ZAKAŻENIE MIEJSCA OPEROWANEGO W OBRĘBIE IMPLANTÓW URAZOWO-ORTOPEDYCZNYCH
Barański M, Sadowski JOddział Zakażeń Narządu Ruchu Kliniki Traumatologii i Ortopedii Centralnego Szpitala Klinicznego MON, Wojskowy Instytut Medyczny w Warszawie
Wstęp Zakażenie miejsca operowanego (ZMO) jest jednym z najpoważniejszych powikłań u chorych z obrażeniami mnogimi. ZMO powoduje wydłużenie czasu hospitalizacji, znacznie zwiększa koszty leczenia, a także może stanowić bez-pośrednie zagrożenie życia dla chorego. Celem pracy była analiza flory bakteryjnej powodującej zakażenia miejsca opero-wanego u chorych po implantacji wszczepów urazowo-ortopedycznych i stosowane metody leczenia. Materiał i metody Retrospektywnej analizie poddano historie chorób 31 pacjentów z obrażeniami mnogimi, leczonych w latach 2011–2012 z powodu ZMO w Oddziale Zakażeń Narządu Ruchu Kliniki Traumatologii i Ortopedii. Wyniki W analizowanym mate-riale dominowała flora mieszana – 18 (58%). Najczęściej izolowano bakterie Gram-ujemne, w szczególności
Acinetobac-ter baumanii – 16 (29,6%) i Pseudomonas aeruginosa – 5 (9,3%). Udział flory Gram-dodatniej, która dotychczas
domino-wała jako przyczyna powikłań septycznych w obrębie narządu ruchu, był znacznie mniejszy. Dodatkowo w tej grupie za-uważalna była przewaga bakterii z grupy enterokoków – Enterococcus faecalis (10, 18,5%), a nie jak dotychczas gronkow-ców – Staphylococcus aureus (6, 11%), Staphylococcus epidermidis (3, 5,6%). W postępowaniu chirurgicznym, w przypad-ku stabilnych zespoleń bez cech obluzowania implantu, usuwano tkanki martwicze, dokładnie oczyszczano okolicę wszcze-pu z jego pozostawieniem i drenażem miejsca operowanego. W kwalifikujących się przypadkach (wrażliwość drobnoustro-ju na gentamycynę) stosowano dodatkowo antybiotykoterapię miejscową (gąbka kolagenowa z garamycyną). Niestabilne zespolenia wewnętrzne były usuwane i wykorzystywano stabilizację zewnętrzną. W naszej ocenie skuteczne są zewnętrz-ne stabilizatory wielopłaszczyznowe, które cechują się możliwością wtórsą zewnętrz-nej korekcji ustawienia odłamów bez potrzeby ko-lejnych znieczuleń chorego oraz dają dobry dostęp do miejsca operowanego, umożliwiając gojenie ran i wykonywanie za-biegów rekonstrukcyjnych na skórze i tkance podskórnej. Wnioski Najczęściej rozpoznawano zakażenia w okresie ostrym z głównym udziałem flory bakteryjnej Gram-ujemnej i mieszanej. Uwagę zwraca spadek zakażeń gronkowcami. Monitoro-wanie czynników etiologicznych zakażeń ma kluczową rolę w leczeniu antybiotykami, co bezpośrednio przekłada się na po-wodzenie leczenia chirurgicznego. Kluczową rolę w leczeniu antybiotykami odgrywa znajomość czynników etiologicznych i aktywnych wobec nich antybiotyków. Leczenie chirurgiczne w przypadku braku cech destabilizacji zespolenia załama-nia ogranicza się do dokładnego oczyszczezałama-nia pola operacyjnego z martwicy do makroskopowo żywych tkanek i dąży się
VIII OGÓLNOPOLSKIE SYMPOZJUM
Z CYKLU „BIOFILM TWORZONY PRZEZ
DROBNOUSTROJE W PATOGENEZIE
ZAKAŻEŃ”
„ZAKAŻENIA ZWIĄZANE Z INWAZYJNYMI
PROCEDURAMI MEDYCZNYMI – BEZPIECZEŃSTWO
I ANTYBIOTYKOTERAPIA”
KUDOWA ZDRÓJ, 5–7 LISTOPADA 2015
STRESZCZENIA ZGŁOSZONE DO 26 PAŹDZIERNIKA 2015 ROKU*
do zamknięcia nimi kości. U chorych z obluzowaniem zespolenia złamania usuwa się je i stosuje stabilizatory zewnętrzne wielopłaszczyznowe, zapewniające dobrą stabilizację odłamów, możliwość korekcji ustawienia odłamów bez potrzeby ko-lejnych znieczuleń chorego, dającą dobrą dostępność do chorej kończyny, umożliwiając gojenie ran i wykonanie zabiegów rekonstrukcyjnych na skórze i tkance podskórnej.
