Medycyna Wet. 2006, 62 (8) 913
Praca oryginalna Original paper
Grzyby z rodzaju Malassezia zaliczane do fizjolo-gicznej mikroflory skóry i b³on luzowych ludzi i zwie-rz¹t (7, 13) mog¹ byæ równie¿ izolowane, nierzadko w czystej kulturze, z przypadków zapalenia skóry (der-matitis) i zewnêtrznego przewodu s³uchowego (otitis externa) u zwierz¹t (14). U ludzi bior¹ udzia³ w etio-logii m.in. ³upie¿u pstrego, ³ojotokowego zapalenia skóry, atopowego zapalenia skóry, zapalenia mieszków w³osowych (1), a tak¿e mog¹ byæ odpowiedzialne za przypadki fungemii (18).
Malassezia pachydermatis, jedyny lipidoniezale¿-ny gatunek, izolowalipidoniezale¿-ny jest przede wszystkim od zwie-rz¹t, g³ównie psów i kotów; u psów wystêpuje w oko-³o 70% populacji, przy czym u osobników zdrowych odsetek ten wynosi oko³o 30%, u psów z objawami otitis externa 30-80%, a z objawami dermatitis 30% (21). Znacznie rzadziej szczepy M. pachydermatis kolonizuj¹ organizm kota; na skórze i b³onach luzo-wych stwierdzano je u oko³o 10% osobników zdro-wych i 13% zwierz¹t z objawami dermatitis (6). Po-zosta³e, lipidozale¿ne gatunki Malassezia izoluje siê g³ównie od ludzi (1), ale równie¿ ze skóry i b³on lu-zowych zdrowych zwierz¹t, m.in.: koni, byd³a, kóz (8) oraz rzadziej psów, kotów, fretek (4, 7).
W ostatnich latach obserwuje siê progresjê przypad-ków izolacji lipidozale¿nych szczepów Malassezia (M. sympodialis, M. globosa) od kotów z klinicznymi
objawami otitis externa i dermatitis (9-11). Crespo i wsp. (11) opisali natomiast pierwszy przypadek oti-tis externa u psa z udzia³em lipidozale¿nego szczepu Malassezia. Wystêpowanie u zwierz¹t, obok M. pa-chydermatis, pozosta³ych lipidozale¿nych gatunków Malassezia, a tak¿e stwierdzane coraz czêciej u ludzi infekcje skóry oraz przypadki fungemii na tle M. pa-chydermatis (2) ma bardzo wa¿ne znaczenie, zarów-no z medycznego, jak i epidemiologicznego punktu widzenia.
Celem badañ by³o okrelenie czêstoci wystêpowa-nia grzybów z rodzaju Malassezia, ze szczególnym uwzglêdnieniem gatunków lipofilnych, u zdrowych psów i kotów oraz zwierz¹t z objawami otitis externa, a tak¿e identyfikacja gatunkowa wyizolowanych szcze-pów na podstawie cech fenotypowych i genotypowych.
Materia³ i metody
Badaniami objêto ogó³em 215 zwierz¹t, w tym 65 psów i 10 kotów zdrowych klinicznie oraz 115 psów i 25 kotów z objawami otitis externa. Materia³ posiewano równolegle na pod³o¿e Sabourauda oraz na pod³o¿e z dodatkiem lipi-dów (glukoza 2%, pepton 1,5%, Tween-80 1%, oliwa z oli-wek 1%, agar 2%). Do obu rodzajów pod³ó¿ dodawano antybiotyki: gentamycynê 0,05 mg/l i aktidion 0,5 g/l. Po-siewy inkubowano w temperaturze 37°C przez 3, 5, 7 i 14 dni, a uzyskane hodowle oceniano makroskopowo i mikro-skopowo.
Izolacja lipidozale¿nych szczepów Malassezia
od psów i kotów
GRA¯YNA ZIÓ£KOWSKA, ANETA NOWAKIEWICZ
Zak³ad Mikrobiologii Weterynaryjnej Instytutu Chorób Zakanych i Inwazyjnych AR, ul. Akademicka 12, 20-033 Lublin
Zió³kowska G., Nowakiewicz A.
Isolating lipid-dependent strains Malassezia from dogs and cats Summary
The study investigated 180 clinically healthy dogs and 35 cats with symptoms of otitis externa. 96 strains of Malassezia were isolated, including 13.5% (13 strains) of the lipid-dependent species, and the remainder was classified as M. pachydermatis. Ten lipophilic isolates came from diseased animals, two of which were isolated from dogs.
