diety. Z drugiej strony, nie da siê wykluczyæ, ¿e odpo-wiednio dawkowane nanosrebro mog³oby znaleŸæ za-stosowanie jako immunomodulator w terapii okreœ-lonych schorzeñ, o czym œwiadczy choæby stymulacja proliferacji komórek przy niskich stê¿eniach nano-cz¹stek uzyskana w badaniach w³asnych czy te¿ do-wiedzione przez innych autorów dzia³anie przeciwza-palne nanosrebra (1, 6, 9, 10). Dla doprecyzowania jednak dawek, drogi i czasu administracji nanosrebra, a tak¿e wskazañ, przy których jego stosowanie przy-niesie wiêcej korzyœci ni¿ potencjalnych skutków ubocznych, konieczne jest przeprowadzenie gruntow-nych badañ w tym zakresie.

Piœmiennictwo

1.Bhol K. C., Schechter P. J.: Topical nanocrystalline silver cream suppresses inflammatory cytokines and induces apoptosis of inflammatory cells in a murine model of allergic contact dermatitis. Br. J. Dermatol. 2005, 152, 1235-1242. 2.Foldbjerg R., Olsen P., Hougaard M., Dang D. A., Hoffmann H. J., Autrup H.:

PVP-coated silver nanoparticles and silver ions induced reactive oxygen species, apoptosis and necrosis in THP-1 monocytes. Toxicol. Lett. 2009, 190, 156-162.

3.Lubick N.: Nanosilver toxicity: ions, nanoparticles – or both? Environ. Sci. Technol. 2008, 42, 8617.

4.Luoma S. N.: Silver nanotechnologies and the environment: old problems or new challenges? PEN 15, september 2008 (report by Project on Emerging Nanotechnologies; http://www.nanotechproject.org/publications/).

5.Mossmann T.: Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: appli-cation to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods 1983, 65, 55-63.

6.Nadworny P. L., Wang J. F., Tredget E. E., Burrell R. E.: Anti-inflammatory activity of nanocrystalline silver in a porcine contact dermatitis model. Nano-med. Nanotechnol. Biol. Med. 2008, 4, 241-251.

7.Park E. J., Yi J., Kim Y., Choi K., Park K.: Silver nanoparticles induce cytotoxi-city by a Trojan-horse type mechanism. Toxicol. in Vitro 2010, 24, 872-878. 8.Santoro C. M., Duchsherer N. L., Grainger D. W.: Minimal in vitro

anti-micro-bial efficacy and ocular cell toxicity from silver nanoparticles. Nanobiotechnol. 2007, 3, 55-65.

9.Shin S. H., Ye M. K., Kim H. S., Kang H. S.: The effects of nano-silver on the proliferation and cytokine expression by peripheral blood mononuclear cells. Int. Immunopharmacol. 2007, 7, 1813-1818.

10.Tian J., Wong K. K. Y., Ho C. M., Lok C. N., Yu W. Y., Che C. M., Chiu J. F., Tam P. K. H.: Topical delivery of silver nanoparticles promotes wound healing. ChemMedChem 2007, 2, 129-136.

11.Yen H. J., Hsu S. H., Tsai C. L.: Cytotoxicity and immunological response of gold and silver nanoparticles of different sizes. Small 2009, 5, 1553-1561. Adres autora: dr Joanna Ma³aczewska, ul. Oczapowskiego 13, 10-957 Olsztyn; e-mail: j.malaczewska7@wp.pl