ANNA SECEWICZ1 | ADAM JUNKA1 | PIOTR BARĆ3 | MARTA RZESZUTKO4 | WOJCIECH RZESZUTKO4 | ADAM DOMANASIEWICZ3
WPŁYW SIECI WIĘKSZEJ
OMENTUM MAJUS NA REDUKCJĘ BIOFILMU
BAKTERYJNEGO Z IMPLANTÓW WPROWADZONYCH DO JAM
BRZUSZNYCH SZCZURÓW LABORATORYJNYCH
IMPACT OF OMENTUM MAJUS ON IMPLANTFORMED BIOFILM REDUCTION IN ABDOMINAL CAVITIES
OF LABORATORY RATS
STRESZCZENIE: Zakażenia związane z obecnością biofilmu stanowią 60–80% wszystkich in-fekcji szpitalnych. Wysoka tolerancja biofilmu na środki przeciwdrobnoustrojowe, antyseptyki i antybiotyki skłania do poszukiwania nowych rozwiązań terapeutycznych. W niniejszej pracy przedstawiono analizę zdolności uszypułowanej sieci większej, traktowanej jako prototypowy autogenny opatrunek wewnętrzny, do eradykacji biofilmu bakteryjnego Staphylococcus
au-reus i Klebsiella pneumoniae z jam brzusznych szczurów rasy Wistar. Uzyskane wyniki wskazują
na zdolność sekwestracyjną sieci, ale nie na jej aktywność przeciwdrobnoustrojową.
SŁOWA KLUCZOWE: biofilm, Klebsiella pneumoniae, sieć większa, Staphylococcus aureus, za-każenia wewnętrzne
ABSTRACT: Biofilm-related infections are considered 60–80% of all nosocomial infections. High biofilm tolerance of such antimicrobials towards antiseptics and antibiotics is the reason why new therapeutic approaches are developed. In the present study, the analysis of the pe-dunculated omentum majus’s, ability to eradicate Staphylococcus aureus and Klebsiella
pneu-moniae biofilm from abdominal cavity of laboratory Wistar rats was performed. The
pedun-culated omentum majus was treated as a prototypic autogenic internal dressing. Obtained re-sults indicate that the omentum majus possesses an ability to sequestrate but not to kill ana-lyzed biofilms.
KEY WORDS: abdominal infections, biofilm, Klebsiella pneumoniae, omentum majus,
Staphy-lococcus aureus
1 Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej i Parazytologii Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu
2 Dolnośląski Szpital Specjalistyczny im. T. Marciniaka – Centrum Medycyny Ratunkowej we Wrocławiu
3 Uniwersytecki Szpital Kliniczny we Wrocławiu 4 Zakład Patomorfologii Uniwersytetu
Medycznego we Wrocławiu
} MARZENNA BARTOSZEWICZ
Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej i Parazytologii,
Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu, ul. Borowska 211a, 50-534 Wrocław, Tel.: 71 784 05 10, e-mail: marzenna.bartoszewicz@umed.wroc.pl Wpłynęło: 20.02.2017 Zaakceptowano: 15.03.2017 DOI: dx.doi.org/10.15374/FZ2017030
WSTĘP
Większość infekcji szpitalnych jest wywoływanych przez drobnoustroje w formie biofilmowej. Odkrycie tego fak-tu zmieniło oblicze współczesnej mikrobiologii klinicznej i medycyny.
