Widok Cętki jądrowe jako modelowe ciałka jądrowe. Cętki jądrowe w układzie nerwowym.

Numer 1 (326)

Strony 17–35

znakowania, inne z kolei, dzięki charaktery-stycznej strukturze, mają swoje odpowied-niki na poziomie ultrastrukturalnym w mi-kroskopii elektronowej. Wyjątkowe jest tutaj właśnie jąderko, które dzięki dużej gęstości widoczne jest zarówno w zwykłym mikrosko-pie świetlnym, jak i elektronowym. Do tej pory opisano kilkanaście typów ciałek jądro-wych. Nie wszystkie mają ustalone nazwy w języku polskim. Do ważniejszych należą: wspomniane już jąderko będące miejscem syntezy rRNA i niektórych etapów składa-nia rybosomów, ciałka Cajala zaangażowane w pewne etapy modyfikacji i wewnątrzją-drowy transport małych jąwewnątrzją-drowych rybonu-kleoprotein (snRNPs) oraz małych jąderko-wych rybonukleoprotein (snoRNPs)(Morris 2008, Machyna i współaut. 2013), ciałka PML uczestniczące w odpowiedzi na czyn-niki stresowe, regulację stabilności genomu, naprawę DNA poprzez sekwestrację, modyfi-kowanie i degradację białkowych partnerów (Lallemand-Breitenbach i de The 2010), ciałka Polycomb będące wielobiałkowym kompleksem, który u Drosophila zaangażo-wany jest w represję genów homeotycznych, a u ssaków w regulację ekspresji genów Hox (Pirrotta i Li 2012), „cleavage bodies” zawierające kilka czynników uczestniczących w cięciu i poliadenylacji końca 3’ mRNA (Li i współaut. 2006), jądrowe ciałka stresowe (ang. nuclear stress bodies) uczestniczące w regulacji i przeprogramowaniu transkryp-cji w warunkach stresowych (Biamonti i Vourc’h 2010), „paraspeckles” biorące udział w regulacji ekspresji niektórych genów przez

WSTĘP: ARCHITEKTURA JĄDRA KOMÓRKOWEGO

Jądra komórkowe pierwszy zaobserwował Antoni van Leeuwenhoek pod koniec XVII w. Od momentu kiedy ten holenderski przyrod-nik zamieścił o nich wzmiankę w jednym z listów do Towarzystwa Królewskiego w Lon-dynie (Leeuwenhoek 1682), minęło prawie trzy stulecia nim zrozumiano jaką pełnią funkcję. Przechowywanie i kopiowanie infor-macji zawartej w materiale genetycznym oraz kontrolowanie prawie wszystkich funkcji ko-mórki przez regulację ekspresji tej informa-cji, możliwe jest dzięki złożonym molekular-nym procesom powiązamolekular-nym z przestrzenną strukturą jądra. Dzięki rozwojowi technik obrazowania mikroskopowego oraz technik biochemicznych poznano zróżnicowanie bu-dowy wewnętrznej jądra na poziomie struk-turalnym i procesów w nim zachodzących na poziomie molekularnym. Jądro komórko-we bowiem, choć pozbawione komórko-wewnętrznych przedziałów błonowych, nie jest organellą o jednorodnej organizacji. Elementy struktu-ralne jądra to chromatyna, czyli kompleks DNA i białek histonowych, oraz położone w przestrzeni międzychromatynowej, znacznie mniejsze struktury, zwane ciałkami jądro-wymi (ang. nuclear bodies) lub domenami jądrowymi (ang. nuclear domains). Są one kompleksami białek lub białek i niekodują-cego RNA (Brasch i Ochs 1992). Najbardziej wyrazistym i najwcześniej zauważonym, jest jąderko (Wagner 1835). Niektóre ciałka ją-drowe widoczne są tylko w mikroskopii flu-orescencyjnej po zastosowaniu specyficznego

a

a

s

Pracownia Neuromorfologii Molekularnej i Systemowej Pracownia Mikroskopii Elektronowej

Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN Pasteura 3, 02-093 Warszawa

E-mail: a.szczepankiewicz@nencki.edu.pl

CĘTKI JĄDROWE JAKO MODELOWE CIAŁKA JĄDROWE. CĘTKI JĄDROWE

W UKŁADZIE NERWOWYM

Słowa kluczowe: ciałka jądrowe, cętki, dojrzewanie mRNA, jądro komórkowe, metabolizm mRNA, składanie mRNA,

po wyznakowaniu materiału surowicą po-chodzącą od pacjentów chorych na choroby autoimmunologiczne: zespół Sjögrena i to-czeń rumieniowaty układowy (Beck 1961). Kilka lat później antygen odpowiedzialny za powstanie takiego wzoru barwienia został nazwany antygenem Sm, od nazwiska pa-cjentki Stephanie Smith, chorej na toczeń rumieniowaty układowy, u której również zostały wykryte przeciwciała przeciwjądrowe (Tan 1967, Tan i Kunkel 1966). Produkcja tego typu przeciwciał jest charakterystycz-ną cechą chorób autoimmunologicznych, co bywa wykorzystywane w ich diagnostyce (Kumar i współaut. 2009). Jednak dopiero w 1979 r. potwierdzono, że antygen Sm jest częścią kompleksu cząstek snRNP (Lerner i Steitz 1979). Na początku lat 80. poja-wiły się pierwsze prace lokalizujące snRNP na poziomie ultrastrukturalnym, z wykorzy-staniem specyficznych przeciwciał (metoda immunogold) w IGC (Spector i współaut. 1983, Fakan i współaut. 1984, Puvion i współaut. 1984). Od tego momentu stało się oczywistym, że speckles i skupiska ziaren interchromatynowych to te same struktury, choć jeszcze przez wiele lat autorzy niechęt-nie stawiali obie nazwy obok siebie. Jednak, tak naprawdę, pierwszy opisał speckles już w 1910 r. Santiago Ramón y Cajal, hisz-pański neurobiolog, laureat Nagrody Nobla z 1906 r., odkrywca wspomnianych wcześniej ciałek Cajala. Ramón y Cajal wykazał w ją-drze komórkowym neuronów obecność nie-regularnych struktur, które nie barwią się kwaśną aniliną i pozostają jaśniejsze w sto-sunku do otoczenia, stąd użyta przez Ramo-na y Cajala Ramo-nazwa grumos hialinos („prze-retencję pewnych rodzajów RNA (Fox i

La-mond 2010, Nakagawa i Hirose 2012) oraz „nuclear speckles” uważane za miejsce prze-chowywania i modyfikacji czynników skła-dania mRNA: małych jądrowych rybonukle-oprotein (snRNP), białek SR i innych białek metabolizmu RNA. Ta kompartmentalizacja przestrzeni jądra, tworzona przez ciałka ją-drowe, umożliwia odpowiednią koncentrację makrocząstek, prowadzącą do podwyższenia częstości koniecznych odziaływań między nimi w jednym miejscu i/lub obniżenia nie-pożądanych w innym (Galganski i współaut. 2017). Ułatwia również sprawniejszą kontro-lę ich retencji lub uwalniania do nukleopla-zmy (Handwerger i Gall 2006).

CĘTKI JĄDROWE: NAZEWNICTWO I POCZĄTKI BADAŃ

Obecnie w literaturze anglojęzycznej sto-suje się równolegle kilka terminów na okre-ślenie cętek jądrowych. Najczęściej spoty-kany termin angielski „nuclear speckles” (nie mający oficjalnego odpowiednika w ję-zyku polskim, a znaczący mniej więcej tyle co plamki lub cętki jądrowe), używany jest głównie w kontekście obrazowania w mikro-skopii immunofluorescencyjnej. „Interchro-matin granule clusters” (IGCs) stosowany jest w badaniach mikroskopii elektronowej (Spector i Lamond 2011). Ten ostatni ter-min spotykany w literaturze polskojęzycznej, np. w pierwszej polskiej pracy przeglądowej dotyczącej tych struktur (Zborek 1987), tłu-maczony jest jako skupiska ziaren interchro-matynowych. Ponadto, w pracach prezentu-jących wyniki immnofluorescencjne spotyka się, lecz znacznie rzadziej, inne, dodatkowe terminy: „splicing speckles”, „SC35 domains” oraz „splicing factor compartments” (Gal-ganski i współaut. 2017). To różne nazew-nictwo w dwóch różnych typach mikroskopii wynika z niezależnego opisania tych struk-tur. W 1959 r. Hewson Swift zaobserwo-wał w mikroskopie elektronowym ziarnisto-ści, które w nukleoplazmie tworzą skupiska („chmury”) i nazwał je ziarnami interchroma-tynowymi. Równocześnie stwierdził, że zawie-rają one RNA (Swift 1959). Następnie opisa-li je Nicole Granboulan i Wilhelm Bernhard (Granboulan i Bernhard 1961). Opracowana przez Bernharda metoda regresywnego bar-wienia z użyciem EDTA, pozwalająca zacho-wać wysoki kontrast rybonukleoprotein przy wyblakłej chromatynie sugerowała, że ziarna interchoromatynowe zawierają jakiś rodzaj rybonukleoprotein (Monneron i Bernhard 1969). Natomiast termin „speckles” został po raz pierwszy użyty przez J. Swensona Bec-ka, który w 1961 r. opisał w hepatocytach szczurzych cętkowaty wzór barwienia jądra,

Ryc. 1. „Prześwitujące skupiska” (hiszp. grumos hialinos) czyli cętki w komórkach piramidalnych kory mózgowej królika.

