WRAŻLIWOŚĆ KLINICZNYCH SZCZEPÓW
ENTEROCOCCUS
FAECALIS WYWOŁUJĄCYCH ZAKAŻENIA MIEJSCOWE W FORMIE
BIOFILMOWEJ I PLANKTONICZNEJ NA ANTYSEPTYKI
EVALUATION OF EFFICACY OF ANTISEPTICS AGAINST BIOFILMIC AND PLANKTONIC FORMS OF
ENTEROCOCCUS FAECALIS CAUSING LOCAL INFECTIONS
STRESZCZENIE: Enterococcus faecalis to względnie beztlenowa bakteria Gram-dodatnia, po-siadająca zdolność do proliferacji w niekorzystnych warunkach. Budowanie biofilmu chro-ni drobnoustroje przed negatywnym działachro-niem czynchro-ników środowiskowych, układem im-munologicznym gospodarza i antybiotykami oraz antyseptykami. Celem pracy było zbada-nie wrażliwości klinicznych szczepów Enterococcus faecalis na stosowane w Polsce antysepty-ki. W badaniach wykazano najwyższą skuteczność dichlorowodorku oktenidyny wobec formy planktonicznej oraz biofilmu E. faecalis.
SŁOWA KLUCZOWE: antyseptyki, biofilm, dichlorowodorek oktenidyny, Enterococcus faecalis ABSTRACT: Enterococcus faecalis is a Gram-positive, facultative anaerobic bacteria. The abili-ty to survive and proliferation, building a biofilm, protect microorganisms from adverse condi-tions, immune system, antibiotics and antiseptics. Aim of this work was to evaluate efficacy of used in Poland antiseptics of Enterococcus faecalis. Octenidine dihydrochloride was the most efficient antiseptic against planktonic and biofilm bacteria.
KEY WORDS: antiseptics, biofilm, Enterococcus faecalis, octenidine dihydrochloride
1 Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej i Parazytologii Wydziału
Farmaceutycznego z Oddziałem Analityki Medycznej Uniwersytetu Medycznego im. Piastów Śląskich we Wrocławiu 2 Tuttomed Farmacja Sp. z o.o.
3 Katedra i Klinika Medycyny Paliatywnej, Hospicjum Stacjonarne Uniwersytetu Medycznego im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu
} MARZENNA BARTOSZEWICZ Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej i Parazytologii,
Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej,
Uniwersytet Medyczny
im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, ul. Borowska 211a, 50-556 Wrocław, Tel.: 71 784 05 10, e-mail: marzenna.bartoszewicz @umed.wroc.pl Wpłynęło: 13.02.2017 Zaakceptowano: 05.03.2017 DOI: dx.doi.org/10.15374/FZ2017012
WSTĘP
Względnie beztlenowe bakterie z rodzaju Enterococcus nie wytwarzają przetrwalników, ale posiadają ważną, dla pa-togenezy zakażeń, zdolność proliferacji w różnych warun-kach [1]. Są w stanie przeżyć i rozwijać się w wysokich stę-żeniach soli (6,5% NaCl), mają również szeroki zakres wy-trzymałości temperaturowej (od 5°C do 60°C) [1, 2]. Opty-malnie rozwijają się w pH o wartości około 7,5; aczkolwiek przeżywają również w pH 4,8; a niektóre są w stanie wy-trzymać w pH 10,0 [3]. Cechy te wynikają prawdopodob-nie z trwałości i szczelności ściany komórkowej (liczne lipi-dy błonowe i kwasy tłuszczowe). Zdolność do przetrwania umożliwia paciorkowcom kolonizację różnych nisz ekolo-gicznych w organizmie ludzkim, co ma duże znaczenie kli-niczne [4].
Czynniki wirulencji u Enterococcus są zdeterminowane przez:
t zdolność do kolonizowania przewodu pokarmo-wego;
t zdolność adhezji do białek macierzy zewnątrzkomór-kowej trombospondyny, laktoferyny i witronektyny, nabłonka dróg moczowych i nabłonka jamy ustnej; t endogenną translokację z komórek nabłonka jelita do
węzłów chłonnych i innych komórek ciała.