Biofilm to złożona społeczność drobnoustrojów, cechują-ca się wysoką zdolnością adaptacyjną i opornością na dzia-łanie komponentów układu immunologicznego oraz wyso-ką tolerancją na antybiotyki, antyseptyki i środki dezynfek-cyjne [1]. Może występować w formie osiadłej (przylegają-cej do powierzchni – tkanki lub biomateriału) albo w for-mie tzw. dryfującej, tworzącej się na styku powierzchni
ciecz/powietrze (ang. floating biofilms) [2]. Struktu-ra ta składa się z warstw komórek drobnoustrojów pokry-tych zewnątrzkomórkową macierzą (śluzem), której skład chemiczny różni się w zależności od gatunków patogenów ją produkujących oraz warunków zewnętrznych (tempera-tury, dostępu do tlenu, składników odżywczych, powierzch-ni, obecności płynów ustrojowych itd.) panujących w niszy zasiedlanej przez bakterie. Zmniejszona lub wręcz zatrzy-mana aktywność metaboliczna drobnoustrojów w najniż-szych, podstawnych warstwach biofilmu odpowiada za ich wysoką tolerancję na środki przeciwdrobnoustrojowe [3]. Przysparza to wiele istotnych problemów terapeutycznych, szczególnie w sytuacji, gdy do utworzenia biofilmu dojdzie
wewnątrz organizmu pacjenta. W takiej sytuacji nie można stosować antyseptyków (z racji cytotoksyczności wykazy-wanej przez te związki względem większości komórek two-rzących organy wewnętrzne), a stężenia osiągane przez an-tybiotyki podawane dożylnie lub pozajelitowo są zbyt ni-skie, by doprowadzić do eradykacji drobnoustrojów w for-mie biofilmowej [4, 5]. Szacuje się, że minimalne wartości hamujące wzrost (ang. minimal inhibitory concentration – MIC) biofilmu są od kilkunastu do kilku tysięcy razy wyż-sze, niż wynikałoby to z wyników uzyskanych za pomocą standardowych metod oceny lekowrażliwości stosowanych w laboratoriach klinicznych [6, 7]. Jednym z rozwiązań tego problemu jest miejscowe stosowanie wysokich stężeń an-tybiotyków uwalniających się z różnego rodzaju nośni-ków wprowadzanych chirurgicznie do organizmu pacjen-ta (np. opatrunków kolagenowych wysyconych genpacjen-tamycy- gentamycy-ną), jednakże wiąże się to z możliwością wystąpienia reak-cji niepożądanych na skutek stosowania materiału ksenoge-nicznego (w tym wypadku kolagenu zwierzęcego) oraz z ry-zykiem rozwoju efektów cytotoksycznych [8, 9]. Dlatego też standardem w leczeniu przewlekłych, zainfekowanych ubyt-ków tkanek miękkich i zapaleń kości pozostaje chirurgicz-ne opracowanie rany, polegające na usunięciu martwiczych zainfekowanych tkanek i pokryciu ubytku odpowiednio do-branym przeszczepem wolnym lub dobrze unaczynionym płatem pełniącym rolę uzupełnienia (opatrunku autogenne-go) [10]. Tego typu płaty powinny cechować się także zdol-nością do hamowania (sekwestracji) rozprzestrzeniania się drobnoustrojów.
Sieć większa (omentum majus) – czyli zdwojona blasz-ka otrzewnej, zwisająca z krzywizny większej żołądblasz-ka i two-rząca tzw. fartuch pokrywający od przodu pętle jelitowe – spełnia wyżej wymienione kryteria. Pełni funkcje obron-ne (źródło komórek immunokompetentnych) oraz posiada zdolność absorpcji wysięku zapalnego, a jako struktura sil-nie unaczyniona zapewnia dostęp tlenu i substancji odżyw-czych do gojących się narządów oraz tkanek [11]. Spekuluje się także, że omentum majus posiada właściwości przeciw-drobnoustrojowe dzięki wydzielaniu małych, przeciwbakte-ryjnych peptydów [12].
Istnieją także doniesienia o zastosowaniu klinicznym trans-ponowanej uszypułowanej sieci większej np. w leczeniu mar-twicy mostka z zakażeniem śródpiersia [13]. Ponieważ w opi-sywanym przypadku doświadczenia kliniczne polegające
na zastosowaniu omentum majus w roli tzw. żywego opatrun-ku wyprzedzają wiedzę z dziedziny podstawowej, celem niniej-szej pracy jest ocena zdolności sieci więkniniej-szej do eradykacji bio-filmu bakteryjnego Staphylococcus aureus i Klebsiella pneumo-niae z jam brzusznych szczurów rasy Wistar.
