Trichoderma spp. as a seed dressing bioproduct
against damping-off seedlings of vegetables crops
Trichoderma spp. jako zaprawa nasienna
przeciwko zgorzelom siewek roślin warzywnych
Jan Sobolewski, Aleksandra Gidelska, Magdalena Szczech, Józef RobakSummary
The aim of study was to assess the effect of carrot seed dressing with selected isolates of the fungus Trichoderma spp. against damping-off seedlings of carrots. It was shown that the used isolates of Trichoderma spp. significantly reduced the infection of germinating seeds and carrots seedlings by the pathogenic fungus species Pythium spp. The use of Trichoderma spp. more efficiently affected the height and weight of the tested carrot seedlings as compared to thestandart seed dressing Zaprawa Nasienna T 75 DS/WS, as well as the biopreparation based on Trichoderma harzianum. No effect of phytotoxicity of Trichoderma spp. isolates used on seed germination and the development of carrot seedlings was started.
Key words: Trichoderma, carrot, damping off, seed dressing Streszczenie
Badano wpływ zaprawiania nasion marchwi nowymi izolatami grzyba Trichoderma spp. na ograniczenie zgorzeli siewek spowodowanej przez Pythium spp. oraz wzrost i masę siewek. Wykazano korzystne działanie Trichoderma spp. w ograniczeniu infekcji kiełkujących nasion marchwi i siewek przez organizm Pythium spp. występujący w podłożu. Obserwowano istotną zwyżkę zarówno wysokości, jak i ogólnej masy siewek marchwi po zastosowaniu izolatów Trichoderma w stosunku do standardowej zaprawy Zaprawa Nasienna T 75 DS/WS, a także w porównaniu do komercyjnej zaprawy nasiennej zawierającej Trichodrma viride. Badane izolaty nie miały fitotoksycznego działania na kiełkujące nasiona i siewki marchwi.
Słowa kluczowe: Trichoderma, marchew, zgorzel siewek, zaprawianie nasion Instytut Ogrodnictwa
Zakład Ochrony Roślin Warzywnych Pracownia Fitopatologii
Konstytucji 3 Maja 1/3, 96-100 Skierniewice
jan.sobolewski@inhort.pl; magdalena.szczech@inhort.pl; aleksandra.gidelska@inhort.pl; jozef.robak@inhort.pl
Institute of Plant Protection – National Research Institute Prog. Plant Prot./Post. Ochr. Roślin 53 (2): 340-344
Wstęp / Introduction
Grzyb Trichoderma spp. jest powszechnie znany jako organizm antagonistyczny, wykorzystywany do ograni-czania grzybów patogenicznych w uprawie wielu roślin (Nederloff 2001; Weber i wsp. 2001; Alfanoi wsp. 2007; Ebtsam i wsp. 2009). Istnieją izolaty tego grzyba, różniące się antagonistycznym działaniem w stosunku do wybra-nych patogenów (Benítez i wsp. 2004). Jak podaje Howell (2003) w wielu przypadkach antagonistyczne działanie tych organizmów polega na zdolności do produkcji antybiotyków, czy pasożytniczego działania w stosunku do patogenów. Są też doniesienia (Harman 2000; Kowalska i wsp. 2012) o wpływie gatunków Trichoderma na sty-mulację wzrostu roślin, a także na zwiększanie tolerancji roślin na stresy abiotyczne w okresie ich wzrostu. Było to spowodowane stymulacją rozwoju systemu korzeniowego, co wpływało na lepsze pobieranie wody i składników pokarmowych. Grzyby z rodzaju Trichoderma są często stosowane jako zaprawy nasienne, wpływając korzystnie na cechy kondycyjne siewek (Sadowski i wsp. 2005; Mastouri i wsp. 2010). Przypuszcza się, że zabiegi takie wykazują korzystne działanie krótkoterminowe i niewiele jest doniesień o dalszym wpływie Trichoderma na rośliny w trakcie rozwoju. Zwykle nasiona reagują pozytywnie na zaprawianie grzybem Trichoderma harzianum (Harman 2000). W ostatnich latach w Polsce obserwuje się nagły wzrost występowania zgorzeli siewek spowodowany między innymi przez Pythium spp. na wielu gatunkach roślin warzywnych, powodując znaczne straty (Sobolewski i wsp. 2010). Jednym z powodów nasilającego się zagro-żenia tą chorobą są ograniczone zasoby zapraw grzybo-bójczych dopuszczonych do stosowania w kraju, w upra-wie większości gatunków roślin warzywnych, szczególnie w integrowanej i ekologicznej ochronie.
