A N N A L E S
U N I V E R S I T A T I S M A R I A E C U R I E - S K Ł O D O W S K A L U B L I N – P O L O N I A
VOL. LX1 SECTIO E 2005
1Zakład Anatomii i Cytologii Ro lin UMCS Lublin, Poland 2Instytut Genetyki Ro lin PAN Pozna , Poland
Krystyna Winiarczyk1, Artur Szozda1, Andrzej Kalinowski2, Marek Radłowski2
Wybrane aspekty zapylenia yta (Secale cereale L.)
Some aspects of rye pollination (Secale cereale L.)
ABSTRACT. The purpose of studies was biology of blooming, pollen grain morphology and results
of 2DE analysis of pollen coat and pollen protoplast proteins of self incompatible and compatible
Secale cereale lines. In the examined plants the structure of anther was typical of the Poaceae
family. In the anther Ls225 and Ls193 between pollen grains the presence of a substance similar to the leftovers of tapetum cytoplasm was observed. On the stigma of the examined rye plants, rela-tively large amounts of pollen was situated, but one could observe a kind of diversity in the degree of stigma pollination depending on the examined line. The greatest amount of pollen deposition was found on the Amilo, Kier Ls193 and Ls225 stigmas. Summing up, the research concerning pollination in selfcompatible and selfincompatible forms of S. cereale shows that the plants of both forms produce o lot of viable pollen, the pollination of the stigma is abundant but it differs in the placing of pollen grains on the surface of the stigmas and there are no significant difference in ultrastructural pictures of sporoderm of pollen grains of both forms.
KEY WORDS: pollination, compatibility, stigma, pollen, rye.
Dojrzałe ziarno pyłku od momentu uwolnienia z pylnika funkcjonuje jako samodzielny organizm, którego głównym zadaniem jest dostarczenie plemników do woreczka zal kowego. Zanim jednak do tego dojdzie, odbywaj si procesy rozpoznania – przyj cia lub odrzucenia niezgodnego pyłku. Mechanizmy te za-chodz na powierzchni znamienia, w warstwie stigmatoidalnej oraz w tkankach słupka. Je eli pyłek jest niezgodny, na powierzchni znamienia lub w tkankach
słupka zachodz procesy, które zapobiegaj ewentualnemu zapłodnieniu. Nato-miast przy zgodnym pyłku wszystkie procesy poprzedzaj ce zapłodnienie prze-biegaj prawidłowo. Na znamieniu słupka dochodzi do nagromadzenia wielu gametofitów m skich, które wzajemnie na siebie oddziałuj i ze sob rywalizuj . Współzawodnictwo gametofitów zale y od naturalnych kombinacji cech, gene-tycznej jedno ci wewn trz populacji oraz stopnia homozygotyczno ci [Lord 2000]. Zjawisko to wpływa na przepływ alleli do genomu przyszłego sporofitu, co odgrywa istotn rol w ewolucyjnym rozwoju ro lin wy szych [Knox 1984].
Zjawisko samoniezgodno ci jest definiowane przez Nettancourt [1977] jako niezdolno płodnych hermafrodytycznych ro lin nasiennych do tworzenia zygot po samozapyleniu. Szacuje si , e samoniezgodno wyst puje u ponad połowy wszystkich ro lin okrytonasiennych. Whitehouse uwa ał, e rozpowszechnienie zjawiska samoniezgodno ci pozwala wysnu wniosek, e pojawiło si ono wcze nie w ewolucji okrytonasiennych, przed powstaniem ni szych jednostek systematycznych. Natomiast według pogl dów Batemana samoniezgodno pojawiła si u ró nych gatunków niezale nie i w ró nych okresach rozwoju ewolucyjnego [Brewbaker 1959].
Samoniezgodno jest mechanizmem kontrolowanym genetycznie, funkcjo-nuj cym w e skiej tkance sporofitu, obejmuj cym reakcje rozpoznania i odrzu-cenia pyłku o okre lonym genotypie. U wi kszo ci ro lin samoniezgodno jest kontrolowana przez pojedynczy, wieloalleliczny locus S, uwa any przez wielu badaczy za najbardziej polimorficzny ro linny locus. Powszechnie przyjmuje si pogl d, e ekspresja tego samego allelu S w słupku i pyłku osadzonym na jego znamieniu prowadzi do rozpoznania pyłku jako niezgodnego i w konsekwencji staje si przyczyn odrzucenia [Jackson, Linskens 1990].