Słowa kluczowe: zakażenie miejsca operowanego, zakażenia w ortopedii i traumatologii
AKTYWNOŚĆ PEPTYDÓW PRZECIWDROBNOUSTROJOWYCH WOBEC BIOFILMU
CANDIDA ALBICANS
Bauer M, Jaśkiewicz M, Orłowska M, Neubauer D, Kamysz W
Katedra i Zakład Chemii Nieorganicznej Wydziału Farmaceutycznego Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego
Wstęp Częstość występowania ciężkich infekcji grzybiczych znacząco wzrosła w przeciągu ostatnich dwudziestu lat. W znacznej mierze infekcje te dotyczą pacjentów z obniżoną odpornością, w szczególności chorych onkologicznych, po przeszczepach czy też osób z AIDS. Candida albicans jest najczęściej izolowanym szczepem grzybiczym i obecnie jest jednym z głównych drobnoustrojów odpowiedzialnych za zakażenia szpitalne. Trudność w terapii infekcji wywołanych przez C. albicans determinowana jest nie tylko rosnącą opornością na dotychczas stosowane antybiotyki, lecz także zdolno-ścią tworzenia biofilmu. Wytwarzanie tej złożonej struktury chroni komórki mikroorganizmów przed szkodliwym działa-niem antybiotyków oraz pozwala na skuteczną kolonizację tkanek i materiałów medycznych wykorzystywanych w lecznic-twie. Zakażenia C. albicans dotyczą przede wszystkim: jamy ustnej, paznokci i przestrzeni międzypalcowych stóp oraz dróg rodnych kobiet. Często dochodzi także do rozwoju grzybiczego zapalenia rogówki, co w wielu przypadkach ma związek ze stosowaniem soczewek kontaktowych. Zakażenia ogólnoustrojowe wspomnianym szczepem grzybiczym często są na-stępstwem powstawania biofilmu na cewniku urologicznym lub donaczyniowym. Zapobieganie tworzeniu tej struktury na biomateriałach przy zastosowaniu standardowych środków antyseptycznych często bywa nieefektywne. Terapia infekcji związanych z obecnością biofilmu niejednokrotnie nie przynosi oczekiwanych efektów terapeutycznych. Peptydy przeciw-drobnoustrojowe (ang. antimicrobial peptides – AMPs) stanowią obiecującą grupę związków, których mechanizm działa-nia oparty jest na niszczeniu błony komórkowej drobnoustrojów, co może minimalizować ryzyko powstadziała-nia oporności. Cel pracy Celem niniejszej pracy było zbadanie aktywności peptydów przeciwdrobnoustrojowych wobec biofilmu formowane-go przez C. albicans, wykorzystując różne modele badawcze. Materiał i metody W toku badań wykorzystano szczep referen-cyjny Candida albicans ATCC 10231 i następujące peptydy przeciwdrobnoustrojowe: CAMEL, citropinę 1.1, tachylpezynę 3, temporynę A, lipopeptydy Pal-KK-NH2 i Pal-RR-NH2 oraz konwencjonalne antybiotyki przeciwgrzybicze: amfoterycy-nę B i nystatyamfoterycy-nę. W pierwszym etapie zweryfikowano aktywność przeciwgrzybiczą badanych związków. W tym celu wyzna-czono wartości minimalnego stężenia hamującego wzrost (ang. minimal inhibitory concentration – MIC). Badania prze-prowadzono przy wykorzystaniu dwóch pożywek: Sabouraud oraz RPMI 1640. Następnie zweryfikowano aktywność wy-branych związków wobec biofilmu poprzez oznaczenie najniższego stężenia eradykującego biofilm (ang. minimal biofilm eliminating concentration – MBEC). Biofilm tworzony był na powierzchni 96-dołkowych płytek polistyrenowych, fragmen-tach cewnika Foley’a oraz soczewkach kontaktowych. Wizualizacja wyników była możliwa dzięki wykorzystaniu wskaźni-ka żywotności komórek – resazuryny. Jednym z kluczowych elementów eksperymentu było badanie indukcji oporności na amfoterycynę B, które zostało przeprowadzone w warunkach przepływowych w oparciu o technologię „lab-on-a-chip”. Wyniki Uzyskane wartości MIC dla obydwu użytych pożywek różniły się znacząco dla badanych peptydów oraz lipopep-tydów. Natomiast aktywność antybiotyków konwencjonalnych była porównywalna. MBEC wyznaczone dla antybiotyków i peptydów w stosunku do biofilmu powstałego na powierzchni fragmentów cewnika urologicznego i soczewkach kontak-towych jest znacznie wyższe w porównaniu do wyników uzyskanych z wykorzystaniem płytek polistyrenowych. W przy-padku biomateriałów zauważono niewielką różnicę w aktywności badanych związków w zależności od wykorzystanej po-żywki. Trudniejszy w eradykacji okazał się biofilm uformowany na powierzchni soczewek kontaktowych. Najwyższą aktyw-ność uzyskano dla lipopeptydów w stosunku do biofilmu utworzonego na fragmentach cewnika z wykorzystaniem RPMI 1640 (64 μg/mL). Testy indukcji oporności pokazały, iż eradykacja biofilmu C. albicans, tworzonego przez szczepy trakto-wane podprogowymi stężeniami amfoterycyny B, jest znacznie utrudniona. Wnioski Wysoka aktywność badanych związ-ków wobec biofilmu, w szczególności na biomateriałach, sugeruje, iż mogą one znaleźć zastosowanie w eradykacji C.
albi-cans. Różnice w aktywności w różnych pożywkach wskazują na konieczność udoskonalania metod badawczych
na biofil-mie grzybiczym.
BREVIBACTERIUM CASEI – NOWY PATOGEN ODCEWNIKOWYCH ZAKAŻEŃ KRWI?