Istotnym elementem wpływającym na patogenezę i lecze-nie zakażeń wywołanych przez Enterococcus jest oporność naturalna oraz nabyta tych bakterii na antybiotyki. Opor-ność naturalna obejmuje: β-laktamy (brak wiązania z cefa-losporynami), klindamycynę, aminoglikozydy (oporność ni-skiego stopnia) oraz trimetoprim w połączeniu z sulfame-toksazolem [5].
Bakterie Enterococcus są ważnym składnikiem mikrobioty jelit (stanowią mniej niż 1%). W przypadku zmiany niszy eko-logicznej dochodzi do rozwoju zakażenia. W drogach moczo-wych paciorkowce mogą wywoływać zapalenie pęcherza mo-czowego, gruczołu krokowego i najądrzy. Zakażenia te najczę-ściej są obserwowane u starszych mężczyzn i to w tej grupie mogą być przyczyną bakteriemii. Hospitalizacja pacjenta oraz założenie cewnika moczowego zwiększają ryzyko zakażenia dróg moczowych [6].
Enterococcus są również izolowane z zakażeń jamy
brzusz-nej, miednicy i tkanek miękkich. W przypadku zapalenia otrzewnej, często jest to infekcja polibakteryjna. Zakażenia roz-wijają się u pacjentów z marskością wątroby w wyniku dializy otrzewnowej. Bakterie paciorkowca izolowano także z odleżyn i owrzodzeń stopy u chorych na cukrzycę, a także u osób z za-paleniem kości i szpiku.
Enterococcus to druga, pod względem częstotliwości
wystę-powania, przyczyna bakteriemii, w przypadku której źródłem bakterii jest zazwyczaj: układ moczowo-płciowy, jama brzusz-na, drogi żółciowe lub założony cewnik centralny [7].
Zapalenie wsierdzia jest jednym z najpoważniejszych zaka-żeń wywoływanych przez Enterococcus. Paciorkowce są odpo-wiedzialne za 5–15% zakażeń, często u pacjentów pozaszpi-talnych [8]. Do rozwoju bakteriemii prowadzącej do zapale-nia wsierdzia dochodzi w miejscu ekstrakcji zębów, w układzie moczowo-płciowym i pokarmowym [7].
Zdolność Enterococcus do tworzenia biofilmu jest podsta-wowym czynnikiem infekcji dróg moczowych, zakażeń endo-dontycznych oraz zapalenia wsierdzia [3, 9]. Struktura utwo-rzona przez bakterie z rodzaju Enterococcus, przylegająca do biomateriału lub tkanek pacjenta, chroni drobnoustroje przed niekorzystnymi warunkami środowiskowymi, układem im-munologicznym gospodarza, antybiotykami, a nawet antysep-tykami. Założeniem współczesnej medycyny jest stosowanie skutecznych antyseptyków, penetrujących przez biofilm i zabi-jających komórki bakteryjne, ukryte w strukturach śluzu.
Celem niniejszej pracy była ocena wrażliwości klinicznych szczepów Enterococcus faecalis wywołujących zakażenia miej-scowe w formie biofilmowej i planktonicznej na antyseptyki, takie jak: powidon jodu (PVP-jod), dichlorowodorek okteni-dyny (OCT), poliheksanidyna (PHMB), nadtlenek wodoru (H2O2), diglukonian chlorheksydyny (CHG) oraz mleczan eta-krydyny.
MATERIAŁ I METODY
Badaniem objęto 20 szczepów Enterococcus faecalis izolo-wanych z zakażeń szpitalnych i wchodzących w skład kolek-cji szczepów Zakładu Mikrobiologii Farmaceutycznej i Para-zytologii Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Analityki Medycznej Uniwersytetu Medycznego im. Piastów Śląskich we Wrocławiu.
POTWIERDZENIE ZDOLNOŚCI SZCZEPÓW E. FAECALIS
DO TWORZENIA BIOFILMU NA POWIERZCHNI
POLISTYRENOWEJ Z UŻYCIEM MIKROSKOPII
ŚWIETLNEJ
W celu potwierdzenia zdolności szczepów Enterococcus
fa-ecalis do tworzenia biofilmu na powierzchni polistyrenowej
zastosowano metodę mikroskopową, wykorzystując zdolność odczynnika Congo Red (Sigma-Aldrich) do niespecyficznego wiązania ze związkami posiadającymi wiązania typu β, wcho-dzącymi w skład śluzu zewnątrzkomórkowego, tak jak opisali to Harrison-Balestra i wsp. [10].