W ród ro lin opisywane s dwa ró ne mechanizmy genetycznej samonie-zgodno ci: gametofityczna i sporofityczna. Samoniesamonie-zgodno gametofityczna jest najbardziej rozpowszechniona w ród ro lin okrytonasiennych i dokładnie zbadana u przedstawicieli rodzin: Papaveraceae, Poaceae, Rosaceae,
Solanace-ae, Scrophulariaceae. U wi kszo ci wymienionych ro lin proces ten jest
kontro-lowany przez pojedynczy locus, ale mo e by kontrokontro-lowany przez 2 loci (nie-które Poaceae), a nawet 3 lub 4 loci (nie(nie-które Ranunculaceae i
Chenopodiace-ae). Zahamowanie wzrostu łagiewki pyłkowej zachodzi w wyniku interakcji
pomi dzy produktami takich samych alleli pyłku i słupka, a system niezgodno ci musi by realizowany przez białkowe produkty genu S, syntetyzowane i zlokali-zowane w cytoplazmie lub egzynie ziarna pyłku. W pylniku Brassica oleracea zidentyfikowano np. dwa współdziałaj ce białka o masie cz steczkowej 7,5– –10 kDa, wyst puj ce w pyłku oraz w tapetum i uczestnicz ce w reakcji rozpo-znania [Boyes, Nasrallah 1995].
W niniejszej pracy przebadano linie Secale cereale z genem samozgodno ci oraz samoniezgodne odmiany Amilo i Kier. Sprawdzono przebieg procesu zapy-lenia u tych form, stopie opyzapy-lenia znamion oraz morfologi pyłku. Ponadto przeanalizowano zestaw białek obecnych w protoplastach oraz na powierzchni egzyny ziaren pyłku.
METODY
Materiałem do bada były ro liny otrzymane z Zakładu Hodowli Ro lin DANKO (Laski): cztery linie samozgodne: Ls190, Ls193, Ls225, Ls250 oraz dwie samoniezgodne odmiany Amilo i Kier. Linie samozgodne były liniami wsobnymi pochodz cymi z przekrzy owania odmian samoniezgodnych z lini samozgodn S 17686 ze Stuttgartu.
Obserwacje dotycz ce zapylenia przeprowadzono w tym samym czasie dla wszystkich linii. Na badane ro liny nało one były izolatory, którymi co jaki czas potrz sano. Aby oceni stopie opylenia znamion, pobrane znamiona słup-ków obserwowano pod mikroskopem stereoskopowym. Morfologi ziaren pyłku u poszczególnych form prze ledzono w mikroskopie elektronowym skaningo-wym (SEM). Materiał wcze niej utrwalono w mieszaninie 2,5% glutaraldehydu i 2,5% paraformaldehydu w buforze fosforanowym o pH 6,8. Nast pnie materiał odwodniono w szeregu acetonowym do suchego acetonu i wysycono CO2 w
temp. 400C pod ci nieniem 70 atmosfer.
Badania ultrastruktury ciany pyłku przeprowadzono w mikroskopie elektro-nowym transmisyjnym (TEM) Tesla BS 500 po standardowym zatopieniu w
ywicy epoksydowej LR White. Metod dwukierunkowej elektroforezy (2–DE) rozdzielono białka protoplastów ziaren pyłku dwóch samoniezgodnych odmian Amilo i Kier oraz dwóch samozgodnych linii (Ls190 i Ls225). Próbk 10 mg pyłku homogenizowano w mo dzierzu agatowym z 400 l buforu ekstrakcyjne-go, a surowy ekstrakt wytrz sano z fenolem rozpuszczonym w wodzie. Białka z fazy fenolowej wytr cano 0,1 mol octanem amonu w metanolu przez 24 godz. w temperaturze -18°C. Po odwirowaniu osad suszono pod pró ni i rozpuszczano w 50 l wodnego roztworu, zawieraj cego mocznik amfolit i detergent. Procedu-r ekstProcedu-rakcji oProcedu-raz skład u ywanych Procedu-roztwoProcedu-rów podano w pProcedu-racy HuProcedu-rkmana i Ta-naki [1986].
Dwukierunkow elektroforez prowadzono według procedury podanej przez Hochstrassera i in. [1988]. W pierwszym kierunku (elektroogniskowanie białka w punkcie izoelektrycznym – IEF) białka rozdzielano w elach poliakryloami-dowych z Servalytem pH 3–10, polimeryzowanych w kapilarach o przekroju 0,8 i długo ci 150 mm. Spolimeryzowany el miał długo 140 mm, a pozbawiona
elu cz kapilary stanowiła komor na naniesienie ekstraktu białka. Po nanie-sieniu na ko cu katodowym 12 l ekstraktu białka rozdzielano przez 18 godz. przy wzrastaj cym napi ciu od 50 do 1000 V, u ywaj c zasilacza stabilizowa-nego EPS 3500 Amersham Pharmacia Biotech.