Jermakow K1, Paściak M2, Pajączkowska M1, Nowicka J1
1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Uniwersytetu Medycznego im. Piastów Śląskich we Wrocławiu 2 Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu
Wstęp Odcewnikowe zakażenia krwi stanowią poważny problem na oddziałach długoterminowej opieki medycznej. Cewniki naczyniowe i wkłucia umożliwiają prowadzenie długotrwałej terapii dożylnej oraz żywienia pozajelitowego; za-pewniają dostęp naczyniowy w zabiegach dializy, plazmaferezy itp., ratując w ten sposób życie pacjentów. Bezpośredni kon-takt wkłucia naczyniowego ze skórą powoduje, że pomimo zachowania czystości tego miejsca i przestrzegania procedur, drobnoustroje stanowiące florę fizjologiczną skóry mogą dostać się do krwioobiegu i stanowić przyczynę odcewnikowych zakażeń krwi. Materiał i metody Przeanalizowano 29 przypadków izolacji z próbki krwi pobranej na posiew, szczepów zali-czanych do flory skóry o niskim potencjale chorobotwórczości. W większości były to różne gatunki Micrococcus
(Micrococ-cus luteus, Micrococ(Micrococ-cus lylae) oraz trzy szczepy Kocuria kristinae. Wszystkie szczepy poddano ponownej identyfikacji
z za-stosowaniem metody spektrometrii MALDI-TOF (ang. matrix-sssisted laser desorption/ionization-time of flight) w syste-mie MALDI BioTyper. Wybrane szczepy bakteryjne pochodziły z próbek krwi pacjentów Oddziału Neonatologicznego, He-matologiczno-Onkologicznego oraz Anestezjologii i Intensywnej Terapii Szpitala Klinicznego. Wyniki Spośród wybranych 29 szczepów, aż 10-krotnie (35%) zmieniono identyfikację drobnoustroju. Dwukrotnie zmiana dotyczyła nazwy gatunko-wej, ale bez zmiany przynależności do rodzaju (Micrococcus lylae zidentyfikowano w systemie MALDI BioTyper jako
Micro-coccus luteus). Pozostałe 8 przypadków dotyczyło zmiany przynależności do rodzaju: dwukrotnie Kocuria okazała się
szcze-pem Staphylococcus, raz szczep Kocuria zidentyfikowano jako Brevibacterium. Pozostałe 5 przypadków dotyczyło zmiany rodzaju Micrococcus na Brevibacterium. Jest to o tyle niepokojące, że Brevibacterium jest zbliżony filogenetycznie do rodza-ju Corynebacterium, a nie Micrococcus. Aż 6 na 29 badanych szczepów okazało się być Brevibacterium casei. Wnioski Trud-ności identyfikacyjne w rutynowo stosowanych metodach identyfikacji bakterii stanowią częsty problem diagnostyczny. Tymczasem biochemiczna aktywność szczepów może podlegać licznym drobnym i większym zmianom, tak jak to ma miej-sce w przypadku zmiennej oporności w obrębie gatunku. Zatem opieranie identyfikacji drobnoustrojów wyłącznie na bio-chemicznych metodach identyfikacyjnych ogranicza naszą wiedzę o chorobotwórczości nowych szczepów bakteryjnych. Aż 20% testowanych szczepów (6/29) dzięki metodzie spektrometrycznej MALDI-TOF zostało zaliczone do gatunku
Bre-vibacterium casei. Planowana analiza kart pacjentów każdego wymienionego przypadku izolacji pozwoli ustalić, czy Brevi-bacterium casei był bezpośrednią przyczyną odcewnikowego zakażenia krwi i stanowi nowy oportunistyczny patogen
pa-cjentów w głębokiej immunosupresji.
Słowa kluczowe: Brevibacterium casei, identyfikacja bakterii, odcewnikowe zakażenie krwi
MECHANIZMY REGULACJI TWORZENIA BIOFILMU
PSEUDOMONAS AERUGINOSA U PACJENTÓW
Z ZESPOŁEM STOPY CUKRZYCOWEJ
Machul A, Mikołajczyk D, Heczko PB, Strus M
Pracownia Ekologii Drobnoustrojów, Katedra Mikrobiologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie
Wstęp U pacjentów z chorobami metabolicznymi pewne czynniki mogą w istotny sposób modyfikować ilość produko-wanego egzopolisacharydu (EPS) oraz jego budowę chemiczną. Do takich czynników należy zwiększony poziom glukozy czy obecność nadtlenku wodoru, który – jako drobna cząsteczka chemiczna – z dużą łatwością nie tylko przemieszcza się w głąb komórek gospodarza, lecz także przenika do złożonej struktury biofilmu. Przewlekły proces zapalny, toczący się w ra-nie cukrzycowej, powoduje pękaw ra-nie drobnych naczyń krwionośnych uwalniających znaczne ilości jonów Fe, które mogą modyfikować ilościowe zmiany wytwarzanego egzopolisacharydu. Czynnikiem redukującym tworzenie biofilmu mogą być związki polimerowe pochodzenia naturalnego, takie jak preparaty chitozanowe. Chitozan – jako związek całkowicie bio-degradowalny, nietoksyczny i biokompatybilny – wykazuje właściwości bioadhezyjne do błon śluzowych. Dzięki temu jest znakomitym biomateriałem do wielu zastosowań medycznych, m.in. w preparatach o działaniu przeciwbakteryjnym i prze-ciwgrzybiczym oraz jako materiał do kontrolowanego dozowania leków. Cel pracy Celem pracy było poznanie czynników mogących stymulować (glukoza, nadtlenek wodoru, jony Fe) oraz redukować (chitozan) tworzenie biofilmu Pseudomonas
aeruginosa w przewlekłych ranach cukrzycowych. Materiały i metody Szczepy bakteryjne Pseudomonas aeruginosa (n=6),
badawcze obejmowały 24-godzinną hodowlę bakteryjną w 96-dołkowych płytkach hodowlanych z powierzchnią adheren-cyjną w celu wytworzenia biofilmu. Żywotność bakterii zbadano metodą rozcieńczeń 10-krotnych. Pomiaru przyrostu bio-filmu dokonano poprzez zabarwienie czerwienią Kongo. Odczyty wykonano za pomocą spektrofotometru Awareness Tech-nology INC przy długości fali 492 nm. Charakterystykę struktury biofilmu prowadzono z wykorzystaniem spektrometrii masowej (MALDI-TOF) oraz spektroskopii NMR. Wyniki Przeprowadzone badania wykazały istotny wpływ narastające-go stężenia glukozy na ilościowy przyrost trójprzestrzennej struktury biofilmu przy braku znaczących różnic w strukturze tworzonego egzopolisacharydu (EPS). W składzie biofilmu wszystkich przebadanych szczepów P. aeruginosa wyróżniono: D-mannozę, D-glukozę, D-galaktozę, D-glukozaminę, D-galaktozaminę, L-arabinozę oraz L-ramnozę. Jedyne różnice do-tyczyły ilości kwasu uronowego: wzrost stężenia glukozy w pożywce hodowlanej spowodował wzrost stężenia tych kwasów w strukturze egzopolisacharydu tworzonego przez badane szczepy. Ponadto udowodniono, że zawartość żelaza w podłożu hodowlanym oraz nadtlenek wodoru mogą wpływać na ilość produkowanego bioflmu, jednak jest to cecha szczepozależna. Uzyskane wyniki badań wykazały brak wpływu stężenia glukozy, nadtlenku wodoru oraz jonów żelaza na liczebność bakte-rii P. aeruginosa w biofilmie. Dla wszystkich badanych szczepów, niezależnie od zawartości badanych związków w medium hodowlanym, liczba bakterii utrzymywała się przez cały czas trwania doświadczenia na poziomie 8–9 logarytmu. Prze-prowadzone doświadczenia potwierdziły skuteczność bakteriobójczą preparatów chitozanowych w odniesieniu do biofil-mu tworzonego u pacjentów z ranami przewlekłymi. Wnioski Poznanie wpływu nadltenku wodoru, jonów żelaza oraz glu-kozy umożliwi z większą precyzją przewidywanie kolejności zdarzeń zachodzących w przewlekłych ranach cukrzycowych, a co za tym idzie – pozwoli na podjęcie prób skutecznej walki z intensywnością wytwarzanego biofilmu przez szczepy
Pseu-domonas aeruginosa przy wykorzystaniu preparatów chitozanowych.