Oryginalny rysunek wykonany przez Romóna y Cajala. A: cętki (a) oraz jąderko (b) uwidocznione metodą z wy-korzystaniem azotanu srebra po utrwaleniu w formalinie i moczniku. B: Negatywne barwienie cętek (a) i jąderka (b) azotanem srebra po utrwaleniu w formalinie i kwa-sie octowym. Pozytywnie barwią się “ziarna neutrofilów” (hiszp. granos netrófilos) (c). Reprodukowane z cajal

włókienkami. Jedno takie skupisko odpo-wiada jednej „cętce” w mikroskopii świetlnej (Ryc. 3) (Galganski i współaut. 2017, Spec-tor i Lamond 2011, Hall i współaut. 2006). Ze względu na charakterystyczną strukturę, IGC/cętki mogą być obserwowane bez uży-cia przeciwuży-ciał, choć korzystne jest zastoso-wanie technik zwiększających ich kontrast względem innych składników jądra, np. bar-wienie bizmutem, zastosowane po raz pierw-szy przez Lockea i Huiea (1977), lub zmniej-szających kontrast heterochromatyny, jak wspominana wcześniej technika regresywne-go barwienia EDTA (Bernhard 1969).

Większość prac badających cętki do-tyczy komórek ssaczych, jednak podobne struktury obserwowano w oocytach płazów, gdzie nazywane są snurposomami B (Gall i współaut. 1999) i w embrionach Drosophi-la meDrosophi-lanogaster (Segalat i Lepesant 1992), lecz nie u drożdży (Potashkin i współaut. 1990). Cętki występują także w jądrach ko-mórek roślinnych i były badane m.in. u Ara-bidopsis thaliana (Fang i współaut. 2004), Allium cepa i Lupinus luteus (Niedojadlo i współaut. 2012).

BIAŁKOWE SKŁADNIKI CĘTEK JĄDROWYCH

Metodami immunolokalizacji oraz spek-trometrią mas izolowanych frakcji IGC/cętek świtujące skupiska”) (Cajal 1910). Użycie

przez tego badacza opracowanej przez siebie wcześniej metody barwienia azotanem sre-bra, pozwoliło selektywnie wyznakować opi-sane struktury (Ryc. 1). Późniejsza adapta-cja tej metody do mikroskopii elektronowej potwierdziła, że obserwowane przez Ramona y Cajala struktury są ekwiwalentem skupisk ziaren interchromatynowych, a tym samym speckles obserwowanych w mikroskopii im-munofluorescencyjnej (Lafarga i współaut. 2009). Ani J. Swenson Beck, ani tym bar-dziej Hewson Swift nie wiedzieli, że przed-stawiają struktury opisane wcześniej przez Ramóna y Cajala. Uważanie Ramóna y Ca-jala za odkrywcę nuclear speckles jest obec-nie powszechne, choć gdy sięgnąć do orygi-nalnego tekstu, Cajal wspomina, że struktu-ry te były obserwowane także przez innych autorów (nie podaje przez kogo), choć nie poświęcono im większej uwagi (Cajal 1910).

Mimo tylu lat opisywania w literaturze naukowej, struktury te nie doczekały się jeszcze polskiej nazwy, gdy chodzi o bada-nia immunofluorescencyjne. Wspombada-niana, jedyna praca przeglądowa w języku polskim z 1987 r., odnosi się jedynie do badań w mikroskopii elektronowej i posługuje się terminem „ziarnistości interchromatynowe” (Zborek 1987). Termin „domeny SC35” jest wygodny, lecz dość nieścisły, gdyż struktu-ry te zawierają wiele innych białek. Z kolei nazwa „kompartmenty czynników składania mRNA” (ang. splicing factor compartments) wydaje się zbyt długa i niezgrabna. Istnie-je więc potrzeba utworzenia odpowiedniej polskiej nazwy. Dlatego, w niniejszej pracy, proponuję termin „cętki jądrowe”, będący właściwie dosłownym tłumaczeniem angiel-skiego terminu nuclear speckles, i taki ter-min będzie używany w poniższym tekście. Analogicznie w przypadku paraspeckles uży-wany będzie termin „paracętki”. W miejscu, w którym będą omawiane wyniki prac mi-kroskopii elektronowej zostanie użyty termin IGC/cętki.

ORGANIZACJA I LOKALIZACJA CĘTEK JĄDROWYCH

Cętki obserwowane w mikroskopie flu-orescencyjnym mają kształt mniej lub bar-dziej regularnych plamek o średnicy 0,5-3 µm, położonych w przestrzeni miedzychro-matynowej (Ryc. 2). W jednym jądrze może być ich zwykle od 10 do 50, gdzie zajmują 5-10% objętości nukleoplazmy.

W mikroskopii elektronowej, jak już wspomniałem, odpowiednikiem cętek są skupiska ziaren interchromatynowych (IGC). Tworzą je 20-25 nanometrowej średnicy elektronowo gęste ziarna połączone cienkimi

Ryc. 2. Cętki w mikroskopii fluorescencyjnej, w neuronach hodowli pierwotnej pochodzenia hipo-kampalnego (kolor czerwony).

Na niebiesko wybarwiono specyficzne dla neuronów białko MAP2, wykorzystywane jako ich znacznik. Na szaro wyznakowano DNA. Znacznik skali 6 μm. Z ba-dań własnych autora.

Ryc. 3. Skupiska ziaren interchromatynowych tj. cętek w mikroskopii elektronowej w komórkach ner-wowych hipokampalnej hodowli organotypowej.

A: mikrofotografia elektronowa fragmentu jądra komórki nerwowej. H – heterochromatyna, IGC – skupiska ziaren interchromatynowych (ang. interchromatin granule clusters), OJ – otoczka jądrowa, Jd – jąderko. Znacznik skali 1 μm. B: jedno z IGC z Ryc. 3A w większym powiększeniu. Znacznik skali 330 nm. Kontrast IGC wzmocniony so-lami bizmutu. Z badań własnych autora.

nia. Jednak funkcje białek SR nie ograni-czają się tylko do kontrolowania składania mRNA. Białka te maja swój udział także w poprzedzającej składanie transkrypcji, a tak-że w eksporcie mRNA do cytoplazmy oraz w translacji (Long i Caceres 2009). Dwa naj-lepiej poznane białka tego typu obecne w cętkach to SF2/ASF (ang. splicing factor 2/ alternative splicing factor) i SC35 (ang. spli-ceosomal component 35), według nowszej nomenklatury, próbującej ujednolicić na-zewnictwo w tej grupie białek, nazywane są odpowiednio: SRSF1 i SRSF2 (ang. serine/ arginine-rich splicing factor). Białko SC35 (SRSF2) jest powszechnie uznawanym (ale nie jednym) znacznikiem cętek w różnych technikach obrazowania.

Cętki jądrowe zawierają niektóre z tzw. białek podobnych do białek SR (ang. SR--like lub SR-related protein). Są to białka, które także pełnią funkcje czynników skła-dania pre-mRNA lub uczestniczą w innych procesach metabolizmu mRNA, ale mają pewne odmienne cechy budowy, np. brak u nich domeny RRM (Long i Caceres 2009). W cętkach zlokalizowano także kilka kinaz i fosfataz, które fosforylują lub defosforylują czynniki uczestniczące w składaniu RNA, np. specyficzne dla jąder: CLK1 (ang. CDC-like kinase 1), PRP4K (ang. serine/threonine-pro-tein kinase PRP4 homolog) oraz obecne również w PSK-H1 (ang. protein serine ki-nase H1), SRPK1 (ang. SRSF protein kiki-nase 1) (Colwill i współaut. 1996, Ko i współaut. 2001, Brede i współaut. 2002, Dellaire i współaut. 2002) i fosfatazę PP1 (ang. protein phosphatase-1) (Trinkle-Mulcahy 1999).