W drugim kierunku białka rozdzielano w 13% płytach poliakryloamidowych (0,9 × 150 × 150 mm) polimeryzowanych bez SDS. SDS obecny był tylko w buforze niweluj cym gradient pH w kolumienkach elu i w buforze elektrodo-wym. Kolumienki przed rozdziałami w drugim kierunku zanurzano na 2 min. w buforze niweluj cym pH. Po swobodnym uło eniu kolumienek elowych na pionowo usytuowanych płytach poliakryloamidowych białka rozdzielano przy stałym nat eniu pr du (15 mA/150 mm2). Po około 4 godz. rozdziału w temp.
pokojowej białka w elach poliakryloamidowych wybarwiano azotanem srebra według procedury podanej przez Heukeshovena i Dernicka [1985].
ele z wybarwionymi białkami skanowano (SHARP JX-330) przy u yciu programu LabScan. Obrazy po DE opracowano w programie Image Master 2-D Elite (wersja 3,1) firmy Amersham Pharmacia Biotech.
Punkty izoelektryczne i masy cz steczkowe rozdzielonych peptydów okre-lano przez ich porównanie z rozdzielonymi markerami Amersham Pharmacia Biotech „Calibration Kit” (17–0582–01) i Sigma „Silver stain SDS Molecular Weight Mixture” (M–5630).
WYNIKI
yto jest ro lin wiatropyln i produkuje olbrzymie ilo ci lekkiego pyłku. Uwolnione z pylników ziarna pyłku za po rednictwem wiatru zostaj przenie-sione na znamiona słupków. Słupek u yta był pozbawiony szyjki, a rozczłono-wane znami ł czyło si bezpo rednio z zal ni . Proksymalna cz obu rozga-ł zie byrozga-ła pokryta drobnymi wrozga-łoskami skierowanymi ku górze. Cz dystaln stanowiły rozbudowane, piórkowate, wielokomórkowe papille. Znami S.
cere-ale było typu suchego, rozgał zione na dwa płaty, miało piórkowat budow ,
która sprzyjała zatrzymywaniu si du ej liczby ziaren pyłku. Powierzchni re-ceptywn stanowiło całe znami (ryc. 1).
Budowa pylników u badanych ro lin była typowa dla rodziny Poaceae i nie zauwa ono ró nic w budowie anatomicznej badanych odmian i linii. Ka dy pylnik składał si z czterech mikrosporangiów poł czonych ł cznikiem. Worek pyłkowy otoczony był cian zbudowan z kilku warstw komórek: na zewn trz epiderma, pod ni endothecium, warstwa po rednia i tapetum. U yta wyst puje tapetum sekrecyjne, które zachowuje budow komórkowa a do momentu cał-kowitego ukształtowania pyłku. W czasie dojrzewania pyłku mikrospory układa-ły si w jedn warstw , przylegaj c do ciany pylnika. Pojedyncze ziarna pyłku
były zazwyczaj odwrócone porusem do tapetum i przylegały do wewn trznej ciany pylnika (ryc. 2). Miały one kształt owalny (elipsoidalny) z jednym poru-sem otoczonym kołnierzem sporodermy z widocznym operculum. Natomiast ich powierzchnia miała struktur nierówn i gruzełkowat (ryc. 3).
W prowadzonych badaniach zwrócono uwag na radialne uło enie ziaren pyłku w pylniku. We wszystkich analizowanych liniach yta obserwowano pery-feryczne uło enie pyłku, tzn. e ziarna pyłku tworzyły regularny cylinder, przy-legaj cy do ciany pylnika, natomiast rodek loculus był pusty.
W pylnikach S. cereale linii Ls225 (ryc. 4) pomi dzy ziarnami pyłku stwier-dzono obecno substancji, podobnych do resztek niezresorbowanego tapetum. Pomi dzy poszczególnymi ziarnami pyłku linii Ls193 obserwowano podobn , chocia znacznie cie sz warstw zdegradowanego tapetum. Niezresorbowane tapetum znajdowało si przy promienistych cianach i tworzyło sklejaj c war-stw . Takiej substancji nie war-stwierdzono w pylnikach samozgodnych linii yta Ls190, Ls250 ani te w przypadku samoniezgodnych odmian Amilo i Kier. W dojrzałych workach pyłkowych znajdowały si wolne ziarna pyłku, a tapetum było całkowicie zresorbowane (ryc. 5).
Obserwacje stopnia opylenia znamion wszystkich badanych form przepro-wadzono na kłosach okrytych izolatorami. Wielko ziaren pyłku zale ała od pozycji kwiatu w kłosie. Najwi ksze ziarna produkowały kwiaty usytuowane w rodku kłosa, w okresie pełnego pylenia. Na znamionach badanych ro lin yta były stosunkowo du e ilo ci pyłku, ale mo na było obserwowa pewn ró no-rodno w stopniu opylenia znamion w zale no ci od badanej linii. Najwi cej pyłku znajdowało si na znamionach samoniezgodnych odmian Amilo (ryc.6) i Kier oraz samozgodnych liniach Ls193 oraz Ls225. Natomiast u pozostałych linii samozgodnych obserwowano rednie opylenie znamion. Ponadto zaobser-wowano znaczne ró nice w sposobie rozmieszczenia pyłku na znamionach w ród badanych linii. Pyłek był równomiernie rozło ony na znamionach u wi k-szo ci badanych form, z wyj tkiem linii Ls193 oraz Ls225. W pierwszym przy-padku (Ls193) najwi cej pyłku osadzało si na szczytach znamion, a bardzo mało było w rodkowej cz ci (ryc. 7). Natomiast w linii Ls225 najwi ksze na-gromadzenie pyłku obserwowano w rodkowej cz ci płatów znamion.