Słowa kluczowe: Pseudomonas aeruginosa, zespół stopy cukrzycowej
CHARAKTERYSTYKA GENETYCZNA SZCZEPÓW
ESCHERICHIA COLI IZOLOWANYCH OD PACJENTÓW
Z PRZEWLEKŁYM ZAPALENIEM ZATOK
Michalik M1, Samet A1, Nowicki B2, Nowicki S2, Hildebrandt Ł1, Dmowska-Koroblewska A1, Kur J3, Marszałek A4
1 Centrum Medyczne MML, Warszawa,
2 Nashville General Hospital at Meharry, Nashville, USA
3 Katedra Mikrobiologii Wydziału Chemiczego Politechniki Gdańskiej 4 Laboratoria Medyczne SYNEVO w Warszawie
Wstęp i Cel pracy Istotą przewlekłego zapalenia zatok (PZZ) jest nadmierna produkcja i utrudniony odpływ wydzieliny błony śluzowej. Czynnikiem sprawczym tych patologii mogą być mechaniczne blokady drożności zatok (np. polipy) lub obrzęk śluzówki na tle alergicznym lub infekcyjnym. Wśród głównych bakteryjnych czynników etiologicznych PZZ wymienia się:
Sta-phylococcus aureus, StaSta-phylococcus koagulazoujemne, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrha-lis, Pseudomonas aeruginosa oraz Nocardia sp.; a wśród drobnoustrojów beztlenowych dominują: Peptostreptococcus sp., Prevo-tella sp., Porphyromonas sp., Bacteroides sp. i Fusobacterium sp. Jak dotąd udział pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae
(a gólnie Escherichia coli) jest słabo udokumentowany w literaturze. Autorzy przedstawiają charakterystykę genetyczną 13 szcze-pów Escherichia coli, wyhodowanych z materiałów o wysokiej wartości diagnostycznej (aspiraty z zatok pobrane drogą punk-cji), izolowanych od pacjentów, u których według kryteriów AAO-HNSF (ang. American Academy of Otolaryngology – Head and Neck Surgery) rozpoznano PZZ. W każdym przypadku rozpoznanie zostało potwierdzone diagnostyką obrazową (endo-skopia zatok oraz tomografia komputerowa), badaniami histopatologicznymi oraz biochemicznymi. Autorzy przedstawiają in-terdyscyplinarny sposób diagnostyki pacjentów z podejrzeniem PZZ oraz proponują nowe schematy diagnostyczne opar-te m. in. na pobieraniu do badań materiałów o wysokiej wartości diagnostycznej (rezygnacja w wymazów na rzecz aspiratów), wsparciu diagnozy badaniami histopatologicznymi i biochemicznymi oraz oznaczaniu czynników wirulencji wyizolowanych szczepów. Materiał i metody Grupę badaną stanowiło 13 pacjentów w przedziale wiekowym od 20 do 63 lat, u których na pstawie kryteriów AAO-HNSF (ból lub uczucie ucisku w okolicy zatok, zaleganie wydzieliny w zatokach i jej utrudniony od-pływ, wydzielina o charakterze ropnym) stwierdzono PZZ. Diagnoza została potwierdzona badaniem endoskopowym, tomo-grafią komputerową oraz badaniem histopatologicznym fragmentów błony śluzowej zatok. Wywiad chorobowy pod kątem ob-jawów PZZ – od roku do czterech lat. W tym okresie w badanej grupie pacjentów stosowano od 3 do 9 różnych antybiotykote-rapii (głównie antybiotyki β-laktamowe, makrolidy oraz klindamycyna) oraz zabiegi laryngologiczne (2–4 różne), które skut-kowały jedynie krótkotrwałym złagodzeniem objawów. Materiałem, z którego wyhodowano szczepy Escherichia coli,
były aspiraty pobrane drogą punkcji zatok szczękowych i czołowych. Aspiraty po pobraniu były zabezpieczone na podłożu transportowym Amies z węglem aktywnym i transportowane do laboratorium mikrobiologicznego nie dłużej niż w czasie trzech godzin od pobrania. Posiewy hodowano przez 18–24 godziny w temperaturze 37°C w warunkach tlenowych, beztle-nowych oraz tlebeztle-nowych wzbogaconych o 5% CO2. Z każdego materiału wykonano również i oceniano preparat bezpośred-ni barwiony metodą Grama. Wyhodowane szczepy przechowywano w głębokim mrożebezpośred-niu (-80°C), zgodbezpośred-nie z procedurami obowiązującymi w laboratorium mikrobiologicznym. Genomowe DNA izolowano za pomocą komercyjnie dostępnych ze-stawów (Genomic DNA Kit, ISOLATE II Bioline). Reakcję łańcuchowej polimerazy (PCR MP) przeprowadzono według metodyki opisanej przez Krawczyk i wsp. Przynależność poszczególnych szczepów do grup filogenetycznych B1 i B2 okre-ślono zgodnie z metodyką opisaną przez Cremont i wsp. Charakterystykę genetyczną szczepów Escherichia coli wykonano przez określenie występowania 14 czynników wirulencji: F/afa/Dr (fimbrie typu F i Dr), fim (fimbrie typu I), sfaD (fimbrie typu S), papC (fimbrie typu P), hlyA (hemolizyna α), usp (białko specyficzne dla szczepów uropatogennych), cnf (cytotok-syczny czynnik nekrotyzujący), fyuA (receptor dla jersiniobaktyny), iutA (receptor dla aerobaktyny), ibeA (czynnik inwazji do śródbłonka naczyń mózgowych), iha (receptor dla