MATERIAŁY I METODY
Badaniu poddano zwierzęta laboratoryjne – 100 samic szczurów rasy Wistar o masie średniej wynoszącej 400 g.
Jako implant zastosowano: monofilamentową siatkę poli-propylenową (Polhernia), silikonową protezę ścięgna (Gal-med) oraz śrubę korową samogwintującą (Arno-Med).
Do celów eksperymentalnych wykorzystano szczepy bakteryjne wchodzące w skład kolekcji szczepów Zakładu Mikrobiologii Farmaceutycznej i Parazytologii Uniwersyte-tu Medycznego we Wrocławiu – Staphylococcus aureus S1 i Klebsiella pneumoniae K66 – cechujące się wysoką zdol-nością do tworzenia biofilmu i wykorzystane we wcześniej-szych pracach eksperymentalnych Autorów [14, 15].
ZDOLNOŚĆ BADANYCH SZCZEPÓW BAKTERYJNYCH
DO TWORZENIA BIOFILMU NA UŻYTYCH
BIOMATERIAŁACH
METODA RICHARDSADwudziestoczterogodzinną zawiesinę badanego szczepu doprowadzano do gęstości 0,5 MF i inkubowano w obecno-ści implantu i 1% TTC (ang. triphenyl tetrazolium chloride) przez 24 godziny w temperaturze 37°C. Po upływie czasu in-kubacji, implant przepłukiwano 3×0,9% NaCl w celu usunię-cia niezwiązanych bakterii z jego powierzchni. Czerwone za-barwienie profilu, będące wynikiem redukcji TTC do czer-wonego formazanu, służyło potwierdzeniu zdolności szcze-pów do tworzenia biofilmu. Siłę tworzenia tej struktury bak-teryjnej oceniano według skali przedstawionej w Tabeli 1.
POSIEW ILOŚCIOWY BAKTERII TWORZĄCYCH
BIOFILM NA BIOMATERIALE
Badane szczepy rosnące na podłożach stałych prze-niesiono do odpowiednich podłoży płynnych (TSB dla
Siła adhezji Opis Klasyfikacja
Silna adhezja Całe pole biomateriału uległo silnemu
zabarwieniu
+++ lub 3+ Umiarkowany poziom adhezji Całe pole biomateriału uległo zabarwieniu ++ lub 2+
Słaba adhezja Punktowe zmiany zabarwienia + lub 1+
Brak adhezji Brak różnic w zabarwieniu względem jałowego
implantu
0
Tabela 1. Kryteria oceny stopnia adhezji bakte-ryjnej do biomateriału. Opracowano na podsta-wie [14].
K. pneumoniae, BC dla S. aureus) i inkubowano w tempera-turze 37°C przez 24 godziny, w warunkach tlenowych, bez wytrząsania.
Po upływie czasu inkubacji, gęstość zawiesiny bakte-ryjnej ustalono densytometrycznie na 3×108 komórek/ml.
Do tak przygotowanych zawiesin wprowadzono implant i poddawano kolejnej inkubacji w 37°C. Po 24 godzinach implant przepłukano intensywnie 0,9% NaCl w celu pozby-cia się z jego powierzchni niezwiązanych lub luźno zadhe-rowanych bakterii, a następnie przeniesiono do 1 ml łagod-nego detergentu – 0,5% saponiny – i poddano mechanicz-nemu wytrząsaniu (trwającemu minutę) w celu uwolnienia komórek bakteryjnych z warstw śluzu tworzącego biofilm. 100 μl uzyskanego lizatu posiano ilościowo na odpowied-nie podłoże stałe (McConkey dla K. pneumoniae i Columbia Agar dla S. aureus), wykorzystując technikę seryjnych roz-cieńczeń. Po 24-godzinnej inkubacji w 37°C zliczono licz-bę kolonii bakteryjnych na płytce. Wynik podano jako CFU (ang. colony forming unit) całkowite, a wartość obliczono ze wzoru:
CFU całkowite = liczba kolonii × 10 N+1 gdzie: N = numer rozcieńczenia, w którym wyrosły szcze-py bakteryjne; +1 = rozcieńczenie 10-krotne (0,1 ml z 1 ml saponiny).