M. globosa (5 strains), M. sympodialis (5 strains), M. furfur (one strain) were isolated within the lipophilic strain pool by using phenotype classification and two isolate species remained unidentified.
Genotype identification was performed by PCR-REA (ITS, 26S,Bt) and biochemical identification results for all M. sympodialis and M. globosa strains were confirmed. The M. furfur strain and two isolates of an unrecognizable species were reclassified to M. pachydermatis. Isolating lipid-dependent Malassezia strains from animals having otitis externa is a unique phenomena, and, it seems, that this is the first time in which their isolation and identification from dogs by the use of molecular biology techniques has been described.
Medycyna Wet. 2006, 62 (8) 914
Identyfikacja grzybów. Izolaty wykazuj¹ce wzrost na pod³o¿u Sabourauda i pod³o¿u wzbogaconym, po ocenie mikroskopowej, klasyfikowano wstêpnie jako M. pachy-dermatis, natomiast kolonie grzybów uzyskiwane jedynie na pod³o¿u wzbogaconym poddano dalszej identyfikacji. W tym celu wykonano nastêpuj¹ce próby:
na wytwarzanie katalazy z zastosowaniem 10% H2O2 (14);
rozk³ad eskuliny (15, 17);
Tween test (15), z zastosowaniem jako substratów: Tweenu 20 (Bio Rad), 40 (Fluka), 60 (Fluka), 80 (Stud-chartMerck) oraz Cremophoru EL (Fluka).
Izolacja DNA. Inokulum grzyba (0,5 ml) o gêstoci 2 × 109 komórek ml1, wprowadzono na sta³e pod³o¿e
z do-datkiem lipidów i inkubowano w temperaturze 37°C przez 3 dni. Uzyskane hodowle zbierano i zawieszano w ja³o-wym p³ynie fizjologicznym, nastêpnie wirowano przez 10 min. (8000 × g). Osad komórek zawieszano w 10 ml buforu lizuj¹cego (200 mM Tris HCl pH 8,0, 250 mM EDTA, 25 mM NaCl, SDS 0,5% w/v) i poddawano dezin-tegracji w homogenizerze komórkowym (Braun MSK) w 4°C przez 1 minutê. Uzyskany homogenat wirowano 10 min. (1500 × g) w 4°C. Supernatant mieszano w rów-nych ilociach (300 µl) z fenol : chloroform : alkohol izo-amylowy (25 : 24 : 1) i precypitowano w 700 µl alkoholu izopropylowego w 20°C przez 12 godzin, a nastêpnie wi-rowano przez 15 min. (1500 × g). Otrzymany osad p³ukano 70% alkoholem etylowym, wirowano
przez 10 min. (1500 × g), suszono i za-wieszano w 50 µl TE.
Startery do reakcji PCR (sekwen-cje starterów od koñca 5 do 3).
ITS1: TCCGTAGGTGAACCTG-CGG; ITS4: TCCTCCGCTTATTGA-TATGC 26S-A: TAGACGTTAGACTCCT-TGGT; 26S-S: GCTGAACTTAAGCA-TATCAT Bt-2a: GGTAACCAAATCGGTG-CTGCTTTC Bt-2b: ACCCTCAGTGTAGTGAC-CCTTGGC.
Reakcjê PCR-REA dla ITS, 26S oraz Bt wykonano wed³ug metodyki opisanej przez Gupta i wsp. (16), po uprzedniej modyfikacji w³asnej (20) i standaryzacji warunków reakcji. Dokumentacjê spo-rz¹dzono przy u¿yciu programu Gel--Dock 2000 (Bio Rad).
Wyniki i omówienie
Badania przesiewowe pozwoli³y wstêpnie ustaliæ, ¿e sporód 96 szcze-pów Malassezia wyosobnionych od zwierz¹t 83 izolaty nale¿a³y do gatun-ku Malassezia pachydermatis, 13 na-tomiast wykazywa³o cechy lipofilne (tab. 1). Lipidozale¿ne izolaty pocho-dzi³y zarówno od psów (n = 5), jak i od kotów (n = 8), przy czym 3 szcze-py wyizolowano od psów z
objawa-mi otitis externa, 7 za od chorych kotów (tab. 1). Bio-r¹c pod uwagê fakt, ¿e podstawowym kryterium przy-nale¿noci tych dro¿d¿aków do gatunku M. pachyder-matis jest ich wzrost na pod³o¿u Sabourauda bez do-datku lipidów, dalszej klasyfikacji fenotypowej pod-dano jedynie te izolaty, które nie namna¿a³y siê na tym pod³o¿u. Ró¿nicowanie przeprowadzone wed³ug sche-matu opracowanego przez Guillot i wsp. (15) wzbo-gacono o test asymilacji Cremophor EL oraz próbê rozk³adu eskuliny (17). Metoda ta, cechuj¹ca siê sto-sunkowo wysok¹ swoistoci¹, znalaz³a szerokie zasto-sowanie w diagnostyce mikologicznej i pozwala na obiektywn¹ ocenê uzyskiwanych wyników (1). Wyni-ki gatunkowej fenotypizacji przedstawiono w tab. 2.