Celem badań było określenie wpływu zaprawiania nasion marchwi nowymi izolatami grzyba Trichoderma spp. na ograniczenie zgorzeli siewek spowodowanej przez
Pythium spp. oraz na wzrost i masę siewek. Istnieje
konieczność poszukiwania nowych środków pochodzenia naturalnego. Oceniano także ich wpływ na kondycję siewek marchwi i możliwości toksycznego wpływu na siewki. Pracownia Mikrobiologii Instytutu Ogrodnictwa Oddział Warzywnictwa umożliwiła przetestowanie wybra-nych izolatów Trichoderma, jako preparatów do zapra-wiania nasion marchwi.
Materiały i metody / Materials and methods
W latach 2012–2013 przeprowadzono dwa cykle doś-wiadczeń z marchwią. Przyjęto ogólny schemat stosowanych zapraw, w którym wariantem porównawczym (standardowym) była konwencjonalna Zaprawa Nasienna T 75 DS/WS oraz zaprawa pochodzenia naturalnego T22, której substancją czynną jest grzyb T. harzianum. Do zaprawiania nasion zastosowano trzy wyselekcjonowane izolaty Trichoderma spp. Izolaty pochodziły z Pracowni Mikrobiologii Instytutu Ogrodnictwa Oddział Warzywnic-twa. Każdy izolat stosowano w formie zawiesiny zarod-ników w trzech następujących koncentracjach: 1 × 104, 105
i 106 zarodników/ml. Doświadczenie kontenerowe założo-no w 4 powtórzeniach, w układzie losowanych bloków. Ogółem było 14 kombinacji. Na jeden kontener o wymia-rach 30 × 25 × 7 cm, stanowiący powtórzenie, przypadało 100 nasion marchwi. Przed wysiewem nasiona zaprawiono na mokro, stosując dawkę 10 g nasion, na 50 ml zawiesiny zarodników o zagęszczeniu zgodnym ze schematem doświadczenia. Czas zaprawiania wynosił pięć minut. W przypadku Zaprawy Nasiennej T 75 DS/WS środek na nasiona nanoszono na sucho w dawce 5 g/kg nasion, zgodnie z etykietą. Po 24 godzinach suszenia nasion na bibule filtracyjnej wysiewano je po 100 sztuk do konte-nerów z ziemią kompostową inokulowaną Pythium spp. Zakażenia gleby dokonano poprzez wymieszanie 10 ml zawiesiny Pythium spp. z 1 kg gleby mineralnej. Zawiesinę inokulum przyrządzono zgodnie z metodyką, jaką podaje Sivan i wsp. (1984). Po 14 dniach inkubacji grzybni hodo-wanej na pożywce ziemniaczanej PDA (Potato Dextrose Agar) w temperaturze 30°C dokonano homogenizacji pożywki z grzybnią przez 5 minut przy pomocy miksera. Uzyskana zawiesina inokulanta zawierała 5 × 106 oospor w 1 ml. Kontenery z wysianymi nasionami utrzymywano w szklarni, w temperaturze 20°C zapewniając optymalny wzrost siewek i patogeniczność Pythium spp. (Trujillo i wsp. 1967; Thompson i wsp. 1971). Ocenę liczby siewek wzeszłych oraz siewek martwych, porażonych przez
Pythium spp. dokonano po 2 tygodniach od siewu. Dane te
przeliczono na średni procent siewek zdrowych i mart-wych. Po 6 tygodniach wykonano pomiary wysokości siewek i ich świeżej, całkowitej masy. Ponadto szacowano stopień wpływu badanych izolatów na fitotoksyczność siewek, według skali 0–5° (0° – brak efektów fitotoksycz-nych, 5° – 100 procent uszkodzenia siewek) (Sobolewski i wsp. 2010). Wyniki opracowano analizą wariancji, istot-ność różnic oceniono testem Newmana-Keulsa.