Ponadto wykazano w cętkach obecność wielu białek związanych z innymi etapami metabolizmu mRNA, w tym z samą krypcją. Oprócz kilku czynników trans-krypcyjnych (FBI-1, Skip, Tho2), ciałka te zawierają dużą podjednostkę polimerazy RNAII (Bregman i współaut. 1995, Morti-llaro 1996, Xie i współaut. 2006), a tak-że inne podjednostki jej kompleksu (Saitoh i współaut. 2004). Ponadto w cętkach zna-leziono: czynniki dojrzewania końca 3’ RNA jak PABPN1 (Krause i współaut. 1994) oraz polimerazę PAP (Schul i współaut. 1998), białka uczestniczące w metylacji reszt A mRNA w pozycji N6, tj. METTL14 i METTL3 (Ping i współaut. 2014), białka zaangażowa-ne w transport mRNA do cytoplazmy: Aly/ REF i NXF1 (Zhou i współaut. 2000), biał-ka uczestniczące w procesie NMD (ang. non-sense-mediated mRNA decay), tj. degradacji wadliwych mRNA niosących przedwczesny kodon stop jak Magoh i Y14. Dwie ostat-nie grupy białek są częścią EJC (ang. exon junction complex), białkowego kompleksu formującego się na mRNA podczas skła-ustalono względnie dokładnie skład

białko-wy tych ciałek w hepatocytach. Podstawo-wym ich składnikiem są dwie grupy czyn-ników uczestniczących w składaniu (splicin-gu) mRNA: małe jądrowe rybonukleoprote-iny (ang. small nuclear rybonucleoprotein,

snRNP) oraz białka SR (ang. serine-arginine rich proteins). Jako pierwsze w cętkach opi-sane zostały czynniki snRNP (por. rozdział „Cętki jądrowe: nazewnictwo i początki ba-dań”). Czynniki te wchodzą w skład splice-osomu, czyli wieloskładnikowego kompleksu białkowo-rybonukleoproteinowego, usuwają-cego introny podczas składania mRNA. Każ-da cząstka snRNP jest kompleksem skła-dającym się z snRNA, czyli niskocząstecz-kowego RNA charakteryzującego się wysoką zawartością grup urydylowych, wspólnego zestawu siedmiu tzw. białek rdzeniowych zwanych kompleksem Sm (B/B’, D3, D2, D1, E, F oraz G) oraz białek unikatowych dla poszczególnych cząstek. Występują czte-ry podstawowe rodzaje snRNP: U1, U2, U4/ U6 i U5 snRNP. Wszystkie rybonukleoprote-iny snRNP oraz wszystkie białka Sm, a tak-że wiele spośród białek unikatowych są wy-krywane w obrębie cętek jądrowych (Nyman i współaut. 1986, Saitoh i współaut. 2004). W ich biogenezie, jak już nadmieniono wy-żej, uczestniczą ciałka Cajala (Kiss 2004).

Drugą ważną grupą białek obecną w cęt-kach są białka SR. Jest to rodzina białek bogata w serynowo-argininowe powtórzenia, stąd nazwa (S to skrót aminokwasu seryny, R argininy). Białka SR na końcu aminowym mają jedną lub dwie domeny wiążące RNA: RRM (ang. RNA recognition motif) oraz nie-co odmienną domenę homologiczną RRMH (ang. RRM homolog), natomiast na końcu karboksylowym różnej długości domenę RS z wielokrotnymi dwupeptydowymi powtórzenia-mi arginina-seryna. Domena ta, podlegająca fosforylacji na resztach seryny, odpowiedzial-na jest za interakcje z innymi białkami, w tym z transportyną-SR przenoszącą białka SR przez pory jądrowe. Znanych jest siedem klasycznych białek SR oraz kilkanaście do-datkowych, szczegółowo przedstawionych w kilku pracach przeglądowych (Long i Cace-res 2009, Shepard i Hertel 2009, Twyffels i współaut. 2011). Wszystkie klasyczne oraz spora część dodatkowych wykrywana jest w cętkach hepatocytów (Saitoh i współaut. 2004). Za lokalizacje białek SR w cętkach odpowiada domena RS (Caceres i współaut. 1997). Białka SR pełnią funkcję czynników regulatorowych w konstytutywnym i alter-natywnym składaniu mRNA: rozpoznają re-gulatorowe sekwencje wzmacniające ESEs (ang. exonic splicing enhancers) i wiążą się z nimi, przez co promują rekrutację kom-ponentów spliceosomu w miejsca

składa-dące być może zanieczyszczeniem frakcji. Ry-cina 4 prezentuje funkcje tych 146 zidenty-fikowanych białek: 81% z nich powiązanych jest z metabolizmem pre-mRNA/mRNA i w dużej części pokrywa się z białkami znajdo-wanymi w spliceosomach (Saitoh i współaut. 2004). Najnowsza praca przeglądowa podaje listę 457 znanych białek obecnych w cęt-kach (Galganski i współaut. 2017).

RNA W CĘTKACH JĄDROWYCH

Prócz białek, cętki jądrowe zawierają dwa typy RNA: poli(A)+ _{RNA (Carter i współaut.} 1991) oraz MALAT1 (ang. metastasis asso-ciated lung adenocarcinoma transcript 1), nazywany też NEAT2 (ang. nuclear-enriched abundant transcript 2), należący do gru-py długich niekodujących RNA (lncRNAs, ang. long non-coding RNAs) (Hutchinson i współaut. 2007). Przez wiele lat kwestią dyskusyjną było czy obecne w cętkach po-li(A)+ _{RNA reprezentuje nowopowstałe mRNA} (jako, że fragment poli(A)+ _{RNA jest} dodawa-ny do końca 3’ w procesie jego dojrzewania), czy też jest odrębną populacją niekodujące-go RNA. Niektóre prace pokazują, że poli(A)+ RNA pozostaje w cętkach po zablokowaniu transkrypcji, pomimo że mRNA jest w tym czasie transportowane do cytoplazmy. Na tej podstawie wnioskowano, że cętki zawiera-ją stabilną populację poli(A)+ _{RNA która być} może pełni jakieś funkcje regulatorowe w ją-drze (Huang i współaut. 1994).

MALAT1 o długości około 7500 par zasad posiada krótki fragment podobny do poli(A), wchodzący w skład konserwatywnej potrój-nej helisy stabilizującej transkrypt. MALAT1 ulega silnej nadekspresji w pewnych typach nowotworów (Ji i współaut. 2003). Doświad-czenia na liniach komórkowych wykazały, że MALAT1 oddziałuje z kilkoma białkami SR (m.in. SRSF1, SRSF2 i SRSF3) i jest po-trzebny do ich lokalizacji w cętkach (Tripa-thi i współaut. 2010), a także z innymi biał-kami cętek: RNPS1, SRm160 oraz IBP160, od których z kolei zależy lokalizacja MALAT1 w cętkach (Miyagawa i współaut. 2012). W hodowlach mysich neuronów hipokampal-nych, MALAT1 moduluje synaptogenezę po-przez regulację ekspresji genów (Bernard i współaut. 2010). Jądra komórek niektórych linii nowotworowych po deplecji MALAT1 zawierają zwiększony poziom defosforylowa-nych białek SR, które jednocześnie wykazują bardziej homogenną dystrybucję w nukle-oplazmie (Tripathi i współaut. 2010). Jednak badania in vivo, na myszach pozbawianych genu Malat1 wykazały, że transkrypt MA-LAT1 nie jest konieczny w ich pre- i postna-talnym rozwoju. Myszy te posiadają typowe cętki jądrowe, a brak MALAT1 nie wpływa dania, mającego wpływ na

potranskrypcyj-ną regulację jego losów (Le Hir i współaut. 2001, Schmidt i współaut. 2006).

W cętkach stwierdzono również obec-ność wielu rodzajów białek z grupy hnRNP (ang. heterogeneous nuclear ribonucleopro-teins, heterogenne jądrowe RNP) (Saitoh i współaut. 2004). Jest to duża rodzina białek wiążących RNA. Białka te (wraz z czynnika-mi opisanyczynnika-mi wcześniej) uczestniczą w regu-lacji transkrypcji, alternatywnym składaniu mRNA, odpowiadają za stabilizację mRNA i jego transport (Geuens i współaut. 2016). Jednocześnie, w cętkach wykazano obec-ność białek cytoszkieletu: aktyny (Nakayasu i Ueda 1984, Belin i współaut. 2013), profi-liny (Skare i współaut. 2003) i laminy A/C (Jagatheesan 1999).

Niektóre białka obecne w cętkach wystę-pują również w innych ciałkach. snRNAP są składane w ciałkach Cajala zanim trafią do cętek (Mao i współaut. 2011b). Charaktery-styczne białka paracętek: PSF i PSP2, wystę-pują również w cętkach (Saitoh i współaut. 2004), a Pat1b w cętkach i ciałkach PML (Marnef i współaut. 2012).

Proteomiczna analiza jądrowej frakcji bo-gatej w cętki, izolowanej z hepatocytów, o której wspominałem na początku tego roz-działu, wykazała występowanie w cętkach 360 białek, w tym 146 (41%), które okre-ślono jako „zidentyfikowane” białka IGC. Za-liczono tutaj białka najczęściej się pojawia-jące, o wcześniej potwierdzonej lokalizacji w cętkach i o funkcji zbliżonej do funkcji do-brze scharakteryzowanych białek cętek. Po-zostałe stanowiły „potencjalne” białka IGC, a także białka, które określono jako „nowi kandydaci” oraz białka „nieoczekiwane”, bę-Ryc. 4. Klasyfikacja funkcji molekularnych białek obecnych w cętkach jądrowych.