OCENA SKUTECZNOŚCI PRZECIWDROBNO
USTROJOWEJ BADANYCH ANTYSEPTYKÓW
WZGLĘDEM BADANYCH SZCZEPÓW E. FAECALIS
W HODOWLI PLANKTONICZNEJ ORAZ BIOFILMOWEJ
OKREŚLENIE WARTOŚCI MIC I MIC
90W WARUNKACH
BEZ OBCIĄŻENIA WARUNKI CZYSTE
Podczas badań zastosowano stężenia użytkowe dichloro-wodorku oktenidyny, mleczanu etakrydyny, poliheksanidyny i diglukonianu chlorheksydyny, wynoszące 0,1%. W przypad-ku nadtlenW przypad-ku wodoru oraz PVP-jodu, preparaty antyseptycz-ne doprowadzono do stężenia 0,1% w celu porównania siły bójczej substancji aktywnej każdego preparatu, tak jak zosta-ło to zaproponowane przez Bartoszewicz i wsp. [11]. Do okre-ślenia wartości MIC (ang. minimal inhibitory concentration, minimalne stężenie hamujące) badanych antyseptyków zasto-sowano metodę mikrorozcieńczeń na polistyrenowych płyt-kach 96-dołkowych (Sarstedt), zgodnie z wytycznymi opra-cowanymi przez NCCLS (ang. National Committee for Clini-cal Laboratory Standards) dla antybiotyków.
Sporządzono zawiesinę o gęstości 1×108 komórek/ml (0,5 MF) z 24-godzinnej hodowli płynnej badanego szczepu. Za-wiesinę rozcieńczono stukrotnie za pomocą TSB (ang. tryptic soy broth) w celu otrzymania zawiesiny bakteryjnej o gęstości 1×106 komórek/ml. 100 μl zawiesiny o gęstości 1×106 komó-rek/ml przeniesiono do odpowiednich dołków (1–10 oraz 12) płytki titracyjnej. Dołek 11. stanowił kontrolę jałowości do-świadczenia (napełniono go jałową pożywką płynną), dołek 12. – kontrolę potwierdzającą zdolność szczepu do tworzenia biofilmu na powierzchni polistyrenowej.
Płytkę titracyjną z odpowiednimi zawiesinami komórek bakteryjnych inkubowano 24 godziny w temperaturze 37°C. Po zakończeniu inkubacji usunięto zawiesinę, a dołki prze-płukano trzykrotnie 0,9% NaCl w celu usunięcia niezadhero-wanych komórek bakteryjnych w formie planktonicznej i do-dano 100 μl bulionu Mueller-Hintona (MHB). Następnie do dołków płytki wprowadzono rozcieńczenia odpowiednich antyseptyków w postępie geometrycznym i pozostawiono na 24 godziny w temperaturze 37°C (Tabela 1).
W celu dokonania oceny wpływu antyseptyków na bak-terie w formie planktonicznej, 100 μl zawiesiny bakteryjnej naniesiono do dołków płytki wraz z odpowiednimi rozcień-czeniami. Następnie płytkę inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C. W celu określenia MIC antyseptyków – zarówno względem bakterii w formie planktonicznej, jak i biofilmowej – użyto metody Richardsa, opartej na ocenie redukcji bezbarwnego chlorku 2, 3, 5-trifenylotetrazoliowe-go (20 μl, 1% TTC, Fluka) do czerwone5-trifenylotetrazoliowe-go formazanu. Do barwnej redukcji związku dochodziło jedynie w obecności żywych, aktywnych metabolicznie drobnoustrojów. Za mi-nimalne stężenie hamujące przyjmowano stężenie antysep-tyku w pierwszym dołku, w którym po 24 godzinach od in-kubacji z 5 μl TTC nie doszło do zmiany zabarwienia. Za MIC90 przyjmowano to stężenie antyseptyku, które prowa-dziło do zahamowania wzrostu 90% badanych szczepów. Każdy pomiar został przeprowadzony trzykrotnie.
