Hodowla i genetyka
L
LL
A
A
A
B
B
B
O
O
O
R
R
R
A
A
A
T
T
T
O
O
O
R
R
R
Y
Y
Y
JJ
J
N
N
N
E
E
E
M
M
M
E
E
E
T
T
T
O
O
O
D
D
D
Y
Y
Y
O
O
O
C
C
C
E
E
E
N
N
N
Y
Y
Y
O
O
O
D
D
D
P
P
P
O
O
O
R
R
R
N
N
N
O
O
O
Ś
Ś
Ś
C
C
C
II
I
Z
Z
Z
II
I
E
E
E
M
M
M
N
N
N
II
I
A
A
A
K
K
K
A
A
A
N
N
N
A
A
A
P
P
P
H
H
H
Y
Y
Y
T
T
T
O
O
O
P
P
P
H
H
H
T
T
T
H
H
H
O
O
O
R
R
R
A
A
A
II
I
N
N
N
FF
F
E
E
E
S
S
S
T
T
T
A
A
A
N
N
N
S
S
S
mgr inż. Sylwester Sobkowiak, prof. dr hab. Hanna Zarzycka, dr Jadwiga Śliwka IHAR – PIB, ul. Platanowa 19, 05-831 Młochów, e-mail: s.sobkowiak@ihar.edu.pl
obór właściwych metod oceny odpor-ności stanowi ważny element w pra-cach hodowlanych nad uzyskaniem ziemniaków odpornych na P. infestans. Wy-brane metody muszą spełniać kilka warun-ków: przede wszystkim powinny dawać po-wtarzalne wyniki, a ponadto być tanie, łatwe w zastosowaniu i równocześnie zapewniać szybkie przetestowanie dużych ilości mariału hodowlanego. Te warunki spełniają te-sty laboratoryjne: listkowy, stanowiący wstęp do oceny odporności części nadziemnych ziemniaka na P. infestans, oraz plastrowy i bulwowy – służące do oceny bulw.
Pierwsze próby oceny odporności geno-typów ziemniaka na oderwanych listkach przeprowadził w latach 50. ubiegłego wieku w Holandii Toxopeus (1954). W następnych latach metoda ta została dopracowana przez Lapwooda (1963). Test listkowy jest stoso-wany w Polsce od wielu lat (Świeżyński i in. 1991, 1997). Pozwala na użycie do inokulacji wybranych ras P. infestans o szerokim spek-trum wirulencji i wysokim poziomie agresyw-ności. Umożliwia daleko posuniętą standary-zację warunków przygotowania inokulum, inokulacji materiału i inkubacji. Ponadto umożliwia porównanie odporności genoty-pów ziemniaka niezależnie od grupy wcze-sności, czego nie można uzyskać w warun-kach polowych (Zarzycka 1989).
Do inokulacji należy stosować izolaty P.
infestans występujące aktualnie w polskiej
populacji, o szerokim zakresie wirulencji i wysokim poziomie agresywności. W teście listkowym należy pamiętać o przestrzeganiu zasad właściwego przygotowania zawiesiny
infekcyjnej, przeprowadzenia inokulacji oraz zapewnieniu odpowiedniej temperatury, oświetlenia i wilgotności w czasie inkubacji
P. infestans, gdyż od tego w dużym stopniu
zależy uzyskanie należytej powtarzalności wyników (Zarzycka 1989, 1993).
Kultury P. infestans przechowywane na żytnim agarze powinny być przynajmniej dwukrotnie przepasażowane przez listki lub plastry z bulw podatnych odmian ziemniaka (takich jak Tarpan, Irys, Irga), aby odzyskały właściwy sobie zakres wirulencji i poziom agresywności (Zarzycka 1996, Sobkowiak i in. 2004). Przed użyciem inokulum należy chłodzić w temperaturze 4-7ºC przez 2-4 godz. Zwiększa się wtedy liczba zarodników pływkowych zdolnych do zakażania roślin ziemniaka, a tym samym wzrasta infekcyj-ność zawiesiny inokulacyjnej. Pływki szybko tracą żywotność i dlatego inokulum powinno być użyte w ciągu trzech godzin od momentu rozpoczęcia uwalniania pływek.