IGC/cętki izolowane z mysich hepatocytów. Wykres spo-rządzono na podstawie 146 białek zidentyfikowanych przy wykorzystaniu spektometrii mas przez saitoh i współaut. (2004).

szone w innym roztworze. Ich powstawanie ma być oparte na zjawisku separacji faz w układzie dwu cieczy (ang. liquid-liquid pha-se pha-separation, LLPS). LLPS jest procepha-sem, w którym roztwory spontanicznie rozdzielają się na niezmieszane fazy zawieszone jedna w drugiej. W przypadku ciałek obecnych w komórkach, jedną ciecz stanowi cytoplazma lub nukleoplazma, a drugą skoncentrowana „zawiesina” białek lub białek i RNA. Rozdzie-lanie się jest wynikiem wielowartościowych (wielopunktowych), przejściowych odziały-wań białko-białko i białko-RNA. Biorą w nich udział specyficzne domeny białek uła-twiających czy wręcz promujących agregację tzw. domeny inherentnie nieuporządkowane (ang. intrinsically disordered regions), będą-ce rejonami pozbawionymi struktury trzecio-rzędowej, a więc nieulegające zwijaniu i nie przyjmujące form globularnych, najczęściej w wyniku braku hydrofobowych aminokwa-sów. Rodzajem tych domen są low-comple-xity regions, czyli regiony o niskiej złożono-ści, które w białkach obecnych w cętkach i innych ciałkach, występują wyjątkowo czę-sto. Są to rejony, które zawierają nadrepre-zentację jakiegoś konkretnego zestawu ami-nokwasów w strukturze pierwszorzędowej. Taką definicję niewątpliwe spełniają białka SR z domeną RRM oraz RS i tak też zostały one sklasyfikowane (van der Lee i współaut. 2014). Kiedy lokalne stężenie tego typu bia-łek lub biabia-łek i specyficznego RNA osiągnie odpowiedni próg, zainicjowane zostaje gro-madzenie się tych molekuł (zgodnie z fizyko--chemią zjawiska LLPS) w większe struktu-ry, tworzące ciałka. Zjawisko LLPS, w kon-tekście organelli pozbawionych błony jądro-wej, zostało wyczerpująco opisane w kilku pracach przeglądowych (Hyman i współaut. 2014, Courchaine i współaut. 2016, Sawyer i współaut. 2019).

„Płynne” cętki są strukturami dynamicz-nymi, ich rozmiar, kształt i liczba mogą się zmieniać w zależności od typu komórki, cy-klu komórkowego, poziomu ekspresji genów czy nasilenia procesu składania mRNA, a ich składniki są w ciągłym ruchu (Phair i Misteli 2000). Małe cętki mogą ulegać fuzji z większymi (Zhang i współaut. 2016). Ana-liza ruchu cętek w komórkach CHO (ang. Chinese hamster ovary cell, komórki jajni-ka chomijajni-ka chińskiego) pojajni-kazuje, że po za-blokowaniu transkrypcji wzrasta mobilność cętek: przemieszają się jedne w kierunku drugich na dystansie do 4 µm i z prędko-ścią 0,2-1,5 μm/min, co kończy się ich po-łączeniem. Trzy lub cztery cętki mogą poru-szać się tą samą ścieżką, a na tej ścieżce mogą powstawać nowe cętki podążające za poprzednimi. Ruchy te są niezależne od ak-tyny i odbywają się „kanałami” wolnymi od na wzór jądrowej lokalizacji białek SRSF1 i

SRSF2, poziom fosforylacji białek SR, pro-liferację komórek, apoptozę, ogólny poziom transkrypcji czy tempo składania mRNA. Je-dynym obserwowanym efektem jest zmiana poziomu ekspresji kilku genów położonych w pobliżu Malat1, w tym genu Neat1, którego transkrypt jest składnikiem paracętek. O ile jednak niektórzy badacze obserwują zwięk-szoną ekspresję transkryptu Neat1 w korze mózgowej i wątrobie myszy z wyciszonym genem Malat1 (Zhang i współaut. 2012), inni zauważają zmniejszona jego ekspresję w nabłonku jelita i fibroblastach (Nakagawa i współaut. 2012).

Białka i RNA w cętkach nie są rozmiesz-czone homogennie, ale tworzą dwie warstwy: środek cętek zajmowany jest częściej przez białka, a MALAT1 i niektóre rybonukleopro-teiny występują bardziej na zewnątrz (Fei i współaut. 2017). Granice pomiędzy tymi warstwami nie są jednak ostre i w struk-turze obserwowanej w mikroskopii elektro-nowej to zróżnicowanie nie jest widoczne (Ryc. 3).

FOSFOLIPIDY INOZYTOLOWE W CĘTKACH JĄDROWYCH

Pochodne fosfoinozytydów (PI), będące czynnikami sygnałowymi wielu cytoplazma-tycznych szlaków, obecne są także w jądrze komórkowym, gdzie uczestniczą w proce-sach regulacji modyfikacji chromatyny, doj-rzewania mRNA i jego eksporcie. Boronen-kov i współaut. (1998) wykazali obecność w cętkach jądrowych fosfatydyloinozytolów bisfosforanu (PIP2) oraz dwu kinaz: fosfaty-dylo-4-fosforanu 5 typu I i typu II odpowie-dzialnych za ich metabolizm. Obecnie zna-nych jest ponad 20 białek uczestniczących w sygnalizacji z udziałem PI, których obec-ność stwierdza się w cętkach (Galganski i współaut. 2017). Przykładem może być „nie-kanoniczna” polimeraza Star-PAP (ang. spec-kle targeted PIP5K1α-regulated poly(A) po-lymerase), przeprowadzająca poliadenylację końca 3’ specyficznego zbioru pre-mRNA w sposób zależny od PI (Mellman i współaut. 2008). Te i inne okoliczności zawarte w pra-cy przeglądowej Galganskiego i współaut. (2017) dowodzą zdaniem autorów, że cętki są jądrowym centrum wytwarzania i trans-dukcji sygnału z udziałem PI.

FORMOWANIE SIĘ CĘTEK I MOBILNOŚĆ ICH SKŁADNIKÓW

Obecnie uważa się, że jądrowe i cytopla-zmatyczne ciałka pozbawione błon oddziela-jących je od otoczenia, swym zachowaniem i strukturą przypominają krople płynu

zawie-towano wyżej, kilka kinaz, które mogą brać udział w tych procesach, zlokalizowano w cętkach. Nadekspresja kinazy CLK1 lub do-danie kinazy SRPK1 do permeabilizowanych komórek skutkuje ucieczką czynników skła-dania mRNA z cętek i zwiększeniem ich nu-kleplazmatycznej puli. Dotyczy to nie tylko białek SR fosforylowanych przez tę kinazę, ale także innych białkowych składników cę-tek nie posiadających domeny RS (np. kom-ponentów U2 snRNP, pininy, aktyny i lami-ny A), a nawet populacji poli(A)+ _{RNA (Gui} i współaut. 1994, Sacco-Bubulya i Spector 2002). Nie tylko fosforylacja, ale także me-tylacja, koniugacja z PI (Okada i współaut. 2008) czy z SUMO-1 (Chen i współaut. 2004) są modyfikacjami potranslacyjnymi, które regulują napływ czynników do cętek.

CĘTKI JĄDROWE W CYKLU KOMÓRKOWYM I ICH BIOGENEZA

Po wejściu komórki w mitozę i rozpa-dzie otoczki jądrowej, białka cętek ulega-ją rozproszeniu w cytoplazmie. W metafazie białka te zaczynają gromadzić się i tworzyć struktury nazwane mitotic interchroma-tin granules (MIGs), istniejące do telofazy i będące mitotycznym odpowiednikiem IGC/ cętek (Ferreira i współaut. 1994, Reuter i współaut. 1985, Leser i współaut. 1989). W anafazie i wczesnej telofazie wzrasta wiel-kość i liczba MIGs, a podczas odbudowy otoczki jądrowej w środkowej i późnej telo-fazie czynniki składania mRNA zgromadzone w cytoplazmatycznych MIGs zaczynają wni-kać do tworzących się jąder siostrzanych. Różne komponenty MIGs są uwalniane w różnym czasie: białko ASF/SF2 i większość innych czynników opuszcza MIGs właśnie w telofazie, zaś białko SC35 i forma elon-gacyjna polimerazy II RNA fosforylowana na Ser-2 (także obecna w cętkach), pozostają w nich do początku fazy G1 (forma inicjacyj-na, fosforylowana na Ser-5, pojawia się w jądrach siostrzanych jako pierwsza, jeszcze przed czynnikami składania mRNA) (Pras-anth i współaut. 2003). Zanim jednak wni-kające białka SR utworzą cętki, przez 15-20 min przejściowo przebywają wokół trans-krypcyjnie aktywnych organizatorów jąderka (ang. nucleolar organizing regions, NORs), gdzie tworzą zagęszczony obszar nazwany przez odkrywców zjawiska NAPs (ang. NOR--associated patches) (Bubulya i współaut. 2004). Z kolei snRNPs lokalizują się w bie-gunowych rejonach jąder siostrzanych razem z koiliną p80, charakterystycznym białkiem ciałek Cajala. Białka SR w NAPS-ach są hi-perfosforylowane. W strukturach tych obec-na jest także kiobec-naza CLK1, a zablokowanie transkrypcji powoduje, że białka SR zostają chromatyny, a bogatymi w składniki obecne

w cętkach. Podobne przemieszczanie się ca-łych cętek, autorzy obserwują po zastosowa-niu szoku cieplnego, metali ciężkich i pod-czas później fazy G2 i wczesnej profazy (Kim i współaut. 2019). Te ostatnie badania po-twierdzają starsze obserwacje pokazujące, że zablokowanie transkrypcji w wyniku użycia specyficznych inhibitorów, np. α-amanityny (Huang i współaut. 1994), lub w wyniku szoku cieplnego (Spector i współaut. 1991), powoduje akumulację czynników składania mRNA w cętkach, co z kolei prowadzi do ich powiększania się i przyjmowania bardziej zaokrąglonych i wyraźniejszych granic. Po-dobny efekt obserwowano po zablokowaniu składania pre-mRNA, w następstwie mikro-iniekcji oligonukleotydów blokujących nie-które U snRNA (O’Keefe i współaut. 1994) oraz przy użyciu inhibitora spliceostatyny A. Powiększone cętki zawierają nie tylko zwięk-szoną liczbę czynników uczestniczących w składaniu mRNA, ale również poli(A)+ _RNA oraz białko PABPN1 (Kaida i współaut. 2007, Hett i West 2014). Kiedy wzrasta ekspresja genów, a więc także rośnie poziom składa-nia mRNA, czynniki składaskłada-nia zgromadzone w cętkach są uwalniane, zaś cętki przyjmu-ją bardziej nieregularne kształty o słabiej zarysowanych granicach. Zjawisko takie ob-serwowano po indukcji określonych genów (Huang i Spector 1991), jak i grup genów w wyniku wywołanej infekcji wirusowej (Bridge 1995).