Wyniki i dyskusja / Results and discussion
Wykazano, że zaprawianie nasion marchwi badanymi izolatami spowodowało istotny wzrost liczebności siewek zdrowych w stosunku do kombinacji kontrolnej, w której wysiewano nasiona niezaprawiane. Po zaprawieniu nasion zarodnikami pochodzącymi z izolatów: Nr 2 i Nr 3 grzyba
Trichoderma spp. uzyskano najwyższą liczbę siewek.
Zaprawianie nasion zarodnikami Trichoderma spp. miało również istotny wpływ na zwiększenie masy ogólnej młodych roślin. Najwyższą masę roślin zanotowano w kombinacji, w której nasiona zaprawiono izolatem Nr 3 przy najwyższym poziomie zagęszczenia zarodników 1 × 106/ml. Zastosowanie Trichoderma przy różnym zagęsz-czeniu zawiesiny zarodników w zakresie 1 × 104–1 × 106 nie miało istotnego wpływu na wysokość wschodów siewek, ich masę i wysokość. W doświadczeniu nr 1 (2012 r.), w porównaniu do standardowej zaprawy Zaprawa Nasien-na T 75 DS/WS (2012 r.) stwierdzono istotną zwyżkę wschodów siewek zdrowych jedynie po zaprawieniu nasion zawiesiną zarodników 1 × 105 i 1 × 106/ml grzyba
Trichoderma – izolat Nr 2 oraz zawiesiną zarodników
Tabela 1. Wpływ zaprawiania nasion marchwi izolatami Trichoderma na wschody, zdrowotność siewek i ich wzrost Table 1. Influence of Trichoderma seed treatment on emergence, health and growth of carrot seedlings
Doświadczenie nr 1 – Experiment No. 1, Skierniewice 2012 Średni procent
roślin porażonych The average percentage
of plants infected
Średni procent zdrowych siewek The average percentage
of healthy seedlings Średnia wysokość roślin Average plant height [cm] Średnia masa roślin w kontenerze Average weight of plants per container [g] Badany środek Treatment 1 tydzień po wysiewie 1 weeks after sowing 2 tygodnie po wysiewie 2 weeks after sowing 1 tydzień po wysiewie 1 weeks after sowing 2 tygodnie po wysiewie 2 weeks after sowing 6 tygodni po wysiewie 6 weeks after sowing 6 tygodni po wysiewie 6 weeks after sowing Kontrola – Control 2,2 a 4,2 a 58,5 g 55,5 e 7,5 g 10,2 f Zaprawa Nasienna T 75 DS/WS – 3 g 0 b 0 b 72,8 def 73,5 d 9,9 f 19,1 e T22 – 104 0 b 0 b 60,3 g 62,0 e 10,5 bcd 27,2 cd T22 – 105 0 b 0,1 b 72,8 ef 74,3 d 11,1 f 28,3 bcd T22 – 106 0 b 0,2 b 73,0 def 75,0 cd 11,8 a 30,1 bc Izolat Nr 1 – 104 0 b 0,1 b 71,8 ef 74,0 d 10,4 bcd 28,6 bcd Izolat Nr 1 – 105 0 b 0 b 75,8 cdef 77,0 bcd 10,4 bcd 31,0 bc
Izolat Nr 1 – 106 0 b 0 b 77,0 bcde 78,0 abcd 10,8 ab 29,9 bcd
Izolat Nr 2 – 104 0 b 0,1 b 78,3 bcd 78,0 abcd 10,2 f 37,5 bc
Izolat Nr 2 – 105 0 b 0 b 80,3 abc 81,0 abc 10,7 ef 39,8 b
Izolat Nr 2 – 106 0 b 0 b 82,0 ab 82,0 ab 11,7 ab 39,9 b
Izolat Nr 3 – 104 0 b 0 b 71,3 f 73,3 d 10,3 e 35,7 b
Izolat Nr 3 – 105 0 b 0 b 74 def 74,8 d 11,6 bc 36,5 b
Izolat Nr 3 – 106 0 b 0 b 83,0 a 83,3 a 11,9 a 43,4 a
Wartości liczbowe w kolumnach oznaczone tą samą literą nie różnią się istotnie przy p = 0,05 według testu Newmana-Keulsa The mean numbers with the same letter are not significantly different at p = 0.05, Newman-Keuls test