OCENA SKUTECZNOŚCI BADANYCH ANTYSEPTYKÓW
WZGLĘDEM BADANYCH SZCZEPÓW E. FAECALIS
W HODOWLI PLANKTONICZNEJ ORAZ BIOFILMOWEJ
OKREŚLENIE WARTOŚCI MIC I MIC
90W WARUNKACH
IMITUJĄCYCH ŚRODOWISKO RANY PRZEWLEKŁEJ
WARUNKI Z OBCIĄŻNIKIEM
Analogicznie do powyższego badania, sporządzono za-wiesinę o gęstości 1×108 komórek/ml (0,5 MF) z 24-godzin-nej hodowli płynz 24-godzin-nej badanego szczepu. Zawiesinę rozcień-czono stukrotnie za pomocą TSB w celu otrzymania jej gę-stości wynoszącej 1×106 komórek/ml. 100 μl zawiesiny bak-teryjnej o gęstości 1×106 komórek/ml przeniesiono do od-powiednich dołków (1–10 oraz 12) płytki titracyjnej. Do-łek 11. stanowił kontrolę jałowości doświadczenia (napeł-niano go jałową pożywką płynną), a dołek 12. – kontrolę potwierdzającą zdolność szczepu do tworzenia biofilmu na powierzchni polistyrenowej. Tak przygotowaną płytkę titra-cyjną inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C. Po zakończeniu inkubacji zawiesinę usunięto, a dołki prze-płukano trzykrotnie 0,9% NaCl w celu usunięcia niezadhe-rowanych komórek bakteryjnych w formie planktonicznej. Kolejno do dołków płytki dodano 100 μl MHB, zawierające-go 18% krew baranią oraz 18% BSA (ang. bovine serum al-bumine). Następnie uzyskano stężenia antyseptyków zawar-te w Tabeli 1 i stężenie krwi baraniej oraz białka BSA w za-wiesinie, wynoszące 4,5%, w oparciu o dane przedstawione przez Bartoszewicz i wsp. [11].
W przypadku hodowli planktonicznych, do dołków płyt-ki titracyjnej wprowadzano 100 μl zawiesiny odpowiednie-go szczepu bakteryjneodpowiednie-go oraz 100 μl MHB, zawierająceodpowiednie-go 18% krew baranią oraz 18% BSA, następnie 100 μl antysep-tyku i 100 μl 0,9% NaCl, uzyskując stężenia antyseptyków zawarte w Tabeli 1 i stężenie krwi baraniej oraz białka BSA w zawiesinie, wynoszące 4,5%.
POTWIERDZENIE ZDOLNOŚCI SZCZEPÓW
E. FAECALIS DO TWORZENIA BIOFILMU NA
POWIERZCHNI PROFILÓW POLISTYRENOWYCH
ZA POMOCĄ METODY RICHARDSA I MIKROSKOPII
ELEKTRONOWEJ
W celu oceny zdolności testowanych antyseptyków do eradykacji badanych drobnoustrojów w rzeczywistym cza-sie kontaktowym i stężeniach użytkowych, wykorzysta-no profile polistyrewykorzysta-nowe o długości 1 cm i średnicy 0,5 cm. Profile poddano badaniu za pomocą metody Richardsa oraz mikroskopii elektronowej w celu potwierdzenia występowa-nia na nich biofilmu.
Zawiesinę bakteryjną po 24-godzinnej hodowli doprowa-dzono do gęstości 0,5 MF i inkubowano w obecności profilu polistyrenowego (Model-Ad) oraz 1% TTC przez 24 godzi-ny w temperaturze 37°C. Po upływie czasu inkubacji profil polistyrenowy przepłukiwano trzykrotnie 0,9% NaCl w celu usunięcia niezadherowanych bakterii z jego powierzchni. Czerwone zabarwienie profilu, będące wynikiem reduk-cji TTC do czerwonego formazanu, służyło wstępnemu po-twierdzeniu zdolności szczepów do tworzenia biofilmu na powierzchni polistyrenowej. Następnie profile poddawano suszeniu w temperaturze 37°C przez 4 godziny. Na wysuszo-ne profile napylano mieszaninę Au/Pd za pomocą napylarki Quorum-Q150R ES. W celu uzyskania obrazu biofilmu po-służono się mikroskopem elektronowym ZEISS-32.