Nast pnie przebadano kiełkowanie ziaren pyłku w łagiewki pyłkowe in vivo, na powierzchni znamion. U samoniezgodnych odmian Amilo i Kier, pomimo du ego i równomiernego opylenia, tylko nieliczne ziarna pyłku kiełkowały w łagiewki pyłkowe (ryc. 8). U linii samozgodnych na powierzchni znamienia pojawiały si łagiewki pyłkowe, które kierowały si w gł b tkanek słupka (ryc. 9). Najwi cej kiełkuj cych ziaren pyłku obserwowano w liniach Ls193 oraz Ls225.
Aby sprawdzi , czy łagiewki pyłkowe wrastały w tkank stigmatoidaln , wykonano preparaty macerowane, barwione bł kitem aniliny i analizowano je w mikroskopie fluorescencyjnym. Na znamionach samoniezgodnych linii tylko nieliczne z osadzonych ziaren kiełkowały w łagiewki pyłkowe, w pozostałych pojawiały si korki kalozowe zarówno w krótkich, rosn cych łagiewkach, jak i w porusach ziaren przylegaj cych do komórek znamienia. Cz łagiewek pozo-stawała na powierzchni znamienia, z du liczb korków kalozowych. U samo-zgodnych linii łagiewki pyłkowe wrastały pod znami i kierowały si do zal ni (ryc. 10).
Sprawdzono zdolno dojrzałych ziaren pyłku pobranych z p kaj cych pyl-ników do kiełkowania w łagiewk pyłkow w warunkach in vitro. W roztworze 2% sacharozy ziarna pyłkowe zaczynały kiełkowa ju po upływie 30 min. Pro-cent kiełkuj cych ziaren pyłku był wysoki, około 80. Nie kiełkowały głównie małe, gorzej wykształcone ziarna. Dojrzałe ziarna pyłku S. cereale były pocz t-kowo odwodnione i miały nieregularn powierzchni . Przekroje mikroskopowe pojedynczych ziaren pokazuj , e wyst powała tam intyna o ró nej grubo ci, podczas gdy grubo egzyny była raczej jednakowa na całym obwodzie. Wn -trze dojrzałego ziarna wypełniała g sta cytoplazma z licznymi organellami, w ród których dominowały amyloplasty (ryc. 11). W trakcie kiełkowania pyłku w łagiewk pyłkow plastydy przemieszczały si w cytoplazmie komórki wege-tatywnej w pobli e porusa, powoduj c charakterystyczn polaryzacj protopla-stu. Dojrzałe ziarno pyłku było trójkomórkowe, oprócz komórki wegetatywnej zawierało dwie komórki plemnikowe. Pocz tkowo przyjmowały one kształt soczewkowaty, a nast pnie oszczepowaty.
Ultrastrukturalna budowa sporodermy dojrzałego ziarna pyłku pokazywała, e u S. cereale sporoderma składała si z cienkiej, osmofilnej egzyny i znacznie grubszej intyny. Egzyna była urze biona w sposób charakterystyczny dla
Po-aceae. W egzynie pyłku yta widoczne były radialnie uło one kanały. Grubo
egzyny u badanych linii yta była zmienna, i tak np. u samozgodnej linii Ls193 wynosiła 272–296 nm, a u samoniezgodnej Amilo od 227 do 363 nm.