Objawy porażenia sztucznie zakażanych liści ziemniaka przez P. infestans są okre-sowo zróżnicowane w ciągu roku (Sujkowski 1983). Sezonowa zmienność patogeniczno-ści wpływa na reakcje odpornopatogeniczno-ściowe lipatogeniczno-ści ziemniaka. Testy listkowe powinno się prze-prowadzać w czasie największej infekcyjno-ści P. infestans, są one również zależne od terminu uprawy ziemniaków w polu. W tym kontekście można stwierdzić, że ocena od-porności materiałów hodowlanych na zarazę ziemniaka w testach listkowych powinna zostać przeprowadzona od połowy maja do połowy lipca (Sujkowski 1983; Zarzycka, Sujkowski 1988; Sobkowiak i in. 2004).
kulowane listki powinny być inkubowane przy świetle (ok. 2000 luksów), w temperatu-rze 15-16°C, gdyż w niższej jest zbyt słaby rozwój choroby, a w wyższej – duża zmien-ność objawów i silniejsza kontaminacja bak-teryjna.
Podłoże wyściełające kuwety powinno być odpowiednio wilgotne (90-95%) i pofał-dowane, żeby zapewnić dobry dostęp powie-trza, co zapobiega bakteryjnemu gniciu list-ków.
Test listkowy nadaje się przede wszyst-kim do wyselekcjonowania i odrzucenia po-datnych genotypów ziemniaka (Zarzycka 1993). Wadą metody jest to, że nie pozwala na zróżnicowanie i właściwe uszeregowanie odporniejszych form (Zarzycka 2001). Wyniki testów laboratoryjnych należy uzupełnić wy-nikami z doświadczeń polowych.
Pierwsze obserwacje nad wpływem róż-nych czynników na reakcje odpornościowe roślin ziemniaka zostały przeprowadzone już w latach 60. ubiegłego stulecia. Cieślewicz (1967) stwierdziła, że młodsze liście ziem-niaka są znacznie mniej wrażliwe na infekcję niż starsze. Do podobnych wniosków doszła Sieczka (1979), która zaobserwowała, że liście roślin 5-tygodniowych były bardziej odporne od 7-tygodniowych i że zarówno najstarsze, jak i najmłodsze liście były bar-dzo zmienne w reakcji odpornościowej.
Zalecane jest stosowanie odmian wzor-cowych o zróżnicowanej odporności na P.
infestans. Europejskie konsorcjum badaczy
zarazy ziemniaka EUCABLIGHT (www.euca-blight.org) zaproponowało następujący ze-staw odmian wzorcowych ziemniaka, cha-rakteryzujących się zróżnicowaną odporno-ścią naci na P. infestans: Alpha, Bintje, Eer-steling, Escort, Gloria i Robijn. Konsorcjum Eucablight zaleca wykonywanie testów list-kowych w minimum dwóch powtórzeniach po 5-20 listków.
Odporność bulw ziemniaka na P.
infe-stans ocenia się w oddziale IHAR – PIB w
Młochowie za pomocą testu plastrowego i testu całych bulw (Zarzycka 1990). Test pla-strowy został opracowany w Wielkiej Brytanii przez Lapwooda (1965). Umieszczał on ka-wałek bibuły filtracyjnej nasączonej zawiesi-ną sporangiów na powierzchni pojedynczego plastra wyciętego z bulwy. Metoda została zmodyfikowana i obecnie stosuje się
inoku-lację podwójnych plastrów, pomiędzy które wprowadza się zawiesinę sporangiów o standaryzowanej koncentracji. Patogen prze-rasta przez tkanki plastra i rozwija się na jego powierzchni w postaci zarodnikującej grzybni. Zanim grzybnia przerośnie od środ-ka, na powierzchni plastra, w procesie goje-nia, zaczyna się tworzyć tkanka korkowa. Według Piotrowskiego i innych (1973) szyb-kość gojenia się rany jest cechą skorelowa-ną z odpornością bulw na zarazę ziemniaka. W teście plastrowym stosuje się zawiesi-nę inokulacyjną, która powinna być przygo-towana w taki sam sposób jak do testu list-kowego. Proces inkubacji powinien przebie-gać w temperaturze 16ºC, w ciemności. Test plastrowy charakteryzuje się bardzo dużą powtarzalnością wyników, pozwala na wyse-lekcjonowanie i odrzucenie podatnych geno-typów ziemniaka oraz na zróżnicowanie ge-notypów odporniejszych.
Test całych bulw jest stosowany w celu lepszego zróżnicowania materiałów charak-teryzujących się średnią i wysoką odporno-ścią bulw. Test polega na zranieniu części koronowej bulwy na 24 godziny przed inoku-lacją. Stosuje się tu metodę inokulacji bulw opracowaną w Norwegii przez Bjora (1987). Inokulacja zranionych bulw daje większe zróżnicowanie między ocenianymi genoty-pami ziemniaka niż inokulacja bulw niezra-nionych.