Ruch czynników składania mRNA z i do cętek był badany przy zastosowaniu rożnych technik fluorescencyjnych. Wykorzystując białko fuzyjne GFP-SF2/ASF obserwowano redystrybucję czynników składania z sąsied-nich cętek do miejsc transkrypcji aktywowa-nych genów, gdzie ma miejsce kotranskryp-cyjne składanie mRNA (Misteli i współaut. 1997). Z kolei użycie techniki FRAP (ang. fluorescence recovery after photobleaching) pokazało, że całkowite przywrócenie flu-orescencji po fotoblaknięciu w przypadku białka GFP-AF2/ASF następuje po 30 se-kundach, a połowiczne jest mniejsze niż 5 sekund. Maksymalny czas przebywania biał-ka GFP-SF2/ASF w cętbiał-kach to około 50 sekund. Choć tempo wymiany składników cętek jest szybkie, rozmiar cętek podczas interfazy pozostaje względnie stały (Phair i Misteli 2000).

Regulacja wymiany białkowych składni-ków cętek następuje w głównej mierze na drodze fosforylacji i defosforylacji. Fosforyla-cja domeny RS jest konieczna do uwolnie-nia białek SR z cętek i ich przemieszczeuwolnie-nia do miejsc transkrypcji i składania mRNA (Misteli 1998) oraz formowania spliceoso-mu (Mermoud i współaut. 1994). Jak

odno-nie powiązanych genów może umiejscawiać się przy tej samej cętce, np. geny α-globiny (HBA) i β-globiny (HBB) (Brown i współaut. 2006) czy α-globiny i białka prążka 3 błony erytrocytów (SLC4A1) podczas erytropoezy (w tym drugim przypadku obie kopie oby-dwu genów jednocześnie, Ryc. 5) (Brown i współaut. 2008).

Rozpad cętek w wyniku nadekspresji ki-nazy CLK2 fosforylującej białka SR, skutku-je znaczącym zmniejszeniem częstości wy-stępowania dwu genów (wiążących się z tą sama cętką) w bliskim sąsiedztwie, co suge-ruje, że obecność cętek promuje przestrzen-ną asocjację genów (Rieder i współaut. 2014). DNA nie jest w cętkach wykrywal-ne (Thiry 1995), wykazano jednak, że cęt-ki w mysich spermatydach zawierają histon H2A.B.3, powiązany z silnie rozluźnioną chromatyną, a także obie formy polimera-zy RNA II (fosforylowanej na Ser2 i Ser5), a modyfikacje chromatyny związane z jej aktywnością (H4K20me1 i H3K36me3) wy-stępują na obrzeżach lub we wnętrzu cętek (Soboleva i współaut. 2017). Regiony chro-mosomów bogate w geny (prążki R) odnaj-dywane są w pobliżu cętek częściej niż re-giony ubogie w geny (prążki G) (Shopland i współaut. 2003). Umiejscawianie się genów przy cętkach nie jest jednak zjawiskiem ma-sowym i obligatoryjnym, gdyż nie wszyst-kie geny, nawet te które podlegają inten-sywnym procesom transkrypcji i składania, lokalizują się przy lub w cętkach (Smith i współaut. 1999a). Dotyczy to raczej specy-ficznych genów, w specyspecy-ficznych warunkach fizjologicznych. To ostatnie stwierdzenie na-dal pozostaje aktualne, jednak w ostatnim czasie pojawiają się prace mogące mu za-przeczyć. Wielkoskalowe badania z wyko-rzystaniem techniki SPRITE (ang. split-pool recognition of interactions by tag extension), dające wgląd w przestrzenną organizację ge-nomu dowodzą, że rejony bogate w często transkrybowane geny i w modyfikacje chro-matyny związane z aktywnością transkryp-cyjną, nazwane przez autorów active hub, lokalizują się w pobliżu cętek (Quinodoz i współaut. 2018). Autorzy tej pracy konklu-dują, że lokalizacja DNA blisko cętek może zwiększać wydajność potranskrypcyjnej ob-róbki mRNA w wyniku dużej koncentracji czynników składania i metabolizmu mRNA. Z kolei metodą TSA-Seq, wykorzystującą cy-tochemiczną metodę barwienia (amplifikację sygnału tyramidu) do mierzenia względnej odległości DNA do znakowanych struktur w jądrze, zidentyfikowano około 5% geno-mu, które z prawdopodobieństwem bliskim 100% lokalizuje się w odległości <0,32 µm od granicy cętek. Te rejony chromosomowe zostały określone przez autorów jako SPADs zatrzymane w NAPs-ach na dłużej. Oznacza

to najprawdopodobniej, że fosforylacja uwal-nia białka SR z NAPS-ów, zaś pierwszym miejscem docelowym, dokąd one zmierza-ją i formuzmierza-ją pierwsze cętki, są miejsca ak-tywne transkrypcyjnie (Bubulya i współaut. 2004). Ponieważ zainicjowanie transkrypcji w telofazie poprzedza uformowanie się cę-tek, sugeruje się, że nabór czynników skła-dania RNA do nowopowstałych transkryptów zapoczątkowuje zarodkowanie nowych cętek w pobliżu miejsc aktywnych transkrypcyjnie. Tezę tą wspiera fakt, że transkrypty mRNA w postaci eksperymentalnie wprowadzonych do jądra konstruktów, mogą wywołać zarod-kowanie cętek de novo (Shevtsov i Dundr 2011).

FUNKCJE CĘTEK JĄDROWYCH; CĘTKI A GENY

Początkowo cętki uznawano jedynie za miejsce magazynowania i modyfikacji czyn-ników składania mRNA, z których są te czynniki wysyłane do miejsc, gdzie odby-wa się transkrypcja i składania jej produk-tów. Za taką bierną rolą cętek przemawia fakt, że na ich terenie nie jest wykrywalna transkrypcja metodami inkorporacji znako-wanych nukleotydów (Puvion i Puvion-Du-tilleul 1996, Iborra i współaut. 1998, Cmarko 1999). Praca Cmarko (1999) su-geruje także, że nowopowstałe pre-mRNA obecne jest nie w obszarze cętek, ale we włóknach perychromatynowych, struktu-rach sąsiadujących z cętkami, obserwowa-nymi w mikroskopie elektronowym. Jednak liczne późniejsze prace wskazują, że cętki mogą wiązać się z loci określonych aktyw-nych genów. W ludzkich fibroblastach, na obrzeżach cętek, pojawiają się geny kola-genu Iα1 (COL1A1) i β-aktyny (ACTB), a we wnętrzu cętek transkrypty, tj. mRNA tych genów (Xing i współaut. 1995). Umiej-scawianiu się (asocjacji) z cętkami ulegają także aktywne geny: białek szoku cieplne-go hsp90α i hsp70 ludzkich fibroblastów (Jolly i współaut. 1999), czynnika trans-krypcyjnego E2F4 (EF2F4) i laminy A/C otoczki jądrowej (LMNA) (Smith i współaut. 1999a), białka proteolipidowego (lipofiliny, PLP) w różnicujących się oligodendrocytach (Nielsen i współaut. 2002), łańcucha cięż-kiego miozyny (MyHC) i miogeniny (Myf-4) ludzkich mioblastów (Moen Jr i współaut. 2004), receptora γ aktywowanego przez proliferatory peroksysomów (PPARG), czyn-nika transkrypcyjnego SREBF1 oraz biał-ka wiążącego kwasy tłuszczowe (FABP4) w różnicujących się adipocytach (Szczerbal i Bridger 2010). Wykazano także, że zestaw kilku jednocześnie aktywnych i

funkcjonal-Kilka innych badań wskazuje, że mRNA wielu genów przechodzi przez cętki (Smith i współaut. 1999b, Melcak i współaut. 2000, Hattinger i współaut. 2002, Shopland i współaut. 2002). Znane są także prace świadczące o tym, że w cętkach mogą mieć miejsce niektóre etapy dojrzewania mRNA. Używając konstruktów CMV-DNA i śledząc los ich transkryptów w komórkach HeLa po-kazano, że pre-mRNA zawierające funkcjo-nalne miejsca składania mRNA, odkładane jest w cętkach, podczas gdy transkrypty nie posiadające funkcjonalnych miejsc składania mRNA, są równomiernie rozproszone w nu-kleoplazmie. Metodą FISH z wykorzystaniem sond wykrywających składanie RNA wykaza-no, że proces ten może zachodzić w cętkach (Dias i współaut. 2010). W cętkach wykry-to fosforylowaną formę czynnika SF3b155, obecną tylko w katalitycznie aktywnych spli-ceosomach. Zahamowanie składania mRNA (w wyniku wyciszenia czynnika CDC5L) w komórkach HeLa powoduje akumulację P--SF3b155, tj. spliceosomów, wraz ze składa-nym mRNA w cętkach, a złagodzenie bloka-dy (w wyniku ekspresji GFP-CDC5L lub mi-kroiniekcji hPrp19/CDC5L) uwalnia zgroma-dzone RNA i uruchamia jego eksport (Girard (ang. speckle-associated domains) (Chen i

współaut. 2018).