Porównywano polimorfizm białkowy samoniezgodnej linii Amilo oraz czte-rech samozgodnych linii wsobnych yta. Metod elektroforezy dwukierunkowej rozdzielono białka i peptydy protoplastów pyłku oraz oddzielnie białka cian. Rozdział białek zachodził w zakresie pH 5,0–9,0; a wi kszo miała masy cz -steczkowe od 66–10 kDa. W protoplastach pyłku linii Amilo wyst puje znacznie mniej peptydów wielkocz steczkowych (powy ej 66 kDa) ni w linii Ls190 i Ls193. W Amilo bardzo mało jest tak e peptydów o niskiej masie (poni ej 16 kDa) w porównaniu z liniami Ls190 i Ls193 (ryc. 12). Porównanie składu białek powierzchniowych wykrywanych w cianie pyłku badanych linii wykaza-
Rycina 1. Znami S. cereale w pocz tkowym okresie kwitnienia. SEM x 1000 Figure 1. Stigma of S. cereale taken in the initial period of blossoming. SEM x 1000 Rycina 2. Cz ciany pylnika z ziarnami pyłku odwróconymi do tapetum. SEM x 1200 Figure 2. Part of anther`s wall with pollen grains turned with the pori towards tapetum. SEM x 1200
Rycina 3. Typowe dojrzałe ziarna pyłku z jednym porusem i widocznym operculum. SEM x 6000 Figure 3. Typical, mature pollen grains with one porus and visible operculum .SEM x 6000
Rycina 4. Pyłek linii Ls 225 z pozostało ciami tapetum. SEM x 4000 Figure 4. Pollen grains of the Ls 225 line with remains between them. SEM x 4000
Rycina 5. Pyłek odmiany Amilo. SEM x 4000 Figure 5. Pollen grains of the Amilo cultivar. SEM x 4000
Rycina 6. Obfite opylenie znamienia odmiany Amilo. SEM x 800 Figure 6. Abundant pollination of the Amilo cultivar stigma. SEM x 800 Rycina 7. Pyłek zdeponowany na szczytach znamienia w linii Ls 193. SEM x 1000 Figure 7. Pollen deposited on the tops of the stigmata of the Ls 193 line. SEM x 1000
Rycina 8. Kiełkuj ce ziarno pyłku na znamieniu samoniezgodnej odmiany Amilo. SEM x 7000 Figure 8. Germination of the pollen grain on the selfincompatible stigma Amilo cultivar. SEM x 7000
Rycina 9. Kiełkuj ce ziarno pyłku na znamieniu samozgodnej linii Ls 225. SEM x 6000 Figure 9. Germination of the pollen grain of the selfcompatible line Ls 225. SEM x 6000
Rycina 10. Na znamieniu somozgodnej odmiany Ls 193 łagiewka pyłkowa kieruje si w gł b tkanek słupka. Mikroskop fluorescencyjny x 300
Figure 10. On the selfcompatible stigma Ls 193 line pollen tube heads towards the onside of the pistil`s tissue. Fluorescence microscopy x 300
Rycina 11. Ultrastrukturalny obraz dojrzałego ziarna pyłku yta z widocznymi amyloplastami. TEM x 6000. i-intyna, e-egzyna
Figure 11. Ultrastructural picture of the mature rye pollen grain with visible amyloplasts. TEM x 6000. i-intine, e-exine
Rycina 12. Białka płaszcza pyłkowego u SI Secale cereale cv. Amilo (a) i cv.Kier (b) Zaznaczono 9 charakterystycznych peptydów, b d cych równocze nie peptydami wspólnymi
dla obu tych odmian. Peptydy charakterystyczne to te, których nie wykryto w protoplastach czterech odmian yta i we frakcjach płaszcza pyłkowego dla dwóch SC linii Figure 12. Peptides of pollen coat of selfincompatible S.cereale cv.Amilo (a) and cv. Kier (b).
Nine white spots indicate peptides which a characteristic of both varieties. Peptides which were not detected in protoplasts of four rye lines and in fractions of pollen coat
for two selfcompatible lines are referred to as characteristic peptides
Rycina 13. Białka płaszcza pyłkowego u SC Secale cereale Ls 192 (c) i Ls 225 (d). Zaznaczono 20 charakterystycznych peptydów, b d cych równocze nie peptydami wspólnymi dla obu tych linii. Peptydy charakterystyczne to te, których nie wykryto w protoplastach czterech
od-mian/linii yta i we frakcjach płaszcza pyłkowego dla dwóch SI odmian
Figure 13. Peptides of S. cereale pollen coat of Ls193 and Ls 225 lines. Twenty characteristic peptides were marked (white spots). They were common peptides for those lines and they were not present
ło, e w linii Amilo jest znacznie mniej białek o niewielkiej masie (poni ej 16 kDa) ni w Ls190 i Ls193. U obu tych linii skład białek o niskiej masie jest pra-wie identyczny. Linia samozgodna Ls225 jest do podobna pod wzgl dem zestawu białek do samoniezgodnej linii Amilo, ma tak e niewiele białek niskocz -steczkowych (ryc. 13).
Bardzo wa nym etapem generatywnego rozmna ania ro lin nasiennych jest proces zapylenia, czyli zdeponowania pyłku na znamieniu. Do rodziny Poaceae nale typowe gatunki wiatropylne. Anemofilia była najwcze niejszym ewolu-cyjnie mechanizmem przenoszenia pyłku, ale cz sto jest wtórnym przystosowa-niem do warunków rodowiska, np. w rejonach, gdzie brakuje owadów zapyla-j cych, ro liny mog przekształci si z entomofilnych w anemofilne.