W miarę dojrzewania przechowywanych bulw na ogół zwiększa się ich wrażliwość na
P. infestans oraz zmniejsza zróżnicowanie
między badanymi genotypami (Zarzycka 2001; Świeżyński, Zimnoch-Guzowska 2001). Z dotychczasowych obserwacji wyni-ka, że najkorzystniej jest oceniać bulwy na przełomie listopada i grudnia, gdyż w tym okresie zróżnicowanie pomiędzy badanymi genotypami jest większe niż w terminach późniejszych.
W czasie każdego testu oceny materiałów hodowlanych musi być sprawdzona wirulen-cja użytych izolatów P. infestans. Wirulencję definiuje się jako specyficzną patogenicz-ność izolatów w stosunku do genotypów ziemniaka zawierających komplementarne geny odporności R (R1-R11) (van der Plank 1978). Zostały wykryte związki pomiędzy agresywnością i wirulencją. Pietkiewicz i Piotrowski (1976) na podstawie badań
kilku-dziesięciu izolatów P. infestans znaleźli istotną dodatnią korelację między agresyw-nością mierzoną wielkością plamy na list-kach odmiany odpornej oraz intensywnością zarodnikowania na plastrach wyciętych z bulw odmiany podatnej a liczbą prawidło-wych porażeń testerów, czyli wykrywalnością genów wirulencji. Ponadto izolaty o wysokiej agresywności wywoływały silniejsze objawy chorobowe na testerach zawierających kom-binacje genów R (Pietkiewicz i in. 1975). Również Sujkowski (1992) obserwował szer-szy zakres wirulencji u izolatów P. infestans o wyższej agresywności, tj. powodujących duże, zarodnikujące plamy na listkach ziem-niaka.
Podobnie jak podczas oceny odporności naci także w testach plastrowych i bulwo-wych zaleca się badanie reakcji na P.
infe-stans standardowych odmian ziemniaka:
Alpha, Bintje, Eersteling, Escort, Gloria i Ro-bijn (www.eucablight.org).
Ocena porażenia listków, plastrów i bulw w skali 1-9 (tab. 1) jest w dużej mierze oceną subiektywną, zależną od osoby badającej. Ocenę przeprowadza się po 6 dniach w przypadku listków i plastrów lub po 14 dniach w przypadku całych bulw. Pomocne w ocenie wyników laboratoryjnych testów odporności na P. infestans mogą być foto-grafie prezentujące wzorcowe skale poraże-nia 1-9 (fot. 1-3). Odwoływanie się do tych samych fotografii może pozytywnie wpłynąć na powtarzalność ocen wykonywanych za-równo przez tego samego badacza w róż-nych terminach, jak i przez różróż-nych badaczy, a nawet w różnych laboratoriach.
Przebieg postępowania w czasie testów listkowych, plastrowych oraz bulwowych, ze szczególnym zwróceniem uwagi na sposób sporządzania inokulum, przeprowadzania inokulacji i zapewnienia warunków inkubacji, oraz właściwy dobór i przygotowanie mate-riału do testów zostały opracowane przez Zarzycką (2001).
Tabela 1 Ocena porażenia ziemniaka przez P. infestans
w testach listkowym plastrowym i bulwowym wg skali 9-stopniowej Powierzchnia
porażenia Opis objawów choroby
skala % test listkowy test plastrowy test bulwowy
9 0
brak porażenia lub drobne nekrozy, plama nieprzekra-czająca powierzchni kropli inokulacyjnej brak objawów porażenia lub brunatne nekro-tyczne plamy brak objawów porażenia lub sporadyczne małe brązowe plamki 8 < 3
od 8 do 1: stopniowy wzrost porażenia
7 3,1-10 6 10,1-25 5 25,1-75 4 75,1-90 3 90,1-97 2 97,1-99 1 99,1-100 Źródło: Zarzycka 2001
Fot. 1. Porażenie listków wg 9-stopniowej skali, gdzie 1 oznacza największe porażenie
Fot. 3. Porażenie bulw na przekroju poprzecznym wg 9-stopniowej skali, gdzie 1 oznacza największe porażenie
Literatura
1. Bjor T. 1987. Testing the resistance of potato
geno-types to tuber late blight. – Potato Res. 30: 525-532;
2. Cieślewicz J. 1967. Zmiany wrażliwości ziemniaka
na grzyb Phytophthora infestans (de Bary) w okresie wegetacji rośliny. Rozpr. dokt. IHAR Radzików: 42 s.;
3. Eucablight. www.eucablight.org; 4. Lapwood D. H. 1963. Potato haulm resistance to Phytophthora
in-festans. IV. Laboratory and field estimates compared
and further field analisis. – Ann. Appl. Biol. 51: 17-28;
5. Lapwood D. H. 1965. Laboratory assessment of
susceptibility of potato-tuber tissue to late blight (Phy-tophthora infestans). – Eur. Potato J. 8: 215-225;
6. Pietkiewicz J. B., Świszczewska J., Piotrowski W. 1975. Próby selekcji w obrębie ras Phytophthora
infestans (Mont.) de Bary. – Biul. Inst. Ziemn. 16: 79- -87; 7. Pietkiewicz J. B., Piotrowski W. 1976. Paso-żytnicze właściwości grzyba Phytophthora infestans (Mont.) de Bary. – Zesz. Nauk. ATR Bydgoszcz, Rol-nictwo 30: 119-139; 8. Piotrowski W.,
Wojciechow-ska-Perz B., Pietkiewicz J. B. 1973. Badanie
odpor-ności bulw ziemniaka na zarazę ziemniaczaną (Phy-tophthora infestans (Mont.) de Bary. – Biul. Inst. Ziemn. 11: 45-59; 9. Sieczka M. T. 1979. Próba opty-malizacji warunków ziemniaków pod kątem widzenia odporności polowej na Phytophthora infestans (Mont.)