Tabela 2. Wpływ zaprawiania nasion marchwi izolatami Trichoderma na wschody, zdrowotność siewek i ich wzrost Table 2. Influence of Trichoderma seed treatment on emergence, health and growth of carrot seedlings
Doświadczenie nr 2 – Experiment No. 2, Skierniewice 2013
Średni procent roślin porażonych The average percentage
of plants infected
Średni procent zdrowych siewek The average percentage
of healthy seedlings Średnia wysokość roślin Average plant height [cm] Średnia masa roślin w kontenerze Average weight of plants per container [g] Badany środek Treatment 1 tydzień po wysiewie 1 weeks after sowing 2 tygodnie po wysiewie 2 weeks after sowing 1 tydzień po wysiewie 1 weeks after sowing 2 tygodnie po wysiewie 2 weeks after sowing 1 tydzień po wysiewie 1 weeks after sowing 2 tygodnie po wysiewie 2 weeks after sowing Kontrola – Control 3,1 a 4,3 a 53,5 b 60,2 b 10,2 g 10,5 f Zaprawa Nasienna T 75 DS/WS – 3 g 0 c 0 b 62,0 ab 65,5 ab 10,6 f 17,3 e T22 – 104 0,2 b 0,1 b – – – – T22 – 105 0,1 b 0,1 b – – – – T22 – 106 0 c 0 b – – – – Izolat Nr 1 – 104 0 c 0,1 b 67,0 a 70,0a 11,4 bc 29,2 cd Izolat Nr 1 – 105 0 c 0 b 67,3 a 69,3 a 11,5 bc 30,7 bcd Izolat Nr 1 – 106 0 c 0 b 65,5 a 66,0 a 11,5 bc 25,9 d
Izolat Nr 2 – 104 0 c 0,2 b 66,8 a 69,0 a 11,0 cdef 35,9 abc
Izolat Nr 2 – 105 0 c 0 b 70,7 a 72,5 a 11,3 cde 39,5 a
Izolat Nr 2 – 106 0 c 0 b 70,2 a 72,0 a 11,4 bcd 38,4 ab
Izolat Nr 3 – 104 0 c 0,1 b 71,7 a 73,2 a 10,8 ef 33,3 abcd
Izolat Nr 3 – 105 0 c 0 b 67,7 a 68,7 a 11,5 bc 35,0 abc
Izolat Nr 3 – 106 0 c 0 b 75,2 a 76,7 a 12,1 a 39,6 a
Wartości liczbowe w kolumnach oznaczone tą samą literą nie różnią się istotnie przy p = 0,05 według testu Newmana-Keulsa The mean numbers with the same letter are not significantly different at p = 0.05, Newman-Keuls test
nasion marchwi pozostałymi izolatami w zróżnicowanym zagęszczeniu zarodników uzyskano podobną liczebność wschodów do kombinacji z zaprawianiem nasion środkiem standardowym Zaprawa Nasienna T 75 DS/WS. Stwier-dzono istotne zwiększenie masy ogólnej siewek po zapra-wieniu nasion wszystkimi badanymi izolatami
Tricho-derma w stosunku do kombinacji z zaprawianiem nasion
środkiem Zaprawa Nasienna T 75 DS/WS (tab. 1). W doś-wiadczeniu nr 2 nie udowodniono istotnego wpływu zaprawiania nasion badanymi izolatami Trichoderma i zaprawą Zaprawa Nasienna T 75 DS/WS na liczebność wschodów siewek. Stwierdzono istotne zwiększenie masy ogólnej siewek w stosunku do kombinacji, gdzie stoso-wano stanardowy środek Zaprawa Nasienna T 75 DS/WS. Zaprawianie nasion badanymi izolatami nie wywołało efektów fitotoksyczności na siewkach (tab. 2). Jak donosi Ozbay i Newman (2004), podobnie korzystny wpływ na rośliny wykazał izolat T. harzianum stosowany w za-gęszczeniu 1 × 107 zarodników w 1 ml. Spowodował istotną poprawę wzrostu siewek wyrażoną w zwiększeniu liczby liści właściwych, a także zwiększeniu świeżej masy roślin.