Obecność specyficznego mRNA w cętkach może mieć związek nie z samą transkrypcją, a z dojrzewaniem mRNA i/lub transportem dojrzałych transkryptów do cytoplazmy. W przypadku genu COL1A1 zaobserwowano, że jego transkrypty podlegają składaniu w po-bliżu miejsca transkrypcji, na krawędziach cętek, następnie, bardziej dojrzałe, akumu-lują się w przyległych cętkach, po czym są transportowane do cytoplazmy. Z kolei mRNA genu COL1A1, które uległo błędnemu złożeniu (co ma miejsce we wrodzonej łamli-wości kości typu 1 i jest związane z muta-cją w tym genie) jest w cętkach zatrzymywa-ne (Johnson 2000). Podobnie, zablokowanie składania mRNA spliceostatyną A, meajamy-cyną lub pladienolidyną B powoduje odkła-danie się transkryptów β-globiny i β-aktyny w cętkach komórek mięsaka kościopochod-nego linii U2OS. Są to transkrypty zawie-rające introny, a więc takie, które nie ule-gły składaniu (Carvalho i współaut. 2017). Śledząc w żywych komórkach U2OS mRNA zawierające poli(A)+ _{zaobserwowano, że przed} eksportem do cytoplazmy przechodzi ono przez cętki (Molenaar i współaut. 2004).

Ryc. 5. Asocjacja aktywnych genów z cętkami. Immuno-FISH dla genów HBA (zielony) i SLC4A1 (czer-wony) oraz białka SC35 obecnego w cętkach (niebieski) w erytroblastach podczas erytropoezy.

CĘTKI JĄDROWE W KOMÓRKACH NERWOWYCH

Jak już wspomniałem, obecność cętek w jądrach komórkowych została po raz pierw-szy pokazana właśnie w komórkach nerwo-wych przez Santiago Romóna y Cajala. Cajal również, jako pierwszy scharakteryzował pod względem morfologii i cech cytochemicznych te struktury. Zauważył mianowicie, że w neuronach piramidalnych kory mózgowej i w motoneuronach rdzenia kręgowego występują okrągłe, rzadziej kanciaste twory, które nie wybarwiają się pod wpływem działania kwa-śnej aniliny, barwią się srebrem koloidalnym słabiej niż jąderko i ciałka Cajala, natomiast przy zastosowaniu azotanu srebra przybiera-ją barwę żółtą, pomarańczową lub czerwoną. W neuronach piramidalnych kory mózgowej kota, psa i królika liczbę cętek określił na 6 do 7, przy średnicy 0,8-1,5 µm. Z kolei w ludzkich neuronach kory, ich liczbę osza-cował na 6 do 10 (nie podając wielkości). Zauważył również, że w większych motoneu-ronach psa i kota, cętki także są większe, osiągając 2-3 µm średnicy (nie podając licz-by) (Cajal 1910).

Przez długi okres rozwoju wiedzy na temat budowy i znaczenia ciałek jądro-wych, pomijano badania organizacji cętek w komórkach nerwowych. Dopiero później-sze badania Miguela Lafargi i jego grupy zmieniły ten stan rzeczy. Badacze ci (Pena i współaut. 2001) analizowali cętki w neu-ronach czuciowych zwoju trójdzielnego (łac. ganglion trigeminale) szczurów. W zwoju tym scharakteryzowali trzy typy neuronów róż-niące się wielkością i rozmieszczeniem orga-nelli: duże neurony o średnicy ciała 40-75 µm (typ A), średnie o średnicy 20-50 µm (typ B) oraz małe o średnicy poniżej 20 µm (typ C). Autorzy wiązali wielkość neuronów z nasileniem aktywności transkrypcyjnej za-kładając, że im większy rozmiar komórki, tym większe tempo transkrypcji. Zaobserwo-wali również korelację pomiędzy wielkością neuronów a liczbą jąderek, ciałek Cajala oraz wielkością i rozproszeniem IGC/cętek. Stwierdzili, że duże neurony (wysoka aktyw-ność transkrypcyjna) posiadają jedno jąder-ko, zazwyczaj trzy ciałka Cajala oraz małe IGC/cętki i czynniki składania rozproszone w nukleoplazmie, średnie neurony mają dwa jąderka, jedno ciałko Cajala oraz kilka du-żych IGC/cętek, zaś małe neurony – dwa lub trzy jąderka, jedno ciałko Cajala oraz największe IGC/cętki. IGC w neuronach czuciowych zwoju trójdzielnego, podobnie jak w innych komórkach tworzą 20-25 nanome-trowej średnicy ziarna w różnym stopniu za-gregowania.

i współaut. 2012). W komórkach gruczo-lakoraka nabłonka płuc, mRNA M1 wirusa grypy jest odkładane w cętkach gospodarza, gdzie podlega składaniu. Zaburzanie składa-nia w wyniku deplecji białek cętek NS1-BP lub SON powoduje silną akumulację mRNA w cętkach. Taki sam efekt wywołuje deple-cja białek Aly/REF i UAP56, które są nie-zbędne do eksportu mRNA M1 i M2 wirusa do cytoplazmy (Mor i współaut. 2016). Cętki zawierają niewielki, stabilny zasób polimera-zy RNA II fosforylowanej na Ser2 C-końco-wej domeny, która chociaż jest transkrypcyj-nie transkrypcyj-nieaktywna (co transkrypcyj-nie wyklucza transkryp-cji na obrzeżach cętek), może odgrywać rolę w montażu spliceosomów i składaniu mRNA (Xie i współaut. 2006), wykazano bowiem wcześniej, że ufosforylowana forma polimera-zy II promuje taki montaż (Zeng i Berget 2000) i jest wymagana do zajścia składania (Hirose i współaut. 1999).

Obecność transkryptów niektórych ge-nów w cętkach może być związana z samym tylko eksportem do cytoplazmy. Wykazano, że w komórkach HeLa, mRNA dla JUND, HSPA1A, RHOB i ZXDB, których geny nie zawierają intronów, przed eksportem do cy-toplazmy lokalizuje się w cętkach. Wejście tych transkryptów do cętek jest niezależne od transkrypcji czy obecności ogona poli-(A) i jest promowane przez sekwencje ESE i białka SR z nimi się wiążące. Obecność transkryptów w cętkach wzmacnia proces ich transportu do cytoplazmy w wyniku uła-twiania naboru czynników kompleksu TREX (Wang i współaut. 2018).

Wymienione badania były prowadzone w komórkach transformowanych i/lub proli-ferujących. Dane te, jak również fakt, że w cętkach obecne są czynniki biorące udział w eksporcie mRNA do cytoplazmy oraz w procesie NMD wskazują, że w cętkach może mieć miejsce jeden z punktów „kontroli ja-kości” mRNA. O ile więc zasadnicza trans-krypcja i składanie ma miejsce w nukle-oplazmie, to pewne specyficzne geny ulęgają ekspresji w bliskim przestrzennym związku z cętkami. Cętki mogą funkcjonować więc jako subjądrowe domeny, na peryferiach których zachodzi transkrypcja i kotranskrypcyjne składanie, a w ich wnętrzu potranskrypcyj-na przejściowa akumulacja bardziej dojrzałe-go mRNA, prawdopodobnie w celu kontroli i dalszego dojrzewania przed eksportem do cy-toplazmy (Hall i współaut. 2006).

Biorąc pod uwagę powyższe wyniki, Hall i współaut. (2006) zaproponowali rolę cętek, jako ośrodka przestrzennie łączącego trans-krypcję specyficznego mRNA oraz składania i eksportu do cytoplazmy niektórych wyso-ce aktywnych genów w wyso-celu ułatwienia ich efektywnej ekspresji.

CĘTKI JĄDROWE W STANACH CHOROBOWYCH

Istnieje niewielka grupa zaburzeń, w przebiegu których udział cętek jądrowych może mieć znaczenie. Należą do niej nie-które z chorób spowodowanych tzw. powtó-rzeniami trójnukleotydów (ang. trinucleotide repeat expansion disorders, TREDs), rodza-jem mutacji dynamicznych. Powtórzenia trój-nukleotydów występują naturalnie w geno-mie, zarówno w rejonach kodujących, jak i niekodujących. Nieprawidłowa i nadmiarowa liczba powtórzeń sekwencji trójek (kodonów) nukleotydów prowadzi do powstania błędnie uformowanego białka zyskującego toksyczne właściwości, transkryptu (mRNA) o toksycz-nych właściwościach lub po prostu utraty funkcji przez transkrypt lub białko (Krzyzo-siak i współaut. 2012).