enterobaktyny), focG (fimbrie typu F1C), kspMTII (otoczka typu II), Agn43 (tworzenie biofilmu). Wyniki U wszystkich 13 pacjentów stwierdzono przynajmniej trzy z czterech kryteriów PZZ, określonych przez AAO-HNSF. U wszystkich pacjentów w badaniu endoskopowym stwierdzono cechy PZZ. W badaniu hi-stopatologicznym u 7 pacjentów zaobserwowano zwiększony odsetek leukocytów obojętnochłonnych, a u 6 – zwiększony odsetek leukocytów kwasochłonnych. W badaniach biochemicznych u wszystkich osób wykryto zwiększone powyżej war-tości referencyjnych wykładniki stanu zapalnego. U wszystkich pacjentów zastosowano leczenie skojarzone: 1) FESS (funk-cjonalna endoskopia zatok) w połączeniu z (w zależności od rozpoznanych wad anatomicznych): korekcją przegrody nosa, korekcją małżowin nosowych metodą koblacji, płukaniem zatok metodą Hydrodebrider; 2) terapie przeciwbakteryjne uwzględniające parametry farmakokinetyczne i farmakodynamiczne antybiotyków, dobrą penetrację do miejsca zakażenia oraz eradykację biofilmu. Czas terapii wynosił 6–8 tygodni. Po zakończeniu terapii w kontrolnych badaniach laryngologicz-nych nie stwierdzono cech PZZ. Zarówno w wymazach kolonizacyjlaryngologicz-nych nosa, gardła, jak i w aspiratach z zatok u żadnego z pacjentów nie wyhodowano Escherichia coli. Okres obserwacji po leczeniu wynosił 3–16 miesięcy. Spośród 13 analizowa-nych szczepów E. coli 6 należało do grupy filogenetycznej B1, a 7 – do grupy B2. Według daanalizowa-nych literaturowych grupę B1 stanowią szczepy o niskiej chorobotwórczości, saprofityczne, u których stwierdza się mniej czynników wirulencji. Grupa B2 to szczepy o wysokim potencjale patogenności, u których stwierdza się znaczną liczbę genów kodujących różne czynniki wi-rulencji. W badanej grupie 13 szczepów wśród izolatów zaklasyfikowanych do grupy B1 stwierdzono statystycznie mniej czynników wirulencji niż w grupie B2, co potwierdza dane opublikowane wcześniej przez innych autorów. W żadnym z ba-danych szczepów nie stwierdzono genów dla fimbrii typu F i Dr, charakterystycznych dla szczepów uropatogennych, nato-miast w ponad połowie szczepów (7) stwierdzono gen usp, kodujący białko charakterystyczne dla szczepów uropatogen-nych. We wszystkich szczepach wykryto fimbrie typu 1, które uczestniczą w adhezji bakterii do komórek gospodarza. U 7 szczepów wykryto fimbrie typu S, u 3 – fimbrie typu P, a w jednym szczepie stwierdzono obecność genu kodującego fim-brie typu F1C. Gen kodujący hemolizynę α stwierdzono w 6 szczepach, a gen cnf, którego produktem ekspresji jest cytotok-syczny czynnik nekrotyzujący, wykryto w ponad połowie badanych szczepów (7). W badanych szczepach wykrywano rów-nież geny kodujące siderofory – jersiniobaktynę, aerobaktynę i enterobaktynę. Geny te stwierdzono odpowiednio w: 13, 8 i 9 szczepach. Dwa spośród badanych szczepów posiadały gen kspMTII, natomiast aż 12 szczepów posiadało gen Agn43, który jest genem markerowym szczepów tworzących biofilm. Wnioski Uzyskane wyniki pozwalają na postawienie tezy o różno-rodności genetycznej szczepów Escherichia coli, izolowanych od pacjentów z PZZ. Autorzy uważają, że źródłami niepowo-dzenia leczenia, a co za tym idzie przewlekłego procesu zapalnego zatok, jest brak interdyscyplinarnego podejścia do tego zagadnienia oraz wybiórcza, a nie pogłębiona i wielopłaszczyznowa diagnostyka. W przypadku przedstawionych pacjentów rozpoznanie PZZ według kryteriów laryngologicznych było wsparte badaniami dodatkowymi, a identyfikację Escherichia
coli – jako rzeczywistego czynnika etiologicznego zakażenia – oparto o badanie mikrobiologiczne materiałów o wysokiej
wartości diagnostycznej (aspiraty), a nie tylko wymazów. Zdaniem autorów dotychczasowe terapie przeciwbakteryjne nie doprowadziły do eradykacji procesu zapalnego, gdyż nie uwzględniały genetycznych cech szczepów (tworzenie biofilmu, obecność fimbrii i otoczki), dlatego w przypadku przewlekłych procesów zapalnych, których czynnikiem etiologicznym jest
E. coli, konieczne jest – oprócz oznaczania lekowrażliwości z uwzględnieniem wartości MIC – również wykrywanie
czynni-ków wirulencji metodami genetycznymi. Dopiero taka pełna charakterystyka szczepu oraz pogłębiona interdyscyplinarna diagnostyka pacjenta umożliwia dobór celowanej terapii. Należy również zaznaczyć, że genetyczna charakterystyka szcze-pów pozwala odpowiedzieć na pytanie o multigenomowy charakter infekcji oraz umożliwia epidemiologiczne monitorowa-nie zakażeń dotyczących danego drobnoustroju.