p e z c z S y s P 0 8 1 = n nK=ot3y5 e w o r d Z Chore Zdrowe Chore . p p s a iz e s s a l a M 2315/6%5 6545/,161%5 110/1%0 1400/%25 s it a m r e d y h c a p a iz e s s a l a M 1287/%65 6523/,191%5 00/1%0 31/22%5 a iz e s s a l a M ilpidozale¿ne 32,/16%5 23/,161%5 110/1%0 27/82%5
Tab. 1. Izolacja szczepów Malassezia od psów i kotów
Tab. 2. Identyfikacja szczepów Malassezia metod¹ PCR-REA
Objanienia: ITS A 800 pz, B 700 pz; EcoRI C 450 i 350 pz, C 550, 450 I 350 pz, D 350 pz, E 400 i 350 pz; NcoI F 450 i 350 pz, G 800 pz, H 350 pz; Ava I 400 pz, K 600 pz; Bt L 550 pz, M brak amplifikacji r N u p e z c z s Gsa.t.tzkw.l/. bIdioecnhteymifkiacczjnaa ij c n e w k e s d o K Identyifkacja a n z c y t e n e g S T I EcoRI NcoI Ava Bt 0 6 pies M.globosa A D G K M M.globosa 1 6 pies M.globosa A D G K M M.globosa 2 1 1 pies M.globosa A D G K M M.globosa P 2 2 1 pies M.sympodiails B E H I L M.sympodiails L 2 2 1 pies M.sympodiails B E H I L M.sympodiails 7 0 1 kot M.sympodiails B E H I L M.sympodiails 8 0 1 kot M.sympodiails B E H I L M.sympodiails 9 0 1 kot M.sympodiails B E H I M M.sympodiails P 0 1 1 kot M.globosa A D G K M M.globosa L 0 1 1 kot M.globosa A D G K M M.globosa 5 1 1 kot M.fufrur A C F K L M.pachydermaits 9 3 1 kot ? A C F K M M.pachydermaits 3 4 1 kot ? A C F K M M.pachydermaits 5 2 9 7 CBS M.pachydermaits A C F K M M.pachydermaits 9 1 0 7 CBS M.fufrur A C F I L M.fufrur 2 2 2 7 CBS M.sympodiails B E H I L M.sympodiails 9 5 9 7 CBS M.sloofifae A C' G I L M.sloofifae 6 6 9 7 CBS M.globosa A D G K M M.globosa 7 7 8 7 CBS M.restircta A D G K L M.restircta 6 7 8 7 CBS M.obtusa A C G K M M.obtusa
Medycyna Wet. 2006, 62 (8) 915 Z 13 lipidozale¿nych szczepów
Ma-lassezia, 5 izolatów zaklasyfikowano do M. globosa, 5 do M. sympodialis, a jeden do M. furfur. Procedura ta nie pozwoli³a jednak na ustalenie przy-nale¿noci gatunkowej dwóch szcze-pów (tab. 2). W tej sytuacji jako kry-terium rozstrzygaj¹ce wykorzystano metodê PCR-REA (16). Powa¿n¹ trudnoæ w przypadku grzybów z ro-dzaju Malassezia stanowi budowa ich ciany komórkowej; zarówno gru-boæ, jak i sk³ad chemiczny tej war-stwy uniemo¿liwia zastosowanie standardowych metod ekstrakcji ge-nomowego DNA, ze wzglêdu na ich nisk¹ wydajnoæ i brak powtarzalno-ci (12). Zastosowana w obecnej pra-cy w³asna metodyka (20), oparta na mechanicznej dezintegracji komórek grzyba, jest szybka i stosunkowo prosta w wykonaniu oraz charaktery-zuje siê wysok¹ wydajnoci¹ i powta-rzalnoci¹ uzyskiwania DNA. Wpro-wadzenie techniki PCR-REA (restric-tion endonuclease analysis) z wyko-rzystaniem równoczenie trzech re-gionów: ITS, LSU rRNA oraz regio-nu Bt koduj¹cego b-tubulinê pozwa-la na wysoce specyficzn¹ kpozwa-lasyfika- klasyfika-cjê grzybów (16). Ryciny 1, 2, 3, 4, 5 ilustruj¹ kolejne etapy identyfikacji, a tab. 2 przedstawia kody genotypów szczepów badanych oraz referencyj-nych.