PROCEDURA WSZCZEPIENIA IMPLANTÓW
Implanty opłaszczone biofilmem wprowadzono chirur-gicznie do jam otrzewnowych szczurów z grupy kontrolnej I (n=30). Grupę kontrolną II stanowiły szczury, do których jam otrzewnowych lub sieci większej wprowadzano jałowe implanty (n=30); natomiast do grupy kontrolnej III włą-czono gryzonie, u których wykonano operację typu sham (n=10). Grupę badaną stanowiły szczury, u których implant opłaszczony biofilmem wprowadzono do omentum majus (n=30).
PROCEDURA WPROWADZENIA I WYJĘCIA
IMPLANTÓW ORAZ POBRANIA NARZĄDÓW
DO BADAŃ HISTOPATOLOGICZNYCH
Po wykonanym zabiegu szczury z grup kontrolnych i grupy badanej przeniesiono do klatek hodowlanych. Po 2, 5, 9, 14 lub 30 dniach zwierzęta usypiano zgodnie z wytycz-nymi Dobrej Praktyki Laboratoryjnej oraz wymogami Ko-misji Bioetycznej.
Wszystkie zwierzęta na czas zabiegu zostały znieczulone dootrzewnowo pentobarbitalem (w dawce 15 mg/kg masy ciała). Następnie dezynfekowano ich skórę roztworem chlor-heksydyny w 10% alkoholu etylowym. Dodatkowo miejsce operacji znieczulano nasiękowo 0,2% roztworem lignoka-iny. Po przecięciu skóry wycinano owalny otwór obejmu-jący mięśnie, powięzie oraz otrzewną. Implanty wyciągano
chirurgicznie, a liczbę drobnoustrojów oceniano techni-ką posiewów ilościowych (tak jak opisano to we wcześniej-szej części pracy). Po wykonaniu zabiegu wyjęcia implan-tów, z ciał szczurów pobierano narządy do badań histopa-tologicznych (nerki, płuca, sieć większą, trzustkę, śledzio-nę). Organy zanurzano w roztworze utrwalacza (formaliny) i przechowywano w celu dalszych analiz.
OCENA HISTOPATOLOGICZNA
Wykonano standardową ocenę histopatologiczną narzą-dów pobranych od szczurów z grup kontrolnych oraz ba-danej. Badane organy wprowadzono do stężonego roztworu etanolu w celu odwodnienia próbki, następnie do roztwo-ru ksylenu i do płynnej parafiny. Po kilkunastu godzinach odwodnioną i utwardzoną próbkę zalewano parafiną w celu uzyskania bloczku, który pocięto mikrotomem na skraw-ki o grubości skraw-kilku mikrometrów. Skrawskraw-ki przeniesiono na szkiełka mikroskopowe i poddano procesowi barwienia za pomocą hematoksyliny i eozyny. Tak przygotowane prób-ki poddawano analizie mikroskopowej.
ANALIZA STATYSTYCZNA
Do analizy statystycznej wykorzystano oprogramowa-nie GraphPad Prism 5 i testy Kruskalla-Wallisa oraz test chi-kwadrat. Przyjęto poziom istotności statystycznej p≤0,05.
Na przeprowadzenie badań na zwierzętach uzyskano zgodę I Lokalnej Komisji Etycznej do Spraw Doświadczeń na Zwierzętach we Wrocławiu (w ramach grantu N N401 038138; Uchwała 42/2009).