OCENA ZDOLNOŚCI BADANYCH ANTYSEPTYKÓW
DO ERADYKACJI BIOFILMU Z POWIERZCHNI
PROFILÓW POLISTYRENOWYCH
Badane szczepy Enterococcus, rosnące na podłożach sta-łych, przeniesiono do odpowiednich podłoży płynnych i in-kubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C w warun-kach tlenowych, bez wytrząsania. Po upływie czasu inku-bacji gęstość zawiesiny bakteryjnej ustalono densytome-trycznie na 3×108 komórek/ml. Do tak przygotowanych
Numer dołka płytki 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Stężenie antyseptyku [μg/ml] 0,49 0,98 1,96 3,91 7,82 15,63 31,25 62,50 125,0 250,0 KN KP
KP – kontrola pozytywna (zawiesina bakteryjna niepoddana działaniu antyseptyku); KN – kontrola negatywna (kontrola jałowości – pożywka mikrobiologiczna, do któ-rej nie wprowadzono zawiesiny bakteryjnej). Stężenie użytkowe powyższych preparatów wynosi 1000 μg/ml, jednak obecność inoculum bakteryjnego i pożywki pro-wadzi do jego rozcieńczenia do 250 μg/ml.
zawiesin wprowadzono profil polistyrenowy w kształcie wal-ca (o średnicy 0,5 cm i długości 1 cm) oraz poddano kolejnej inkubacji w 37°C. Po 24 godzinach profil przepłukano in-tensywnie 0,9% NaCl w celu pozbycia się z jego powierzch-ni powierzch-niezwiązanych lub luźno zadherowanych bakterii. Profi-le z utworzonym biofilmem wprowadzono na czas kontak-towy jednej minuty do 1 ml badanego antyseptyku w stęże-niu użytkowym. Jest to najkrótszy czas kontaktowy, reko-mendowany przez producentów antyseptyków, których sub-stancją aktywną jest OCT, PHMB, PVP-jod oraz CHG. Brak jest danych dotyczących najkrótszego czasu kontaktowego, w którym pożądaną skuteczność przeciwdrobnoustrojową wykazuje mleczan etakrydyny oraz nadtlenek wodoru. Pro-file przeniesiono na 5 minut do neutralizatora niwelujące-go działanie antyseptyku (Universal Neutralizer®, Merck). Równolegle wykonywano badania kontrolne, w których profile przenoszono do 1 ml jałowego 0,9% NaCl. Po upły-wie czasu neutralizacji, profile z grupy kontrolnej oraz ba-danej przeniesiono do 1 ml łagodnego detergentu (0,5% sa-poniny) i poddano mechanicznemu wytrząsaniu (jedna mi-nuta) w celu uwolnienia komórek bakteryjnych z warstw śluzu tworzącego biofilm. 100 μl uzyskanego lizatu posia-no ilościowo na odpowiednie podłoże stałe, wykorzystując technikę seryjnych rozcieńczeń. Po 24-godzinnej inkubacji
w 37°C, zliczono liczbę kolonii bakteryjnych na płytce. Wy-nik podano jako CFU całkowite, obliczone według wzoru:
CFU całkowite = liczba kolonii × 10N+1
gdzie: N – numer rozcieńczenia, w którym wyrosły szczepy bakteryjne, +1 – rozcieńczenie 10-krotne (0,1 ml z 1 ml sa-poniny).
WYNIKI
POTWIERDZENIE ZDOLNOŚCI SZCZEPÓW
E. FAECALIS DO TWORZENIA BIOFILMU NA
POWIERZCHNI POLISTYRENOWEJ Z UŻYCIEM
MIKROSKOPII ŚWIETLNEJ
Szczepy Enterococcus faecalis, wykazujące zdolność do trwałej adhezji oraz zdolność do produkcji zewnątrzkomór-kowego śluzu w czasie od 1 do 24 godzin od rozpoczęcia in-kubacji, uznano za bakterie tworzące biofilm na powierzch-ni polistyrenowej. Wszystkie badane szczepy bakteryjne wy-kazywały zdolność do trwałej adhezji już po 2–4 godzinach
35 30 25 20 15 10 5 0 MIC90 (μg/ml) MIC90 (μg/ml) A B
A B biofilm na powierzchni polistyrenowej. A –
ko-mórki bakteryjne przylegające do powierzchni polistyrenowej po 4 godzinach od rozpoczęcia inkubacji. Widoczne brązowe zaciemnienia, po-krywające częściowo warstwę komórek, sygna-lizują tworzący się śluz zewnątrzkomórkowy. B – po 24 godzinach od rozpoczęcia inkubacji warstwa komórek bakteryjnych jest niemal cał-kowicie pokryta zewnątrzkomórkowym śluzem.