PROBLEM LEKOOPORNOŚCI W ASPERGILOZIE – ROLA BIOFILMU
Nawrot U
Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej i Parazytologii Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu
Grzyby z rodzaju Aspergillus są zaliczane do najczęstszych czynników etiologicznych grzybic układu oddechowego u cho-rych z ciężkimi niedoborami odporności, szczególnie z długotrwałą neutropenią (chorzy z nowotworami, po przeszczepach szpiku lub narządów litych). Infekcje tymi grzybami coraz częściej dotykają również inne grupy pacjentów, np. osoby z cho-robami układu oddechowego, w tym z mukowiscydozą, POChP, astmą, a także krytycznie chorych. W poszczególnych gru-pach pacjentów przebieg kliniczny aspergilozy jest różny (postacie inwazyjne, chroniczne, grzybniak itd.), przy czym naj-gorsze rokowania dotyczą postaci inwazyjnych. Obecnie lekiem pierwszego rzutu, rekomendowanym w terapii inwazyjnej aspergilozy płuc (ang. invasive aspergillosis – IA), jest worykonazol. Wybór ten wynika zarówno z właściwości farmakoki-netycznych, jak i skuteczności mikrobiologicznej, która jest szczególnie wysoka wobec Aspergillus fumigatus, gatunku któ-ry odpowiada za około 90% zakażeń. Na przeżycie pacjentów z IA znaczący wpływ mają zaawansowanie choroby podsta-wowej oraz problemy diagnostyczne skutkujące opóźnieniem wdrożenia terapii przeciwgrzybiczej. U większości chorych rozpoznanie stawiane jest na podstawie obrazu klinicznego, zmian obserwowanych w badaniach obrazowych (tomografia komputerowa płuc) oraz obecności markerów aspergilozy (mannan, glukan, DNA) w krwi i/lub BAL. Stosunkowo rzadko do badań dostępne są bioptaty tkanek, jeszcze rzadziej ich posiew skutkuje uzyskaniem hodowli i identyfikacją gatunkową patogenu. W każdym przypadku prawdopodobnej IA brak klinicznej odpowiedzi na standardową terapię jest analizowa-ny pod kątem błędnego rozpoznania, w tym zakażenia grzybami niepodatanalizowa-nymi na działanie worykonazolu. Coraz częściej zakażenia wywołują przedstawiciele sprzężniaków, np. Mucor oraz tzw. kryptogatunki Aspergillus (np. Aspergillus
lentu-lus), naturalnie oporne na triazole. Szczególnie niebezpiecznym zjawiskiem, obserwowanym z różnym nasileniem głównie
w Europie i Azji, jest pojawienie się szczepów Aspergillus fumigatus z nabytą opornością na triazole, włączając worykona-zol. Najczęstszy mechanizm oporności polega na mutacjach punktowych w genie CYP51A kodującym 14α-demetylazę la-nosterolu. Uważa się, że przyczyną selekcji mutantów TR34/L98H i TR46/Y121F/T289A jest stosowanie fungicydów w rol-nictwie. W przeprowadzonych pilotażowych badaniach 150 klinicznych izolatów Aspergillus, pochodzących z dwóch pol-skich ośrodków uniwersyteckich, wykryto zaledwie 2,6% (4 izolaty) szczepów z mechanizmem TR34/L98H. Ten sam me-chanizm wykryto również u A. fumigatus izolowanych z próbek powietrza zewnętrznego z terenów wiejskich. Istnieje oba-wa, że rozpowszechnienie triazolo-opornych A. fumigatus przyczyni się do wzrostu śmiertelności do poziomu, jaki obser-wowano w latach 90. XX wieku (70–90%) i wymusi powrót do terapii amfoterycyną B, cechującą się znacznymi działania-mi ubocznydziałania-mi. Należy podkreślić, że chociaż amfoterycyna B ma szerokie spektrum aktywności, nie działa na wszystkie ga-tunki Aspergillus, np. na Aspergillus terreus. Inną przyczyną braku odpowiedzi klinicznej na standardową terapię przeciw-grzybiczą może być błędne dawkowanie i niedostateczne stężenie leku w ogniskach chorobowych. Aby tego uniknąć, zale-cane jest monitorowanie stężenia terapeutycznego leków, np. worykonazolu w surowicy pacjenta. Konsekwencją ekspozycji na subterapeutyczne dawki preparatu jest uruchomienie mechanizmów regulacyjnych, takich jak ekspresja transporterów błonowych i aktywny wypływ leku z komórki (efflux) grzyba. Nie bez znaczenia są również rodzaj i zaawansowanie zmiany grzybiczej, które – jak zostało dowiedzione – noszą wszelkie cechy typowe dla biofilmu. W inwazyjnej aspergilozie strzęp-ki grzyba przenikające tkanstrzęp-ki gospodarza są otoczone cienką warstwą macierzy zewnątrzkomórkowej (ang. extracellular matrix – ECM), zawierającej galaktozaminogalaktan oraz galaktomannany. W zmianach o charakterze aspergiloma strzęp-ki grzybów ściśle adherują do siebie i są otoczone grubą warstwą ECM, zawierającą oprócz wyżej wymienionych związ-ków również alfa 1,3 glukan. Liczne badania prowadzone in vitro potwierdziły, że wartości MIC związzwiąz-ków przeciwgrzybi-czych są wyższe dla biofilmu, niż dla hodowli planktonowych Aspergillus. Na zredukowanie wrażliwości biofilmu w dużej mierze wpływa struktura ECM, która stanowi barierę ochronną, hamującą dyfuzję leków do strzępek. Wykazano, że enzy-my trawiące składniki ECM, np. galaktozaminogalaktan, zwiększają podatność biofilmu Aspergillus na antymikotyki, w tym na worykonazol. Trwają badania nad możliwością zastosowania takich związków in vivo.