Jedną z takich chorób jest oczno-gardło-wa dystrofia mięśniooczno-gardło-wa (ang. oculopharyn-geal muscular dystrophy, OPMD). Przyczyną OPMD jest mutacja w genie PABPN1 polega-jąca na pojawieniu się dodatkowych powtó-rzeń GCG, tj. kodonu alaniny, wydłużają-cych trakt polialaninowy z 10 do 12-17 po-wtórzeń aminokwasów (Robinson i współaut. 2006). W OPMD nieprawidłowe PABPN1 two-rzy w miocytach wewnątrzjądrowe agregaty, które lokalizują się przy granicy cętek. Agre-gaty te zawierają także kilka innych białek oraz poly(A) RNA. W takich komórkach ilość białka PABPN1 w cętkach, gdzie ono nor-malnie występuje, jest znacznie zmniejszona. W ludzkich mioblastach transfekowanych GFP-PABPN1-17ala (konstrukt naśladują-cy skutki mutacji w OPMD) agregaty białka PABPN1 także powstają na obrzeżach cętek, zawierają przy tym poly(A) RNA, a ich two-rzeniu i zwiększaniu się towarzyszy zmniej-szanie się ilości PABPN1 i poly(A) RNA w cętkach (Bengoechea i współaut. 2012). Zdaniem autorów cętki zapewniają optymal-ne środowisko do agregacji nieprawidłowego białka: są miejscem w jądrze, gdzie koncen-tracja PABPN1 i poly(A) RNA jest najwyż-sza (prawdopodobnie tworzą się kompleksy PABPN1/poly(A) RNA), co zwiększa stopień i specyficzność oddziaływań potrzebnych do oligomeryzacji. W dyskusji pracy grupy ro-binsona i współaut. (2006) pojawia się także teza, że specyficzna lokalizacja agregatów na peryferiach cętek może być związana z orga-nizacją genomu wokół cętek. Jak się wyda-je, cętki są formowane w bezpośredniej bli-skości pewnych genów, w lokalizacji zapew-niającej odpowiednią koncentrację czynni-ków składania, dostępnych nowopowstałym transkryptom (Hall i współaut. 2006, Rino i Carmo-Fonseca 2009). Biorąc to pod uwagę, prace te sugerują, że transkrypty mRNA ak-Navascues i współaut. (2004) zauważyli

zmianę organizacji IGC/cętek w neuronach zwoju trójdzielnego typu A, w odpowiedzi na uszkodzenie zakończeń aksonalnych wywo-łany miejscowym podaniem 4% formaliny: zwiększenie wymiarów cętek w połączeniu z intensywniejszym znakowaniem U2 snRNP B’’, co następowało trzy dni po wywołaniu uszkodzenia. Zmiany ustępowały po około 7. dniach od uszkodzenia. Autorzy wiążą te zmiany z mniejszym nasileniem transkrypcji w neuronach z uszkodzonymi zakończenia-mi, a w konsekwencji zmniejszonym nabo-rem czynników składania do miejsc składa-nia pre-mRNA oraz zwiększoną ilością czyn-ników przechowywanych w cętkach. Znaku-jąc miejsca transkrypcyjne poprzez inkor-poracje 5-FU do nowopowstającego mRNA wykazano, że w tym modelu centrum cętek nie zawiera miejsc aktywnych transkryp-cyjnie. Obecność takich miejsc stwierdzo-no za to na obrzeżach IGC/cętek (Casafont i współaut. 2006). Wydaje się więc, że w neuronach IGC/cętki pod względem morfo-logii, ultrastruktury i ich zmian w reakcji na stopień nasilenia transkrypcji nie różnią się znacząco od IGC/cętek w innych komór-kach.

W linii komórkowej neuronów ludzkich pochodzenia nowotworowego (neuroblastoma SH-SY5Y) wykazano, że po zadziałaniu na komórki szokiem cieplnym, białka HSPA1A i HSPA6 gromadzą się przy cętkach. Dodat-kowo HSPA6 tworzy kuliste skupienia przy cętkach i pozostaje z nimi zasocjowane po zakończeniu szoku cieplnego. W poprzed-nim rozdziale opisałem doniesienia dotyczą-ce aktywnych genów asocjujących z cętka-mi, w tym przedstawiam relację o białkach nie będących składnikami cętek i ich prze-strzennej lokalizacji na obrzeżach tych cia-łek. Oba zjawiska są zapewne z sobą powią-zane. Białka szoku cieplnego to tzw. białka opiekuńcze. Jedną z ich funkcji jest zabez-pieczanie innych białek przed niekorzystnym wpływem czynników stresowych (np. przed denaturacją spowodowaną wysoką tempe-raturą). Wiadomo również, że szok cieplny powoduje zahamowanie transkrypcji (Velic-hko i współaut. 2013). Shorbagi i Brown (2016) sugerują, że gromadzenie się białek szoku cieplnego na obrzeżach cętek, a więc w miejscach, gdzie odbywa się transkrypcja niektórych genów, może mieć związek z ist-nieniem mechanizmu zapewniającego szybki powrót transkrypcji do stanu sprzed jej ha-mowania spowodowanym zadziałaniem czyn-nika stresowego. Brak jest danych literatu-rowych, czy w innych komórkach, w tym w typowych neuronach, zjawisko czasowego gromadzenia się białek szoku cieplnego przy cętkach ma również miejsce.

niskowzgórzowego (ang. dentatorubral-palli-doluysian atrophy, DRPLA, choroba Naito--Oyanagi), zmutowane mRNA (różnych bia-łek, w zależności od choroby) jest depono-wane i zatrzymydepono-wane nie przy, ale wewnątrz cętek. Zmutowane transkrypty kolokalizują z wspomnianym w poprzednim akapicie biał-kiem MBNL1, lecz w znacznie mniejszym stopniu niż w przypadku DM1. Autorzy tłumaczą ten fakt krótszym zmutowanym traktem CAG i mniejszym powinowactwem wiązania MBNL1 do powtórzeń CAG niż do CUG. Mniejszy stopień „zajęcia” powtórzeń CAG przez MBNL1, tłumaczy z kolei dla-czego wchodzą one do cętek i tam dopiero są blokowane, a w przypadku mięśniowego mRNA, DMPK1 jest zatrzymywane już na obrzeżach cętek (Urbanek i współaut. 2016). W zespole drżenia i ataksji związanych z łamliwym chromosomem X (ang. fragi-le X-associated tremor/ataxia syndrome, FXTAS), obserwuje się ekspansję powtórzeń CGG w 5’-UTR genu FMR1. Gen ten koduje białko FMRP (ang. fragile X mental retarda-tion protein), wiążące RNA i zaangażowane w różne etapy jego metabolizmu, szczególnie w neuronach (D’Annessa i współaut. 2019). Zmutowane sekwencje CGG również prowa-dzą do agregacji nieprawidłowych transkryp-tów w cętkach (Sellier i współaut. 2010).

Odkładanie się nieprawidłowego mRNA w cętkach występuję nie tylko w chorobach TRED: we wrodzonej łamliwości kości typu 1 (ang. osteogenesis imperfecta type 1, OI 1), defekt w przebiegu składania genu kola-genu 1α1 (COL1A1) prowadzi do akumulacji zmutowanego RNA tego genu w cętkach fi-broblastów (Johnson 2000).

Jak można zauważyć, we wszystkich wy-mienianych jednostkach chorobowych powta-rza się ten sam schemat, w którym niepra-widłowe mRNA tworzy złogi/wtręty/agregaty w cętkach lub na ich obrzeżach. Ta obser-wacja wspiera hipotezę, że w przypadku ekspresji niektórych genów, cętki mogą być specyficznym punktem kontrolnym popraw-ności złożenia i nieobecpopraw-ności mutacji pre--mRNA (Molenaar i współaut. 2004, Smith i współaut. 2007).

PODZIĘKOWANIA

Serdecznie dziękuję prof. dr hab. Grze-gorzowi Wilczyńskiemu (IBD PAN) za cen-ne wskazówki oraz prof. dr hab. Andrzejowi Wróblowi za krytyczne uwagi do artykułu.

S t r e s z c z e n i e

Jądro komórkowe oprócz heterochromatyny czyli kompleksu DNA i białek histonowych, zawiera struktury zwane ciałkami jądrowymi (ang. nuclear bodies). Są to niewielkie, zazwyczaj koliste twory „zawieszone” w nu-kleoplazmie, składające się z białek lub białek i nieko-dującego RNA. Znanych jest kilkanaście rodzajów takich tywnych genów położonych w pobliżu cętek

inicjują nukleację agregatów w OPMD. Na potwierdzenie tej tezy przytacza się badania pokazujące, że specyficzne transkrypty RNA mogą służyć jako rusztowanie rekrutujące białka oddziałujące z RNA w celu zbudo-wania takich struktur jądrowych jak cętki, paracętki, histone locus bodies czy jądrowe ciałka stresowe (Shevtsov i Dundr 2011, Mao i współaut. 2011a). Jednym z patolo-gicznych skutków obecności agregatów w miocytach może być zaburzenie alternatyw-nego składania troponiny T typu 3 (TNNT3) (a wiec białka specyficznego dla miocytów): agregaty PABPN1 są zdolne „uwięzić” pre--mRNA TNNT3 tak, że jest ono niedostęp-ne dla SC35, które, jak równocześnie wy-kazano, jest czynnikiem odpowiedzialnym za alternatywne składanie TNNT3 (Klein i współaut. 2016).