Ryc. 2. Minimalne stężenia hamujące wzrost 90% badanych szczepów Enterococcus faecalis w formie planktonicznej (A) oraz biofilmowej (B). Wartości MIC90 dla etakrydyny, PVP-jodu oraz H2O2 wynoszące na wykresie B 250 μg/ml oznaczają, że antyseptyki te nie są skuteczne względem badanych
200 150 100 50 0 MIC90 (μg/ml) 200 150 100 50 0 MIC90 (μg/ml) A B
Ryc. 3. Minimalne stężenia hamujące – wzrost 90% badanych szczepów E. faecalis w formie planktonicznej (A) oraz biofilmowej (B). Wartości MIC90
wy-noszące na wykresie B 250 μg/ml oznaczają, że antyseptyki te nie są skuteczne względem badanych szczepów bakterii w testowanym przedziale stężeń.
od naniesienia na powierzchnię szkiełka polistyrenowego. Od 4 do 8 godzin od naniesienia na szkiełko badane szcze-py zaczynały produkować zewnątrzkomórkowy śluz, co za-prezentowano na Ryc. 1.
OCENA SKUTECZNOŚCI PRZECIWDROBNO
USTROJOWEJ BADANYCH ANTYSEPTYKÓW
WZGLĘDEM SZCZEPÓW E. FAECALIS W HODOWLI
PLANKTONICZNEJ ORAZ BIOFILMOWEJ
OKREŚLENIE WARTOŚCI MIC I MIC
90W WARUNKACH BEZ OBCIĄŻENIA WARUNKI
CZYSTE
Wobec testowanych szczepów Enterococcus faecalis w for-mie planktonicznej, najniższą skuteczność wykazywał PVP- -jod, następnie mleczan etakrydyny oraz H2O2. Poliheksa-nidyna oraz diglukonian chlorheksydyny cechowały się po-dobną skutecznością. Dichlorowodorek oktenidyny oka-zał się najskuteczniejszym antyseptykiem wobec E. faecalis w formie planktonicznej.
W przypadku form biofilmowych w badanym przedziale stężeń, trzy z sześciu testowanych antyseptyków – PVP-jod, nadtlenek wodoru oraz mleczan etakrydyny – były niesku-teczne. Najwyższą skuteczność wykazał dichlorowodorek oktenidyny, następnie poliheksanidyna oraz diglukonian chlorheksydyny (Ryc. 2).
OCENA SKUTECZNOŚCI BADANYCH ANTYSEPTYKÓW
WZGLĘDEM SZCZEPÓW E. FAECALIS W HODOWLI
PLANKTONICZNEJ ORAZ BIOFILMOWEJ
OKREŚLENIE WARTOŚCI MIC I MIC
90W WARUNKACH
IMITUJĄCYCH ŚRODOWISKO RANY PRZEWLEKŁEJ
WARUNKI Z OBCIĄŻNIKIEM
Wartości MIC testowanych antyseptyków, które uzyska-no w warunkach symulujących środowisko rany przewlekłej, zaprezentowano na Ryc. 3. W badaniach nie ujęto nadtlenku wodoru, który po wprowadzeniu do zawiesiny zawierającej
krew baranią ulegał intensywnemu spienieniu, co uniemoż-liwiało przeprowadzenie kolejnych etapów procedury okre-ślania wartości MIC. Zaobserwowano podwyższoną opor-ność drobnoustrojów Enterococcus faecium w formie bio-filmowej wobec stosowanych antyseptyków, w porównaniu z ich planktonicznymi odpowiednikami.
Najskuteczniejszym antyseptykiem względem formy planktonicznej oraz biofilmowej badanych szczepów
Ente-rococcus faecalis okazała się oktenidyna, natomiast najmniej
skutecznym – mleczan etakrydyny. Z kolei poliheksanidyna wykazała taką samą skuteczność względem szczepów E.
fa-ecalis zarówno w formie planktonicznej, jak i biofilmowej.
POTWIERDZENIE ZDOLNOŚCI SZCZEPÓW
E. FAECALIS DO TWORZENIA BIOFILMU NA
POWIERZCHNI PROFILÓW POLISTYRENOWYCH ZA
POMOCĄ MIKROSKOPII ELEKTRONOWEJ
Na powierzchni profilów polistyrenowych wszystkie ba-dane szczepy formowały biofilm (Ryc. 4).