WYNIKI
Badane szczepy bakteryjne cechowały się zdolnością do tworzenia biofilmu na użytych biomateriałach, co wy-kazano metodą Richardsa oraz metodą posiewów ilościo-wych. Średnia wartość CFU na implantach wprowadzanych do sieci/jam otrzewnowych szczurów wynosiła 3,8±21×107
i 5,2±3,1×1×106 (odpowiednio w przypadku Staphylococcus
i Klebsiella). Badane szczepy wykazywały zdolność redukcji TTC do czerwonego formazanu na najwyższym poziomie w skali (+++). Zdolność do tworzenia biofilmu zaobserwo-wana u S. aureus i K. pneumoniae była zbliżona, nie stwier-dzono różnic istotnych statystycznie w zależności od rodza-ju implantu (test Kruskalla-Wallisa; p>0,05). Zmiany w war-tościach liczby komórek tworzących struktury biofilmowe – w zależności od miejsca wprowadzenia implantu, czasu, który upłynął od implantacji oraz gatunku drobnoustroju – przedstawiono na Ryc. 1.
Uzyskane wyniki wskazują, że sieć mniejsza nie cechu-je się aktywnością przeciwdrobnoustrojową względem
biofilmu wytworzonego przez S. aureus. Biofilm tego drob-noustroju wprowadzony do jamy otrzewnowej szczurów (grupa kontrolna) eradykowany był w sposób istotny staty-stycznie (test Kruskalla-Wallisa; p>0,05) szybciej od biofil-mu wprowadzonego do sieci większej w dobie kolejno: 2., 5., 9. oraz 14. W dobie 30. obserwowane różnice w wartościach CFU nie były istotne statystycznie. W przypadku struktur biofilmowych wytworzonych przez K. pneumoniae, od 5. do 30. doby od rozpoczęcia eksperymentu, do eradykacji dochodziło w sposób równie skuteczny, niezależnie od tego, czy implant wprowadzony był do sieci większej, czy do jamy otrzewnowej. Jednakże zastosowanie omentum majus nie doprowadziło do całkowitej eradykacji Klebsiella pneumo-niae z organizmów szczurów, komórki tego drobnoustroju były wykrywane zarówno na implancie, jak i na otaczającej go sieci większej również w 30. dobie badania.
Analiza histopatologiczna zmian zapalnych – będą-cych wynikiem obecności biofilmu bakteryjnego w śledzio-nie, trzustce, płucach, nerkach, wątrobie oraz sieci większej szczurów – wykazała nacieki limfocytarne, zapalenia małe-go, średniego i dużego stopnia, martwice oraz ropnie. Liczba
zmian patologicznych u szczurów, u których implant pokry-ty biofilmem wprowadzono w sieć, w porównaniu do licz-by zmian w grupie kontrolnej (implant pokryty biofilmem wprowadzony do jamy otrzewnowej), nie wykazywała istot-ności statystycznej (test chi-kwadrat; p≤0,05) między bada-nymi organami. Wyjątkiem były sieci większe, do których wprowadzono pokryty biofilmem implant – w tym przypad-ku liczba zmian patologicznych była w sposób istotny staty-stycznie wyższa (test chi-kwadrat; p=0,0014) w grupie kon-trolnej szczurów. Przykładowy obraz zmian patologicznych będących wynikiem obecności biofilmu w jamie brzusznej szczura przedstawiono na Ryc. 2.