Pyłek ro liny wiatropylnej jest niesiony przez wiatr w ró nych kierunkach i nie zawsze trafia na wła ciwe znami . Aby zwi kszy szanse, ro liny wytworzy-ły wiele przystosowa umo liwiaj cych efektywne zapylenie. Nale do nich mi dzy innymi ogromna liczba produkowanego pyłku przypadaj ca na jeden zal ek oraz rozbudowana powierzchnia znamion. U badanych linii Secale
cere-ale, zarówno samozgodnych jak i samoniezgodnych, opylenie znamion było
obfite. Sprzyjała temu budowa znamion, z silnym rozczłonowaniem i licznymi, wielokomórkowymi papillami, daj cymi du powierzchni chwytn . Na zna-mionach osadzały si setki ziaren pyłku, które tam pozostawały nawet przez dwa tygodnie. W ród linii samozgodnych najwi ksze opylenie obserwowano u linii Ls193, Ls225 oraz Ls250. W ród analizowanych form obserwowano ró ny sto-pie opylenia, co nie pozostaje w zale no ci z cech samo- lub obcopylno ci. Natomiast rozmieszczenie pyłku na powierzchni receptywnej było zró ni- cowane.
U linii Ls193 obfite opylenie wyst powało tylko na szczytach znamion, rodkowa i dolna cz była pozbawiona pyłku, a u linii Ls225 najwi cej pyłku osadzało si w rodkowej cz ci znamienia. Pyłek wszystkich samozgodnych linii masowo kiełkował na znamieniu w łagiewki pyłkowe. U samoniezgodnych odmian Amilo i Kier wyst piło rednie opylenie, ale tylko nieliczne ziarna pył-kowe tworzyły łagiewki pyłpył-kowe. W dojrzałych pr cikach linii samoniezgodnej Amilo obserwowano wolne ziarna pyłku, za tapetum było całkowicie zresor-bowane. U dwóch spo ród czterech badanych samozgodnych linii w workach pyłkowych mi dzy ziarnami pyłku le ało niewykorzystane tapetum. Obecno resztek tapetum nie utrudniała jednak wysypywania si pyłku z worków pyłko-wych, gdy w ka dej linii wsobnej obserwowało si du e opylenie znamion.
Osadzenie pyłku na znamieniu jest pierwszym etapem rozpoznania mi dzy m skim gametofitem a sporofitowym znamieniem. W przypadku znamienia typu suchego ogromn rol w tym procesie odgrywa tzw. płaszcz pyłkowy. Badania prowadzone na Arabidopsis udowodniły, e przyleganie pyłku do komórek
znamienia było mo liwe dzi ki lipofitycznym molekułom obecnym w egzynie, a nie w płaszczu pyłkowym. Lipidy odgrywały te zasadnicz rol w pocz tko-wym etapie wzrostu łagiewki pyłkowej na znamieniu. Potwierdzaj to badania na mutantach z defektem kanałów lipidowych, których ziarna nie były zdolne do kiełkowania. Po dodaniu trójglicerydów nast powała hydratacja ziaren pyłko-wych na znamieniu i mo liwe było kiełkowanie takiego pyłku w łagiewk pył-kow [Lord 2000].
Po osadzeniu ziarna pyłku na znamieniu nast powała jego hydratacja. Proces ten mo e by ułatwiony przez kanały wodne w membranach plazmatycznych komórek znamienia. Prace Ikeda [1997] potwierdzaj , e reakcja odrzucenia samoniezgodnego pyłku polega na braku mo liwo ci hydratacji pyłku padaj ce-go na suche znami u ro lin z rodziny Brassicaceae. Odpowiedzi na rozpozna-nie pyłku jako rozpozna-niezgodnego jest zahamowarozpozna-nie wzrostu łagiewki pyłkowej. Za-trzymanie wzrostu łagiewki mo e odbywa si : na znamieniu np. Secale cereale,
Papaver rhoeas, Brassica chinensis, w szyjce słupka np. Petunia violacea, Abu-tilon hybridum lub w zal ku np. Gasteria verrucosa, Reseda odorata.
Rozpoznanie i odrzucenie niezgodnego ziarna pyłku u yta odbywa si ju na powierzchni znamienia. Niezgodne gametofity m skie najcz ciej nie kiełkuj wcale lub te krótkie łagiewki pyłkowe nie wrastaj w tkanki pod znamieniem. Cytologicznym obrazem zahamowania niezgodnych ziaren pyłku jest tzw. od-powied kalozowa. U Sinapis alba w aperturze pyłku lub na wierzchołku kiełku-j cekiełku-j łagiewki pyłkowekiełku-j oraz w cianie papilli, do którekiełku-j przylega ziarno pyłku, jest syntetyzowana kaloza [ nie ko, Winiarczyk 1996].