WPŁYW CEFAZOLINY NA TWORZENIE BIOFILMU PRZEZ KLINICZNE SZCZEPY
STAPHYLOCOCCUS
EPIDERMIDIS
Nowicka J1, Chodaczek G2, Gościniak G1
1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Uniwersytetu Medycznego im. Piastów Śląskich we Wrocławiu 2 Wrocławskie Centrum Badań EIT+, Laboratorium Mikroskopii Konfokalnej
Wstęp Jednym z ważnych elementów zapobiegania zakażeniom związanym z implantacją biomateriałów jest okołoopera-cyjna profilaktyka antybiotykowa. Właściwie przeprowadzona znacznie zmniejsza zagrożenie bakteryjnego zanieczyszcze-nia elementów sztucznych podczas zabiegu operacyjnego. W chirurgii ortopedycznej w eliminowaniu infekcji okołoopera-cyjnych zastosowanie mają cefalosporyny. Cel pracy Celem pracy była analiza wpływu cefazoliny na proces tworzenia, ale także redukcji, struktur biofilmu na implantach stalowych. Materiał i metody Ocenie poddano 30 szczepów Staphylococcus
epidermidis pochodzących z zakażeń ortopedycznych. W pracy zastosowano implanty stalowe. Wrażliwość analizowanych
szczepów na cefazolinę oznaczono z zastosowaniem metody ilościowej (wyznaczenie wartości MIC).Oddziaływanie anty-biotyku – w stężeniach poniżej, równych i powyżej wartości MIC – na właściwości adhezyjne szczepów, tworzenie i erady-kację biofilmu oceniono z użyciem metody ilościowej i mikroskopii elektronowej. Aktywność metaboliczną gronkowców w biofilmie oraz identyfikację żywych i martwych komórek oceniono przy użyciu barwników LIVE/DEAD BacLight. Wy-niki Wszystkie analizowane szczepy wykazywały zdolność tworzenia biofilmu na zastosowanych biomateriałach. Przy stę-żeniach powyżej wartości MIC poziom redukcji zaadherowanych komórek wynosił średnio 90%, poniżej MIC mieścił się w przedziale 40–60%. Formowanie biofilmu w obecności antybiotyku w stężeniach równych MIC zmniejszało liczbę jedno-stek tworzących kolonię średnio o 70%, w stężeniach subinhibicyjnych o – 50–65%. Eradykacja dojrzałych struktur biofilmu wymagała wyższych stężeń antybiotyku – poziom redukcji cfu/ml w stężeniach równych wartości MIC wynosił 30%. Wnio-ski Stężenie antybiotyku determinowało jego wpływ na proces formowania i skuteczność eradykacji biofilmu dojrzałego: im wyższe stężenie, tym większa redukcja liczby zaadherowanych lub tworzących struktury biofilmu komórek.
Słowa kluczowe: biofilm, cefazolina, Staphylococcus epidermidis
PATOMECHANIZMY SEPSY U NOWORODKÓW W OPARCIU O SZCZURZY MODEL TRANSLOKACJI
BAKTERYJNEJ
Strus M1, Majka G1, Pilarczyk-Żurek M1, Skowron B2, Baranowska A2
1 Katedra Mikrobiologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie 2 Katedra Patofizjologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie
Wstęp Sepsa w okresie noworodkowym jest bardzo poważnym zagrożeniem dla życia dziecka, szczególnie na oddzia-łach neonatologicznych, gdzie przebywają dzieci z masą urodzeniowa poniżej 1500 g. Rodzaj patogenu wywołujący u wcze-śniaków uogólniony stan zapalny jest jednym z najistotniejszych czynników decydującym o przebiegu choroby i jej roko-waniu. Najbardziej niebezpieczne są pałeczki Gram-ujemne, które – ze względu na duży potencjał wirulencji – są przede wszystkim odpowiedzialne za wysoką śmiertelność wśród tej grupy dzieci. Podejrzewa się, że bakterie te dostają się do krwi głównie ze światła jelita, gdyż bardzo mała masa urodzeniowa wcześniaków determinuje niedojrzałość i brak zachowania szczelności bariery jelitowej. Cel pracy Celem badania było opracowanie szczurzego modelu translokacji bakterii ze świa-tła jelita do krwi obwodowej pod wpływem uogólnionego stanu zapalnego (wcześniejsza infekcja gronkowcowa). Materia-ły i metody 12-dniowe szczurze oseski (rasy Wistar) odstawiono od matki i żywiono karmą ad libitum przez okres 3 dni. W dniu 15. oseskom podano jednorazowo dootrzewnowo zawiesinę bakterii Staphylococcus haemolyticus IM186 (dawka 107 cfu/ml). W 16. dniu zwierzętom podano jednorazowo per os 108 cfu/ml bakterii Escherichia coli IM3A/1. W dniu 17.