OCENA ZDOLNOŚCI BADANYCH ANTYSEPTYKÓW
DO ERADYKACJI BIOFILMU Z POWIERZCHNI
PROFILÓW POLISTYRENOWYCH
Badane szczepy tworzyły biofilm o liczbie komórek 103–106 na profil polistyrenowy. E. faecalis wykazywały naj-wyższą oporność na mleczan etakrydyny. Tylko w jednym przypadku po zastosowaniu tego antyseptyku doszło do cał-kowitej eradykacji biofilmu. Oktenidyna charakteryzowała się najwyższą zdolnością do całkowitej eradykacji (17 przy-padków). Zastosowanie chlorheksydyny skutkowało era-dykacją 14 szczepów tworzących biofilm na powierzch-ni polistyrenowej. Poliheksapowierzch-nidyna oraz PVP-jod wykaza-ły zdolność do całkowitej eradykacji 12 szczepów, a H2O2 – w 10 przypadkach. Zaobserwowano występowanie szcze-pów wykazujących wysoką oporność na poliheksanidynę, PVP-jod oraz mleczan etakrydyny.
OMÓWIENIE I WNIOSKI
W przeprowadzonych badaniach wykazano, że mikro-organizmy z rodzaju Enterococcus charakteryzują się wraż-liwością względem części antyseptyków dopuszczonych w Polsce do sprzedaży.
Zastosowane antyseptyki różniły się między sobą sku-tecznością, a na różnice wpływały nie tylko substancje ak-tywne (zastosowane w poszczególnych preparatach), lecz także forma występowania drobnoustroju (biofilm a plank-ton) oraz ewentualna obecność związków obciążających lub ich brak.
W przypadku badanych szczepów E. faecalis w warun-kach tzw. czystych, w formie planktonicznej, najmniejszą skutecznością charakteryzował się PVP-jod, następnie mle-czan etakrydyny i H2O2. Poliheksanidyna oraz diglukonian chlorheksydyny wykazywały taką samą skuteczność, nato-miast najefektywniejszym antyseptykiem okazał się dichlo-rowodorek oktenidyny. Badania form biofilmowych szcze-pów Enterococcus wykazały, że aż trzy z sześciu testowanych antyseptyków – PVP-jod, nadtlenek wodoru oraz mleczan etakrydyny – okazały się niewystarczające w badanym prze-dziale stężeń. Najskuteczniejszym antyseptykiem był OCT, następnie PHMB oraz CHG.
Badania w warunkach imitujących środowisko rany wy-kazały, że najskuteczniejszym antyseptykiem względem planktonicznej i biofilmowej formy badanych szczepów
En-terococcus faecalis była oktenidyna, a najmniej skutecznym
– mleczan etakrydyny. Poliheksanidyna wykazywała iden-tyczną skuteczność względem szczepów E. faecalis zarówno w formie planktonicznej, jak i biofilmowej.
Wyniki badań pokazują, jak dużym problemem terapeu-tycznym jest tworzenie przez Enterococcus biofilmu. Bak-terie funkcjonujące w tej postaci są bardziej oporne na an-tyseptyki i antybiotyki, ponieważ stworzone są warunki
sprzyjające transferom plazmidowym i transpozonowym genom oporności oraz chroniące bakterie przed działaniem układu odpornościowego.
Do badań wybrano antyseptyki powszechnie używane w polskim systemie ochrony zdrowia. Wyniki obejmują zło-żone zależności pomiędzy drobnoustrojem, antyseptykiem a elementami morfotycznymi krwi, które tworzą środowi-sko rany przewlekłej.
Do określenia wartości MIC badanych antyseptyków za-stosowano metodę mikrorozcieńczeń na polistyrenowych płytkach 96-dołkowych, według wytycznych opracowanych przez NCCLS dla antybiotyków.
W badaniach Bartoszewicz i wsp. wykazano, że metoda ta może być stosowana nie tylko do oznaczenia MIC dla zawie-sin bakteryjnych, lecz także do badanych związków przeciw-drobnoustrojowych względem bakterii w formie biofilmo-wej [11, 12]. Wprowadzenie do środowiska reakcyjnego ino-culum bakteryjnego wymaga zastosowania stężeń antysep-tyków niższych niż stężenia użytkowe. Jest to jednak zgodne z zastosowanymi metodami testowania skuteczności płyn-nych środków dezynfekujących i antyseptyczpłyn-nych, w tym również z normą PN-EN 1041.