Kiełkowanie pyłku jest uzale nione od typu pyłku – ziarna trójj drowe kieł-kuj szybciej ni dwuj drowe. W ziarnach pyłku s zgromadzone potrzebne zapasy RNA i białek, niezb dnych do kiełkowania ziarna pyłku i pocz tkowego wzrostu łagiewki pyłkowej. Natomiast w pyłku dwuj drowym nie ma takich zapasów, wobec tego musz by one syntetyzowane podczas kiełkowania ła-giewki pyłkowej [Krzywicka, Kowalczyk 1998]. Zdolno kiełkowania pyłku zale y ponadto od czasu zakwitania i pozycji kwiatu, z którego pochodzi pyłek. U ro lin takich jak Zea mays czy Oryza sativa najwi cej ywotnego pyłku roz-wija si w kwiatach, które otwieraj si najwcze niej, podczas gdy kolejne kwia-ty z tego kwiatostanu wytwarzaj coraz mniej ywotnego pyłku. Na ogół dojrza-ły pyłek tylko przez krótki czas zachowuje zdolno do kiełkowania. Zale nie od gatunku pyłek traci ywotno w okresie od kilku godzin do kilku dni np. u
Zea mays, Triticale, Secale cereale pyłek zachowuje zdolno kiełkowania przez
5–7 dni [Palfi i in. 1988].
U wszystkich badanych ro lin yta dojrzałe ziarno pyłku posiadało dwie ko-mórki: generatywn i wegetatywn , w której dochodziło do nagromadzenia
du-ej ilo ci materiałów zapasowych. W wyniku mitozy z komórki generatywndu-ej powstaj dwie komórki plemnikowe. Dojrzałe odwodnione ziarno pyłku yta ma nieregularn powierzchni . Budowa morfologiczna sporodermy jest taka sama u wszystkich badanych linii yta, a urze bienie egzyny jest charakterystyczne dla innych przedstawicieli tej rodziny, co potwierdza dotychczasowe stwierdzenia, e jest to najbardziej trwała cecha taksonomiczna [Vithanage, Knox 1979]. Ul-trastrukturalna budowa sporodermy dojrzałego ziarna pyłku pokazuje, e u yta intyna jest znacznie grubsza ni egzyna. Intyna jest zbudowana z celulozowych fibrylli osadzonych w matrix zawieraj cej hemicelulozy i białka. W sporodermie s widoczne radialne kanały, przecinaj ce cian ziarna pyłku. Dzi ki obecno ci tych kanałów ciana jest przepuszczalna nie tylko w rejonie porusów, ale na całej powierzchni. Kanały w sporodermie umo liwiaj utrzymanie chemicznego kontaktu cytoplazmy pyłku z egzyn . T drog mog równie przenika białka, enzymy i glikoproteiny odpowiedzialne za wst pne rozpoznanie pyłku [Chri-stensen, Horner 1974]. Po zapyleniu na receptywnej cz ci znamienia z intyny pyłku uwalniaj si ró ne substancje, np. białka pochodzenia gametofitycznego, które reaguj z białkami z receptywnych regionów znamienia. Badania prowa-dzone w mikroskopie elektronowym transmisyjnym przez Vithanage`a i Knoxa [1979] pokazuj , e białka pyłku nie wnikaj do komórek papilli. Ten decyduj -cy moment dla wyra enia reakcji zgodno ci lub odrzucenia zachodzi na po-wierzchni znamienia w ci gu kilku pierwszych minut. Penetracja komórek zna-mienia zachodzi dopiero po poł czeniu pyłku ze cian znazna-mienia jako efekt zgodnego zapylenia. Ziarno pyłku jest „przyjmowane” głównie w tym rejonie, gdzie nast puje jego hydratacja przez cian , w rejonie tym kutikula jest nieci -gła. Wykazano równie , e jest mo liwe przesuni cie znakowanych białek w rejon szczytów papilli, poniewa kutikula jest nieefektywn barier . Ten fakt nasuwa przypuszczenie, e po wst pnym uwodnieniu pyłku i uwolnieniu białek ze ciany mog one przej z powrotem do komórek znamienia i osadzi si w plazmolemmie.
Bardzo wa n cech taksonomiczn jest charakter płaszcza pyłkowego oraz sposób jego formowania na powierzchni ziarna pyłku. Niezale nie od tego, czy jest to tzw. płaszcz tryfinowy, czy okrywa typu pollen-kit, jego rola jest bardzo wa na w momencie przylegania do znamienia i pierwszych reakcji rozpoznania. U ycie wyizolowanej otoczki egzynowej w do wiadczeniach in vitro potwier-dza, e ta warstwa odpowiada za aktywacj powierzchni znamienia i wła
ciwo-ci adhezyjne u wielu gatunków ro lin [Dickinson i in. 2000].