de Bary. Rozpr. dokt. Inst. Ziemn. Bonin: 81 s.;
10. Sobkowiak S., Zimnoch-Guzowska E., Zarzycka H. 2004. Wpływ różnych metod traktowania kultur na
ekspresję wirulencji i agresywności Phytophthora infe-stans. – Acta Agrobot. 57: 131-143; 11. Sujkowski L.
S. 1983. Zmienność własności pasożytniczych grzyba
Phytophthora infestans (Mont.) de Bary w stosunku do ziemniaka w cyklu rocznym. Rozpr. dokt. Inst. Ziemn.
Oddz. Młochów: 63 s.; 12. Sujkowski L. S. 1992.
Zmienność wirulencji i agresywności u grzyba Phy-tophthora infestans (Mont.) de Bary w stosunku do ziemniaka. Rozpr. habilit. Inst. Ziemn. Oddz. Młochów:
70 s.; 13. Świeżyński K. M., Sieczka M. T.,
Sujkow-ski L. S., Zarzycka H., Zimnoch-Guzowska E. 1991.
Resistance to Phytophthora infestans in potato geno-types originating from wild species. – Plant Breed. 107:
28-38; 14. Świeżyński K. M., Domański L., Osiecka
M., Sieczka M. T., Zarzycka H. 1997. Resistance to
Phytophthora infestans in diploid and tetraploid potato families. 1. Resistance in detached leafleets. – J. Appl.
Genet. 38: 19-32; 15. Świeżyński K. M., Zimnoch-
-Guzowska E. 2001. Breeding potato cultivars with
tuber resistant to Phytophthora infestans. – Potato
Res. 44: 97-117; 16. Toxopeus H. J. 1954. Leaf test-ing as a method of genetical analysis of immunity from Phytophthora infestans in potatoes. – Euphytica 3: 133-240; 17. Van der Plank J. E. 1978. Genetics and molecular basis of plant pathogenesis. Springer-Verlag Berlin; 18. Zarzycka H. 1990. Comparison of the tuber slice whole tuber test used for assessment of potato resistance to tuber blight [Phytophthora infestans
(Mont.) de Bary]. – Acta Agrobot. 43: 95-107; 19.
Za-rzycka H. 1989. Wpływ stężenia i rodzaju inokulum na reakcje odpornościowe ziemniaka na Phytophthora infestans. – Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 374: 415-424;
od-porności ziemniaka na Phytophthora infestans (Mont.)
de Bary. [W:] Biotyczne środowisko uprawne a
zagro-żenie chorobowe roślin. Symp. ART Olsztyn, 7-9.09.
1993. PTFit ART Olsztyn: 443-451; 21. Zarzycka H.
1996. Effect of various methods of maintenance of
Phytophthora infestans on its pathogenicity to potato. – Plant Breed. Seed Sci. 40: 31-43; 22. Zarzycka H.
2001. Metody oceny i selekcji stosowane w pracach
genetycznych i hodowli ziemniaka. Monogr. Rozpr.
Nauk. IHAR Radzików 10: 133 s.; 23. Zarzycka H.,
Sujkowski L. S. 1988. Skuteczność testu listkowego
jako metody oceny odporności ziemniaków na Phy-tophthora infestans. – Rocz. Nauk Rol. E 18: 81-87