OMÓWIENIE I WNIOSKI
W oparciu o uzyskane w niniejszym badaniu wyniki moż-na stwierdzić, że zastosowanie sieci większej jako aktywne-go opatrunku autologiczneaktywne-go nie przekłada się na skutecz-ną eradykację biofilmu S. aureus z jam otrzewnowych szczu-rów. W przypadku biofilmu K. pneumoniae uzyskane wyniki
Ryc. 1. Zmiany w liczbie kolonii badanych drobnoustrojów tworzących biofilm w zależności od czasu, który upłynął od implantacji, oraz miejsca wpro-wadzenia implantów. A. Implant jałowy wprowadzony do jam otrzewnowych lub sieci większej szczura. B. Implanty pokryte biofilmem K. pneumoniae wprowadzone do jam otrzewnowych lub sieci większej szczurów. C. Implanty pokryte biofilmem S. aureus wprowadzone do jam otrzewnowych lub sieci większej szczura.
B B
redukcji CFU, będące wynikiem zastosowania omentum majus, okazały się być nawet niższe w porównaniu do re-dukcji obserwowanej w grupie kontrolnej. Otrzymane dane nie potwierdzają zatem obserwacji klinicznych dowodzą-cych skutecznego użycia sieci większej w leczeniu ciężkich powikłań infekcyjnych [16–18]. Wytłumaczenie przyczyny uzyskania takich wyników wymaga z pewnością przepro-wadzenia dalszych analiz. W opisywanych w niniejszej pra-cy eksperymentach do jam otrzewnowych szczurów wpro-wadzano około 107 komórek wysoce zjadliwych patogenów.
Wbrew oczekiwaniom Autorów, u żadnego ze zwierząt nie wystąpił zgon, brak było także oznak świadczących o infek-cji krwi. Jakkolwiek w obrazie histopatologicznym widocz-ne były zmiany w organach szczurów świadczące o obecno-ści zakażenia, to były one jednak stosunkowo nieduże i nie wpływały na stan fizjologiczny zwierząt badanych (spoży-cie pokarmu, wydalanie itd.). Można założyć, że wprowa-dzenie do jamy brzusznej człowieka miliarda komórek pa-togenu w formie biofilmowej skutkowałoby po pewnym czasie ciężką niewydolnością narządową oraz/lub zgonem na skutek rozprzestrzeniającego się zakażenia [19]. Szczu-ry okazały się natomiast w wysokim stopniu oporne na ak-tywność biofilmu. Dlatego też można stwierdzić, że korzyst-ne byłoby wykonanie badań na innym modelu zwierzęcym, bardziej zbliżonym do organizmu człowieka, na przykład świńskim [20].
W dobie narastającej lekooporności drobnoustrojów za-stosowanie autogennych opatrunków może stać się realną alternatywą dla antybiotykoterapii zakażeń wewnętrznych. Dlatego, mimo iż wyniki badań laboratoryjnych zaprezen-towanych w niniejszej pracy nie są rozstrzygające, Auto-rzy są zdania, że ich kontynuacja jest wskazana i może się
Ryc. 2. Zapalenie ziarniniakowe okołotrzustkowe zaobserwowane u szczu-ra, do którego jamy brzusznej wprowadzono implant pokryty biofilmem
S. aureus i owinięto w sieć. Czerwoną linią odznaczono obszar zmieniony
patologicznie (1) od obszaru prawidłowego (2).
przyczynić do opracowania nowych opcji terapeutycznych, skutkujących zmniejszeniem liczby zakażeń oraz poprawą stanu pacjentów.
KONFLIKT INTERESÓW: nie zgłoszono.
DEKLARACJA PRZEJRZYSTOŚCI: badanie sfinansowano ze środków grantu Naro-dowego Centrum Nauki: N N401 038138.
PIŚMIENNICTWO
1. Flemming HC, Wingender J, Szewzyk U. Biofilm Highlights. Vol. 5. Springer- -Verlag, Berlin/Heidelberg, 2008.
2. Jung YG, Choi J, Kim SK, Lee JH, Kwon S. Embedded biofilm, a new biofilm model based on the embedded growth of bacteria. Appl Environ Microbiol 2015;81(1):211– 219.
3. McDougald D, Rice SA, Barraud N, Steinberg PD, Kjelleberg S. Should we stay or should we go: mechanisms and ecological consequences for biofilm di-spersal. Nat Rev Microbiol 2011;10(1):39– 50.