Na charakterystyczne uło enie pyłku w pylniku u traw zwraca uwag wielu autorów: Christensen i Horner [1974], Cebrat i Zadecka [1978], Scoles i Evans [1979]. Wszyscy zgodnie potwierdzaj , e u S. cereale wszystkie porusy ziaren pyłku s zwrócone do tapetum. W pó niejszej pracy z r. 1996 Kirpes i in.
mody-fikuj nieco dotychczasowe pogl dy i twierdz , e niektóre ziarna pyłku nie s dokładnie uło one porusem do tapetum. Te opisy s zgodne z naszymi obserwa-cjami w mikroskopie elektronowym skaningowym, które były prowadzone na S.
cereale. Uło enie pyłku we wszystkich badanych liniach yta było
„peryferycz-ne”, ale nie wszystkie ziarna pyłku miały porusy przylegaj ce do tapetum. Jest to jedna z cech charakterystycznych dla wszystkich gatunków nale cych do rodziny Poaceae. Wyj tek stanowi tu tylko dwa gatunki: Anomochloa
maranti-dea i Pharus lappulaceus.
W podsumowaniu bada nad zapyleniem u samozgodnych i samoniezgod-nych form S. cereale mo na stwierdzi , e: ro liny obydwu form wytwarzaj du e ilo ci ywotnego pyłku, opylenie znamion jest obfite, ale ró ni si roz-mieszczeniem ziaren pyłku na znamionach. Pomimo znacznie wi kszego opyle-nia znamion ro lin samoniezgodnych tylko nieliczne ziarna tworz łagiewki pyłkowe. Ponadto ciekawym zjawiskiem u niektórych ro lin samozgodnych jest obecno resztek niewykorzystanego tapetum. U badanych form nie zauwa ono istotnych ró nic w ultrastrukturalnej budowie sporodermy ziaren pyłku. Zestawy białek samoniezgodnych odmian Amilo i Kier s prawie identyczne, a w samo-niezgodnej linii Ls225 jest niewiele białek niskocz steczkowych.
PI MIENNICTWO
Boyes D.C., Nasrallah J.B. 1995. An anther-specific gene encoded by an S locus haplotype of
Bras-sica produces complementary and differentially regulated transcripts. Plant Cell 7, 1283–1294.
Brewbaker J.L. 1959. Incompatibility and the pollen grain. Rec. Adv. Bot. 2, 46.
Cebrat J., Zadecka A. 1978. Development of anthers in three males-sterile lines of rye (Secale cereale L.). Gen. Pol. 19, 25–31.
Christensen J.E., Horner H.T. 1974. Pollen pore development and its spatial orientation during micro-sporogenesis in the grass Sorghum bicolor. Am. J. Bot. 61, 606–623.
Dickinson H.G., Elleman C.J., Doughty J. 2000. Pollen coating-chimaeric genetics and new func-tions. Sex. Plant Reprod. 5, 302–309.
Heukeshoven J., Dernick R. 1985. Simplified method for silver staining of proteins in polyacrylamide gels and the mechanism of silver staining. Electrophoresis 6, 103–112.
Hochstrasser D.F., Harrington M.G., Hochstrasser A.C., Miller M.J., Merril C.R. 1988. Methods for increasing the resolution of two-dimensional protein electrophoresis. Anal. Biochem. 73, 424–435.
Hurkman W.J., Tanaka C.K. 1986. Solubilization of plant membrane proteins for analysis by two-dimensional gel electrophoresis. Plant Physiol. 81, 802–806.
Ikeda A. 1997. An aquaporin – like gene required for the Brassica self-incompatibility response. Science 27, 1563–1566.
Kirpes C.C., Clark L.G., Lersten N.R. 1996. Systematic significance of pollen arrangement in micro-sporangia of Poaceae and Cyperaceae: review and observations on representative taxa. Am. J. Bot. 83, 1609–1622.
Knox R.B. 1984. Pollen-pistil interaction. In: Cellular Interaction. Ed. H.F. Linskens and J. Heslop-Harrison, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York-Tokio 102, 9–24.
Krzywnicka E., Kowalczyk S. 1998. Molekularne mechanizmy samoniezgodno ci homomorficznej zapobiegaj cej samozapłodnieniu ro lin okrytonasiennych. Post. Biol. Kom. 1, 75–98.
Lord E. 2000. Adhesion and cell movement during pollination: cherchez la femme. Trends Plant Sc. 5, 368–372.
Nettancourt D. 1977. Incompatibility in Angiosperms. Springer-Verlag-Berlin-Heidelberg-New York.
Palfi G., Gulyas S., Rajki E.S. 1988. Correlations of the quality of the pollen grains with the temporal sequence of pollen dispersion in the different parts of the inflorescence. Acta Univ. Szeged. Acta Biol. 34, 27–34.
Scoles G.J., Evans L.E. 1979. Pollen development in male-fertile and cytoplasmic male-sterile rye. Can. J. Bot. 57, 2782–2790.
nie ko R., Winiarczyk K. 1996. Pollen tube incompatibility reaction on the stigma in self-pollination Sinapis alba L. Acta Soc. Bot. Pol. 1/2, 101–105.
Vithanage H.I.M.V., Knox R.B. 1979. Pollen-wall proteins: quantitative cytochemistry of the origin of the intine and exine enzymes in Brassica oleracea. J. Cell Sci. 21, 423–435.