Uzyskane wyniki wskazuj¹, ¿e za-stosowana technika pozwala na szyb-kie i wysoce specyficzne ró¿nicowa-nie gatunkowe w obrêbie rodzaju Ma-lassezia. Dotychczas stosowana do tego celu kariotypizacja (4, 7), cha-rakteryzuj¹ca siê równie wysok¹ swo-istoci¹, wymaga 60 do 72 godzin na analizê protoplastu, podczas gdy PCR-REA jedynie oko³o 15 godzin (16). Przynale¿noæ gatunkowa lipi-dozale¿nych izolatów klinicznych od psów i kotów okrelona metod¹ PCR--REA by³a zgodna z identyfikacj¹ fe-notypow¹ w zakresie szczepów zali-czanych do M. globosa i M. sympo-dialis (tab. 2). Szczep okrelony jako M. furfur oraz dwa izolaty nieziden-tyfikowane wykazywa³y cechy geno-typowe charakterystyczne dla M. pa-chydermatis (tab. 2).
Wystêpowanie lipidozale¿nych gatunków Malasse-zia, a przede wszystkim M. sympodialis i M. globosa,
opisali równie¿ inni autorzy u zdrowych klinicznie kotów i psów. Znacznie rzadziej stwierdzano ich obec-noæ u osobników chorych, g³ównie kotów (4, 9, 10).
Ryc. 1. Amplifikacja regionu ITS Malassezia spp.
Objanienia: A szczepy nr 60, 61, 112, 110P, 110L, 115, 139, 143; B szczepy nr 122P, 122L, 107, 108, 109
Ryc. 2. Analiza restrykcyjna enzymem EcoRI produktu PCR Malassezia spp. Objanienia: C szczepy nr 115, 139, 143; D szczepy nr 110P, 110L, 112, 60, 61; E szczepy nr 122P, 122L, 107, 108, 109
Ryc. 3. Analiza restrykcyjna enzymem NcoI produktu PCR Malassezia spp. Objanienia: F szczepy nr 115, 139, 143; G szczepy nr 110P, 110L, 112, 60, 61; H szczepy nr 122P, 122L, 107, 108, 109
Ryc. 4. Analiza restrykcyjna enzymem Ava881produktu PCR Malassezia spp. Objanienia: I szczepy nr 122P, 122L, 107, 108, 109; K szczepy nr 60, 61, 112, 110P, 110L, 115, 139, 143
Medycyna Wet. 2006, 62 (8) 916
Ryc. 5. Amplifikacja regionu Bt Malassezia spp.
Objanienia: L szczep nr 122P, 122L, 107, 108, 115; M szczep nr 60, 61, 112, 109, 110P, 110L, 139, 143
W ostatnich latach wyizolowano w jednym przypadku lipidozale¿ny szczep Malassezia od psa z objawa-mi otitis externa, przy czym gatunek izolatu nie zosta³ okrelony (19). Obecne badania wskazuj¹, ¿e lipido-zale¿ne szczepy Malassezia mog¹ byæ izolowane zarówno od kotów (7/25), jak i psów (3/115) z objawami otitis externa. Malassezia globosa, jako czynnik etiologiczny infekcji, wystê-powa³a u jednego psa i trzech kotów, a Malassezia sympodialis u dwóch psów i trzech kotów (tab. 2).
Na uwagê zas³uguje identyfikacja wybitnie lipofil-nych szczepów M. pachydermatis, które pomimo kilkakrotnych pasa¿y in vitro, nie adaptowa³y siê do wzrostu na pod³o¿ach bez lipidów. Przemawiaæ to mo¿e za du¿¹ zmiennoci¹ w obrêbie tego gatunku, którego cech¹ ró¿nicuj¹c¹, jak dot¹d, by³a lipidonie-zale¿noæ (5, 15). Reasumuj¹c, nale¿y stwierdziæ, ¿e wobec przypadków izolacji lipidozale¿nych gatunków Malassezia od chorych psów i kotów, co stanowiæ mo¿e bezporednie zagro¿enie zdrowia ludzi, nale¿y zwróciæ uwagê na diagnostykê laboratoryjn¹ tych grzy-bów, uwzglêdniaj¹c, z jednej strony, stosowanie pod-³o¿y z dodatkiem lipidów, z drugiej za cechy feno-typowe i genofeno-typowe poszczególnych szczepów.