Mastouri i wsp. (2010) udowodnili, że Trichoderma spp. stosowana w formie zaprawiania nasion pomidora spowodowała poprawę kiełkowania nasion narażonych na stres i ograniczyła zgorzel siewek spowodowany przez
Pythium ultimum. Zaprawianie nasion zmniejszyło
groma-dzenie nadtlenków lipidów w siewkach i izolat T.
harzia-num T22 zwiększył wigor siewek oraz indukował ich efekt
obronny przed warunkami stresowymi. W badaniach własnych uzyskano także poprawę kiełkowania i ograni-czenie porażenia siewek marchwi przez Pythium spp. Korzystny wpływ grzyba z rodzaju Trichoderma na poprawę rozwoju i zdrowotności truskawki wykazała Kowalska i wsp. (2012). Khalil i wsp. (2009) stosowali mieszaninę T. polysporum i T. harzianum do podlewania roślin pomidora, co powodowało zmniejszanie nasilenia zgorzeli wywołane przez Pythium spp., Phytophthora
cryptogea i Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici
w uprawie pomidorów. Podobny, pozytywny wpływ
T. harzianum na ograniczenie zgorzeli siewek marchwi
powodowanych przez Pythium spp. uzyskano w badaniach własnych. Nowe izolaty będą mogły znaleźć zastosowanie jako produkty komercyjne chroniące siewki marchwi przed zgorzelą siewek i korzystnie wpływające na wzrost roślin. Jak podaje Sadowski i wsp. (2005) istnieje możliwość użycia Trichoderma do otoczkowania nasion wielu gatunków roślin uprawnych. Pozostaje jedynie problem współrzędnego stosowania fungicydów i herbicydów, które mogą ograniczać aktywność Trichoderma (Damszel i wsp. 2009; Górski i wsp. 2010; Perek i Świerczyńska 2012).
Wnioski / Conclusions
1. Wybrane izolaty Trichoderma zastosowane do zapra-wiania nasion marchwi chronią siewki przed poraże-niem przez Pythium spp.
2. Zaprawianie nasion marchwi izolatami Trichoderma korzystnie wpłynęło na masę i wysokość roślin. 3. Najwyższą masę roślin zanotowano w kombinacji,
w której nasiona zaprawiono izolatem Nr 3 stosując 1 × 106 zarodników/ml.
4. Koncentracja zarodników izolatów Trichoderma w za-kresie 1 × 104–106/ml stosowanych do zaprawiania nasion marchwi nie miała istotnego wpływu na zwiększenie wschodów siewek, ich masy i wysokości. 5. Badane izolaty nie wykazały fitotoksycznego działania
na kiełkujące nasiona i siewki marchwi.
6. Wybrane izolaty Trichoderma mogą znaleźć w przysz-łości zastosowanie do zabezpieczenia siewek przed
Pythium spp.w integrowanej ochronie marchwi.
Praca finansowana w ramach projektu badawczego współ-finansowanego przez Unię Europejską z Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego w ramach Działania 1.3 Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka, Pod-działanie 1.3.1. Nr Projektu UDA-POIG.01.03.01-00-129/09-05.
Literatura / References
Alfano G., Lewis Ivey M.L.C., Cakir C., Bos J.I.B., Miller S.A., Madden L.V., Kamoun S., Hoitink H.A.J. 2007. Systemic modulation of gene expression in tomato by Trichoderma hamatum. Phytopathology 97: 429–437.
Benítez T., Rincón A.M., Limón M.C., Codón A.C. 2004. Biocontrol mechanisms of Trichoderma strains. Int. Microbiol. 7 (4): 249–260.
Damszel M.M., Wachowska U., Kowalska E. 2009. Interakcje patogen (Fusarium) – antagonista (Trichoderma) w warunkach stresu herbicydowego. [Interactions of pathogen (Fusarium) – antagonist (Trichoderma) under herbicide stress conditions]. Prog. Plant Prot./Post. Ochr. Roślin 49 (2): 851–855.