Udział cętek jądrowych jest także obser-wowany w dystrofii miotonicznej typu I (ang. myotonic dystrophy type 1, łac. dystrophia myotonica 1, DM1), powodowanej mutacją w genie DMPK (ang. dystrophia myotonica protein kinase). Jest to gen kodujący sery-nowo-treoninową kinazę niezbędną w rozwo-ju miocytów. Wspomniana mutacja skutkuje ekspansją trójnukleotydu CUG w sekwencji 3’UTR. W normalnych mioblastach aktywny gen DMPK lokalizuje się przy granicy cętek, a jego produkt, mRNA DMPK, jest okreso-wo deponowane w cętkach. Tam najpraw-dopodobniej białka uczestniczące w składa-niu są wymieniane na białka uczestniczące w transporcie mRNA do porów jądrowych i dalej do cytoplazmy. W chorobie DM1 trans-port jądrowy mRNA DMKP ulega zaburze-niu: zmutowane transkrypty tego genu choć podlegają składaniu, nie wchodzą do cętek z powodu ich zmienionej struktury oraz za-burzonej interakcji z białkiem MBNL1 (ang. muscleblind-like protein 1), które jest re-gulatorem alternatywnego składania mRNA (Pascual i współaut. 2006). Na granicy cę-tek tworzą się wtedy agregaty zmutowanych transkryptów genu DMPK, białka MBNL1 i prawdopodobnie innych białek, a transport transkryptów do cytoplazmy jest zaburzony (Holt i współaut. 2007, Smith i współaut. 2007).

Nieco odmienny charakter ma lokaliza-cja agregatów RNA powstających w choro-bach ekspansji poliglutaminowych [ang. po-lyglutamine (PolyQ) diseases], gdzie mutacji dynamicznej ulegają sekwencje zawierające powtarzany trinukleotyd CAG kodujący glu-taminę. W fibroblastach będących komórko-wymi modelami pląsawicy Huntingtona (HD), ataksji móżdżkowo-rdzeniowych typu 1, 3, 7 (DSC1, DSC3, DSC7), zaniku jądra zębate-go, jądra czerwiennezębate-go, gałki bladej i jądra

kles and is modulated by chromatin environ-ment. J. Cell Biol. 182, 1083-1097.

Bubulya P. A., Prasanth K. V., Deerinck T. J.,

Gerlich D., Beaudouin J., Ellisman M. H., Ellenberg J., Spector D. L., 2004.

Hypo-phosphorylated SR splicing factors transien-tly localize around active nucleolar organizing regions in telophase daughter nuclei. J. Cell

Biol. 167, 51-63.

Caceres J. F., Misteli T., Screaton G. R., Spec

-tor D. L., Krainer A. R., 1997. Role of the

modular domains of SR proteins in subnuclear localization and alternative splicing specificity.

J. Cell Biol. 138, 225-238.

Cajal S. R., 1910. El núcleo de las células

pira-midales del cerebro humano y de algunos ma-míferos. Trab. Lab. Invest. Biol. 8, 35.

Carter K. C., Taneja K. L., Lawrence J. B., 1991. Discrete nuclear domains of poly(A)

RNA and their relationship to the functional organization of the nucleus. J. Cell Biol. 115,

1191-1202.

Carvalho T., Martins S., Rino J., Marinho S.,

Carmo-Fonseca M., 2017. Pharmacological

in-hibition of the spliceosome subunit SF3b trig-gers exon junction complex-independent non-sense-mediated decay. J. Cell Sci. 130,

1519-1531.

Casafont I., Navascues J., Pena E., Lafarga M.,

Berciano M. T., 2006. Nuclear organization

and dynamics of transcription sites in rat sen-sory ganglia neurons detected by incorporation of 5’-fluorouridine into nascent RNA.

Neuro-science 140, 453-462.

Chen W. Y., Lee W. C., Hsu N. C., Huang F.,

Chung B. C., 2004. SUMO modification of

re-pression domains modulates function of nuc-lear receptor 5A1 (steroidogenic factor-1). J.

Biol. Chem. 279, 38730-38735.

Chen Y., Zhang Y., Wang Y., Zhang L., Brinkman

E. K., Adam S. A., Goldman R., van Steensel

B., Ma J., Belmont A. S., 2018. Mapping 3D

genome organization relative to nuclear com-partments using TSA-Seq as a cytological ru-ler. J. Cell Biol. 217, 4025-4048.

Cmarko D., 1999. Ultrastructural analysis of

transcription and splicing in the cell nucleus after bromo-UTP microinjection. Mol. Biol. Cell

10, 211-223.

Colwill K., Pawson T., Andrews B., Prasad J., Manley J. L., Bell J. C., Duncan P. I., 1996.

The Clk/Sty protein kinase phosphorylates SR splicing factors and regulates their intranucle-ar distribution. EMBO J. 15, 265-275.

Courchaine E. M., Lu A., Neugebauer K. M.,

2016. Droplet organelles? EMBO J. 35, 1603-1612.

D’Annessa I., Cicconardi F., Di Marino D., 2019.

Handling FMRP and its molecular partners: Structural insights into Fragile X Syndrome.

Prog. Biophys. Mol. Biol. 141, 3-14.

Dellaire G., Makarov E. M., Cowger J. J., Longman D., Sutherland H. G., Luhrmann

R., Torchia J., Bickmore W. A., 2002.

Mam-malian PRP4 kinase copurifies and interacts with components of both the U5 snRNP and the N-CoR deacetylase complexes. Mol. Cell.

Biol. 22, 5141-5156.

Dias A. P., Dufu K., Lei H., Reed R., 2010. A

role for TREX components in the release of spliced mRNA from nuclear speckle doma-ins. Nat. Commun. 1, 97. doi: 10.1038/

ncomms1103

Fakan S., Leser G., Martin T. E., 1984.

Ultra-structural distribution of nuclear ribonucleopro-struktur. Artykuł przedstawia obecny stan wiedzy na

te-mat ciałek nazywanych w angielskiej literaturze nuclear speckles, czyli cętki jądrowe lub interchromatin granu-le clusters czyli skupiska ziaren interchromatynowych. Zaobserwowane po raz pierwszy przez Romana y Cajala w neuronach, obecne jednak we wszystkich typach ko-mórek, struktury te uważane są za magazyny i miej-sce modyfikacji czynników składania (splicingu) mRNA. Najnowsze badania, prezentowane w artykule pozwalają sądzić, że ich udział w metabolizmie RNA jest bardziej złożony. Świadczą o tym również doniesienia o roli cętek jądrowych w dziedzicznych chorobach powodowanych powtórzeniami trójnukleotydów, w tym tych o skutkach neurologicznych.

LITERATURA

Beck J. S., 1961. Variations in the morphological

patterns of “autoimmune” nuclear fluorescence.

Lancet 277, 1203-1205.

Belin B. J., Cimini B. A., Blackburn E. H., Mul

-lins R. D., 2013. Visualization of actin

fila-ments and monomers in somatic cell nuclei.

Mol. Biol. Cell 24, 982-994.

Bengoechea R., Tapia O., Casafont I., Berciano

J., Lafarga M., Berciano M. T., 2012.

Nuc-lear speckles are involved in nucNuc-lear aggrega-tion of PABPN1 and in the pathophysiology of oculopharyngeal muscular dystrophy.

Neuro-biol. Dis. 46, 118-129.

Bernard D., Prasanth K. V., Tripathi V., Colas

-se S., Nakamura T., Xuan Z., Zhang M. Q.,

Sedel F., Jourdren L., Coulpier F., Triller

A., Spector D. L., Bessis A., 2010. A long

nuclear-retained non-coding RNA regulates sy-naptogenesis by modulating gene expression.

EMBO J. 29, 3082-3093.

Bernhard W., 1969. A new staining procedure for

electron microscopical cytology. J. Ultrastruct.

Res. 27, 250-265.

Biamonti G., Vourc’h C., 2010. Nuclear Stress

Bodies. Cold Spring Harbor Perspectives in

Biology 2. doi: 10.1101/cshperspect.a000695 Boronenkov I. V., Loijens J. C., Umeda M., An

-derson R. A., 1998. Phosphoinositide

signa-ling pathways in nuclei are associated with nuclear speckles containing pre-mRNA proces-sing factors. Mol. Biol. Cell 9, 3547-3560.

Brasch K., Ochs R. L., 1992. Nuclear bodies

(NBs): a newly “rediscovered” organelle. Exp.

Cell Res. 202, 211-223.

Brede G., Solheim J., Prydz H., 2002. PSKH1,

a novel splice factor compartment-associated serine kinase. Nucleic Acids Res. 30,

5301-5309.

Bregman D. B., Du L., van der Zee S., Warren

S. L., 1995. Transcription-dependent

redistri-bution of the large subunit of RNA polymera-se II to discrete nuclear domains. J. Cell Biol.

129, 287-298.

Bridge E., 1995. Dynamic organization of splicing

factors in adenovirus-infected cells. J. Virol.

69, 281-290.

Brown J. M., Leach J., Reittie J. E., Atzberger

A., Lee-Prudhoe J., Wood W. G., Higgs D. R., Iborra F. J., Buckle V. J., 2006.

Core-gulated human globin genes are frequently in spatial proximity when active. J. Cell Biol.

172, 177-187.

Brown J. M., Green J., Neves R. P. D., Wallace

H. A. C., Smith A. J. H., Hughes J., Gray

N., Taylor S., Wood W. G., Higgs D. R.,

Iborra F. J., Buckle V. J., 2008. Association