Pimiennictwo
1.Aspiroz C., Ara M., Varea M., Rezusta A., Rubio C.: Isolation of Malassezia globosa and Malassezia sympodialis from patients with pityriasis versicolor in Spain. Mycopathologia 2001, 154, 111-117.
2.Belkum A., Boekhout T., Bosboon R.: Monitoring spreed of Malassezia infections in a neonatal intensive care unit by PCR-mediated genetic typic. J. Clin. Microbiol. 1994, 32, 2528-2538.
3.Boekhout T., Kamp M., Gueho E.: Molecular typing of Malassezia species with PFGE and RAPD. Med. Mycol. 1998, 36, 365-372.
4.Bond R., Anthony R. M., Dodd M., Lloyd D. H.: Isolation of Malassezia sym-podialis from feline skin. J. Med. Vet. Mycol. 1996, 34, 145-147. 5.Bond R., Anthony R. M.: Characterization of markedly lipid-dependent
Malassezia pachydermatis isolates from healthy dogs. J. Appl. Bacteriol. 1995, 78, 537-542.
6.Bond R., Curtis C. F., Ferguson E. A., Mason J. S., Rest J.: An idiopathic facial dermatitis of Persian cats. Vet. Dermatol. 2000, 11, 35-41.
7.Bond R., Howell S. A., Haywood P. J., Lloyd D. H.: Isolation of Malassezia sympodialis and M. globosa from healthy pet cats. Vet. Rec. 1997, 141, 200--201.
8.Crespo M. J., Abarca M. J., Cabanes F. J.: Occurence of Malassezia spp. In horses and domestic ruminants. Mycoses 2002, 45, 333-337.
9.Crespo M. J., Abarca M. L., Cabanes F. J.: Isolation of Malassezia furfur from a cat. J. Clin. Microbiol. 1999, 37, 1573-1574.
10.Crespo M. J., Abarca M. L., Cabanes F. J.: Otitis externa associated with Malassezia sympodialis in two cats. J. Clin. Microbiol. 2000, 38, 1263-1266. 11.Crespo M. J., Abarca M. L., Cabanes F. J.: Atypical lipid-dependent Malas-sezia species isolated from dogs with otitis externa. J. Clin. Microbiol. 2000, 38, 2383-2385.
12.Ekman S.: PCR optimization and troubleshooting with special reference to the amplification of ribosomal DNA in lichenized fungi. Lichenologist 1999, 31, 517-531.
13.Gueho E., Boeghout T., Ashbee H. R., Guillot J., Van Belkum A., Faerge-mann J.: The role of Malassezia species in the ecology of human skin and as pathogens. Med. Mycology. 1998, 36, 220-229.
14.Guillot J., Bond R.: Malassezia pachydermatis: a review. Med. Mycol. 1999, 37, 295-306.
15.Guillot J., Gueho E., Lesourd M., Midgley G., Chevrier G., Dupont B.: Iden-tification of Malassezia species: A practical approach. J. Mycol. Med. 1996, 6, 133-110.
16.Gupta A. K., Kohli Y., Summerbell R. C.: Molecular differentiation of seven Malassezia species. J. Clin. Microbiol. 2000, 38, 1869-1875.
17.Mayser P., Haze P., Papavassilis C., Mickel M., Gruender K., Gueho E.: Differentiation of Malassezia species: selectivity of Cremophor EL, castor oil and ricinoleic acid for Malassezia furfur. Br. J. Dermatol. 1997, 137, 208--213.
18.Mirhendi H., Makimura K., Zomorodian K., Yamada T., Sugita T., Yama-guchi H.: A simple PCR-RFLP method for identification and differentiation of 11 Malassezia species. J. Microbiol. Methods 2005, 61, 281-284. 19.Mickelsen P. A., Viano-Paulson M. C., Stevens D. A., Diaz P. S.: Clinical and
microbiological features of infection with Malassezia pachydermatis in high--risk infant. J. Inf. Dis. 1988, 6, 1163-1168.
20.Nowakiewicz A.: Wspó³czesne metody ró¿nicowania diagnostycznego szcze-pów z rodzaju Malassezia izolowanych z przypadków klinicznych. Rozpra-wa dokt. Wydz. Medycyny Weterynaryjnej, AR Lublin 2005.
21.Wo³oszyn S., Winiarczyk S.: Rola grzybów z rodzaju Pityrosporum w patoge-nezie schorzeñ skórnych. Medycyna Wet. 1986, 42, 131-135.
Adres autora: dr hab. Gra¿yna Zió³kowska prof. nadzw. AR, ul. Akade-micka 12, 20-033 Lublin; e-mail: g-ziolkowska@go2.pl