Ebtsam M.M., Abdel-Kawi K.A., Khalil M.N.A. 2009. Efficiency of Trichoderma viride and Bacillus subtilis as biocontrol agents against Fusarium solani on tomato plants. Egypt. J. Phytopathol. 37 (1): 47–57.
Górski R., Kozłowska M., Góra K. 2010. Analiza porównawcza wpływu naturalnych olejków eterycznych na ograniczenie wzrostu grzyba Trichoderma harzianum występującego w uprawie pieczarki dwuzarodnikowej (Agaricus bisporus). [Comparitive analysis of the effectof natural essential oils growth reduction of the fungus Trichoderma harzianum found in button mushroom (Agaricus bisporus)]. Prog. Plant Prot./Post. Ochr. Roślin 50 (1): 352–356.
Harman G. 2000. Myths and dogmas of biocontrol: changes in perceptions derived from research on Trichoderma harzianum T-22. Plant Dis. 84: 377–393.
Howell C.R. 2003. Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control of plant diseases: history and evolution of current concepts. Plant Dis. 87: 4–10.
Khalil S., Hultberg M., Alsanius B.W. 2009. Effect of growing medium on the interactions between biocontrol agents and tomato root pathogens in a closed hydroponic system. J. Hortic. Sci. Biotechnol. 84 (5): 489–494.
Kowalska J., Remlein-Starosta D., Drożdżyński D. 2012. Wykorzystanie Trichoderma asperellum w ekologicznej uprawie truskawek. [Using of Trichoderma asperellum in organic strawberry production]. Prog. Plant Prot./Post. Ochr. Roślin 52 (2): 351–353.
Mastouri F., Björkman T., Harman G.E. 2010. Seed treatment with Trichoderma harzianum alleviates biotic, biotic, and physiological stresses in germinating seeds and seedlings. Phytopathology 100 (11): 1213–1221.
Nederloff E. 2001. Biological control of root diseases – especially with Trichoderma. Grower 56 (5): 24–25.
Ozbay N., Newman S.E. 2004. The effect of the Trichoderma harzianum strains on the growth of tomato seedlings. p. 131–135. Proc. XXVI IHC – Managing Soil-Borne Pathogens (A. Vanachter, ed.). Acta Hort., 635 pp.
Perek A., Świerczyńska I. 2012. Wpływ fungicydów na antagonizm grzybów Trichoderma viride i Fusarium spp. w warunkach in vitro. [Influence of fungicides on antagonism of fungi Trichoderma viride and Fusarium spp. under in vitro conditions]. Prog. Plant Prot./Post. Ochr. Roślin 52 (4): 1038–1041.
Sivan B., Elad Y., Chet I. 1984. Biological control effects of a new isolate of Trichoderma harzianum on Pythium spp. Phytopathology 74: 498–503.
Sadowski Cz., Pańka D., Lenc L., Domoradzki M. 2005. Badania nad możliwością wykorzystania biopreparatów do otoczkowania nasion warzyw ekologicznych. [Research on possibility of biopreperations for organic vegetable seed coating]. Prog. Plant Prot./Post. Ochr. Roślin 45 (2): 1055–1057.
Sobolewski J., Robak J., Ostrowska A., Gidelska A., Janas R. 2010. Weryfikacja aktualnego stanu zabezpieczenia siewek wybranych gatunków roślin warzywnych przed patogenami. [Verification state of seed protection of selected vegetable plants against seed borne pathogenes]. Prog. Plant Prot./Post. Ochr. Roślin 50 (2): 741–747.
Thompson T.B., Athew K.L., Laviolette F.A. 1971. The effect of temperature on the pathogenicity of Pythium spp., P. debaryanum and P. ultimum on soybean. Phytopathology 61: 933–935.
Weber Z., Weber M., Frużyńska-Jóźwiak D. 2001. Przeżywalność grzybów z rodzaju Trichoderma w biopreparatach z różnymi nośnikami i ich skuteczność w ochronie roślin przed Fusarium oxysporum. [Surviving of Trichoderma fungi in bioproducts with different inactive ingredients and their efficacy in plant protection against Fusarium oxysporum]. Prog. Plant Prot./Post. Ochr. Roślin 41 (2): 769–772.