4. Wolcott R, Dowd S, Kennedy J, Jones C. Biofilm based wound care. Adv Wo-und Care 2010;1(3):311– 318.
5. Shunmugaperumal T. Biofilm Eradication and Prevention. A Pharmaceutical Approach to Medical Device Infections. John Wiley & Sons, Hoboken, 2010. 6. Wolcott RD, Rhoads DD. Study of biofilm – based wound management in
subjects with critical limb ischaemia. J Wound Care 2008;17(4):145– 155. 7. Lebeaux D, Ghigo JM, Beloin C. Biofilm-related infections: bridging the gap
between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance to-ward antibiotics. Microbiol Mol Biol Rev 2014;78(3):510– 543.
8. Hwang MR, Kim JO, Lee JH et al. Gentamicin-loaded wound dressing with polyvinyl alcohol/dextran hydrogel: gel characterization and in vivo healing evaluation. AAPS PharmSciTech 2010;11(3):1092– 1103.
9. Müller G, Kramer A. Biocompatibility index of antiseptic agents by parallel as-sessment of antimicrobial activity and cellular cytotoxicity. J Antimicrob Che-mother 2008;61(6):1281– 1287.
10. Levy Y, Miko I, Hauck M, Mathesz K, Furka I, Orda R. Effect of omental angioge-nic lipid factor on revascularization of autotransplanted spleen in dogs. Eur Surg Res 1998;30(2):138−143.
11. Seitz IA, Williams CS, Wiedrich TA, Henry G, Seiler JG, Schechter LS. Omental free-tissue transfer for coverage of complex upper extremity and hand de-fects − the forgotten flap. Hand 2009;4(4):397−405.
12. Liebermann-Meffert D. The greater omentum. Anatomy, embryology, and surgical applications. Surg Clin North Am 2000;80(1):275– 293.
13. Jakubaszko J, Domanasiewicz A, Marczak A, Kustrzycki W. Use of the
omen-tum majus in the therapy of postoperative sternal necrosis. Kardiochir
Tora-kochir Pol 2011 ;8(2):272– 275.
14. Mączyńska B, Smutnicka D, Przondo-Mordarska A et al. Biofilm formation by clinical Klebsiella strains expressing various types of adhesins on catheters made of different materials. Adv Clin Exp Med 2010;19(4):443– 453. 15. Bartoszewicz M, Junka A, Smutnicka D et al. Porównanie skuteczności
prze-ciwdrobnoustrojowej antyseptyków zawierających oktenidynę i etakrydynę względem biofilmu tworzonego przez szczepy S. aureus i P. aeruginosa izolo-wane z zakażeń ran przewlekłych. Leczenie Ran 2012;9(4):147– 152. 16. Singh AK, Patel J, Litbarg NO et al. Stromal cells cultured from
omtum express pluripotent markers, produce high amounts of VEGF, and
en-graft to injured sites. Cell Tissue Res 2008;332(1):81– 88.
17. Shimotsuma M, Shields JW, Simpson-Morgan MW et al. Morpho-physiolo-gical function and role of omental milky spots as omentum-associated lym-phoid tissue (OALT) in the peritoneal cavity. Lymphology 1993;26(2):90– 101. 18. Goldsmith HS, Griffith AL, Kupferman A, Catsimpoolas N. Lipid angiogenic
factor from omentum. JAMA 1984;252(15):2034−2046.
19. Diament D, Salomão R, Rigatto O et al. Guidelines for the treatment of seve-re sepsis and septic shock – management of the infectious agent – diagno-sis. Rev Bras Ter Intensiva 2011;23(2):134– 144.
20. Bassols A, Costa C, Eckersall PD, Osada J, Sabrià J, Tibau J. The pig as an ani-mal model for human pathologies: a proteomics perspective. Proteomics Clin Appl 2014;8(9– 10):715– 731.