szczury uśmiercano w celu pobrania krwi z serca, śledziony oraz kału do posiewów mikrobiologicznych. Osocze krwi wy-korzystano do określenia profilu cytokin prozapalnych. W trakcie doświadczenia monitorowano parametry kliniczne (masa ciała, temperatura). Ponadto profil genetyczne wszystkich wyizolowanych szczepów z gatunku E. coli oraz S. haemolyticus porównywano ze szczepami wzorcowymi podanymi zwierzętom drogą doustną oraz dootrzewnową. Zarówno szczep gron-kowcowy S. haemolyticus IM 186, jak i szczep E. coli IM 3A wyizolowano od noworodków z bardzo małą masą urodze-niową z klinicznymi objawami sepsy potwierdzonymi posiewami mikrobiologicznymi. Wyniki U zwierząt w pięciu gru-pach doświadczalnych (n=30) po podaniu bakterii S. haemolyticus IM186 i E. coli IM3A/1 zaobserwowano spadek masy ciała jak i temperatury, co było związane z toczącym się uogólnionym stanem zapalnym. Wynik ten potwierdzono przez
analizę profilu cytokin w osoczu krwi zwierząt. Ponadto w posiewach mikrobiologicznych wykryto podane szczepy bakte-rii we krwi i śledzionie, a w przypadku E. coli IM3A/1 również w kale. Podanie w pierwszej kolejności szczepu S.
haemoly-ticus IM186, a następnie doustnie szczepu E. coli IM 3A/1 zwiększył zjawisko translokacji pałeczek Gram-ujemnej do krwi
i/lub śledziony z 30% aż do 80%. Posiewy kału potwierdziły, że podawany doustnie szczep E. coli IM 3A/1 wydajnie koloni-zuje przewód pokarmowy badanych zwierząt. Wnioski Zjawisko translokacji bakterii ze światła jelita do krwi obwodowej jest ściśle skorelowane z ogólnym obrazem klinicznym pacjenta. Nagłe pogorszenie się stanu klinicznego noworodka może nastąpić w momencie, gdy do toczącego się już wcześniej ogólnego procesu zapalnego dołączy się zjawisko przemieszczenia się flory bakteryjnej jelit na skutek przerwania lub niedojrzałości bariery jelitowej i ma to miejsce szczególnie często w przy-padku wcześniaków z masą urodzeniową poniżej 1500 g.
Słowa kluczowe: bakteriemia, mikroflora przewodu pokarmowego, model zwierzęcy, translokacja
PATHOMECHANISMS OF NEONATAL SEPSIS STUDIED USING RAT MODEL OF BACTERIAL
TRANSLOCATION
Strus M1, Majka G1, Pilarczyk-Żurek M1, Skowron B2, Baranowska A2
1 Chair of Microbiology, Jagiellonian University Medical College, Krakow 2 Chair of Pathophysiology, Jagiellonian University Medical College, Krakow
Introduction Sepsis in the neonatal period is a very serious threat to a child’s life, especially in the neonatal units, and is most severe in children with birth weight less than 1500 g. Pathogen type, causing generalized inflammation in premature infants, is one of the most important factors determining the course of the disease and its prognosis. The most dangerous are Gram-negative microorganisms, which owing to high potential virulence, are primarily responsible for the high mortal-ity rate among this group of children. It is suspected that these bacteria enter the blood mainly from the intestinal lumen, for very low birth weight comes with immaturity and aberrated integrity of the intestinal barrier. Aim Establishment of rat model of translocation of bacteria from the intestinal lumen to the peripheral blood under systemic inflammatory response (caused by staphylococcal infection). Material and methods 12-day-old Wistar rat pups were prematurely weaned and fed ad libitum for 3 days. On day 15, 107 of Staphylococcus haemolyticus 186 bacteria was injected intraperitoneally with
follow-ing tail blood collection (after 4 hours). After 24 hours (day 16) rats were orally administered suspension of 108 Escherichia
coli 3A/1 cells with subsequent blood sample collection. On day 17, rats were sacrificed for organ extraction (spleen, blood,
stool), bacterial culture and cytokine profiling. Clinical parameters were monitored throughout whole experiment. Isolated bacterial strains were compared using antibiotic resistance screening as well as molecular methods (PFGE). Both S.
hae-molyticus and E. coli strains given to rats were previously isolated from blood of very-low birth weight infants with clinical
symptoms of sepsis confirmed by bacterial culture. Results Five studied groups of rats (n=30) have shown deteriorating clinical parameters after S. haemolyticus and E. coli injections. Both weight and temperature decreased during infection which indicates ongoing inflammatory reaction. This was further confirmed with cytokine profile analysis. Bacterial culture allowed for detection of injected species in analysed samples of blood, spleen and faeces. Stool cultures confirmed that E. coli administered orally successfully colonized intestines of studied animals. Stool cultures confirmed that E. coli IM3A/1 strain effectively colonized gastrointestinal tract of studied animals. E. coli 3A/1 strain was most often found in the spleen of stud-ied animals which was confirmed using both standard microbiological screening and molecular analysis of genetic material. Occurrence of translocation in the studied group was c.a. 80% compared to 30% in control group (without S. haemolyticus administration). Conclusions The phenomenon of translocation of bacteria from the intestinal lumen into the peripheral blood is closely correlated with the overall clinical outcome of the patient. Sudden worsening of the clinical condition of the newborn can occur when a pending, earlier general inflammation concurs with the phenomenon of movement of the intestinal flora from deranged or immature intestinal barrier, and it particularly affects preterm infants with a birth weight below 1500 g.