Czy MIC90 uzyskane w warunkach laboratoryjnych jest bliskie wartościom otrzymywanym w warunkach klinicz-nych? Ocena minimalnego stężenia hamującego wyma-ga poszukiwania nowych metod badawczych, które będą uwzględniały możliwości zmiany stężenia w przypadku wy-sięku z rany lub szybkiego wysychania skóry po zastosowa-niu antyseptyku. Bazując jednak na obecnym stanie wiedzy i wynikach niniejszej pracy, można wnioskować, że w przy-padku zakażeń Enterococcus faecalis jako wiodący powinien być stosowany dichlorowodorek oktenidyny.
KONFLIKT INTERESÓW: nie zgłoszono.
PIŚMIENNICTWO
1. Vu J, Carvalho J. Enterococcus: review of its physiology, pathogenesis, di-seases and the challenges it poses for clinical microbiology. Front Biol 2011;6(5):357–366.
2. Teixeira LM, Carvalho MGS, Shewmaker PL, Facklam RR. Manual of Clinical
Mi-crobiology. ASM Press, Washington, 2011, pp. 350–364.
3. Fischer K, Phillips C. The ecology, epidemiology and virulence of Enterococcus.
Microbiology 2009;155(6):1749–1757.
4. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA. Enterococcus and other Gram-positive
cocci. In: Murray P, Rosenthal K, Pfaller M (eds). Medical Microbiology. 6th edn.
Saunders, 2009, pp. 243–246.
5. Kuch A, Żabicka D, Hryniewicz W. Rekomendacje doboru testów do ozna-czania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki 2009. Ozna-czanie wrażliwości Enterococcus spp. Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Le-kowrażliwości Drobnoustrojów (online) 2009; http://www.korld.edu.pl/ pdf/04-Rek2009-Enterokoki.pdf
6. Hidron AI, Edwards JR, Patel J et al. NHSN annual update: antimicrobial-re-sistant pathogens associated with healthcare-associated infections: annual summary of data reported to the National Healthcare Safety Network at the Centers for Disease Control and Prevention, 2006–2007. Infect Control Hosp Epidemiol 2008;29(11):996–1011.
Ryc. 4. Biofilm tworzony przez szczep E. faecalis 7P na powierzchni profi-lu polistyrenowego. Spośród badanych gatunków bakteryjnych, szczepy
E. faecalis tworzyły najcieńszą warstwę egzopolisacharydu (zaznaczone
czerwoną strzałką). Skaningowy mikroskop elektronowy ZEISS, powięk-szenie ×6600.
7. Higuita A, Huycke MM. Enterococcal disease, epidemiology, and implications for treatment. In: Gilmore MS, Clewell DB, Ike Y, Shankar N (eds). Enterococci: From Commensals to Leading Causes of Drug Resistant Infection. Massachu-setts Eye and Ear Infirmary, Boston, 2014.
8. Murdoch DR, Corey GR, Hoen B et al. Clinical presentation, etiology, and
outcome of infective endocarditis in the 21st century: the international
collaboration on endocarditis-prospective cohort study. Arch Intern Med 2009;169(5):463–473.
9. Stuart CH, Schwartz SA, Beeson TJ, Owatz CB. Enterococcus faecalis: its role in root canal treatment failure and current concepts in retreatment. J Endod 2006;32(2):93–98.
10. Harrison-Balestra C, Cazzaniga AL, Davis SC, Mertz PM. A wound-isolated
Pseu-domonas aeruginosa grows a biofilm in vitro within 10 hours and is visualized
by light microscopy. Dermatol Surg 2003;29(6):631–635.
11. Bartoszewicz M, Junka A, Smutnicka D. Wrażliwość klinicznych szczepów
Kleb-siella pneumoniae na antyseptyki stosowane w leczeniu ran. Forum Zakażeń
2011;2(4):121–127.
12. Bartoszewicz M, Junka AF, Smutnicka D, et al. Skuteczność wybranych an-tyseptyków badana in vitro oraz w warunkach imitujących środowisko rany w stosunku do szczepów CNS izolowanych z zakażeń ran przewlekłych. Lecze-nie Ran 2011;8(1):21–27.
