Techniki łączone w diagnostyce medycznej – wybrane przykłady

Techniki łączone w diagnostyce medycznej

– wybrane przykłady

*Joanna Kałużna-Czaplińska, Jagoda Jóźwik

Instytut Chemii Ogólnej i Ekologicznej, Wydział Chemiczny, Politechnika Łódzka Dyrektor Instytutu: prof. dr hab. Jacek Rynkowski

Coupled TeChniques in mediCal diagnosTiCs – seleCTed examples S u m m a r y

Coupled techniques are widely used both in clinical analysis and medical diagnostics, which is a rapidly growing area of medicine. it is mainly based on determination of metabolites in human body fluids using various techniques, in particular gas chromatography mass spectrometry gC-ms and liquid chromatography coupled with mass spectrometry lC-ms. each of these connections has advantages and disadvantages as well as limitations in their use. most often the choice of a suitable analytical method depends on the type of test analytes. Coupled techniques have proved particularly useful in the case where the analytes determined in the samples are present in extremely low concentration levels, which makes it impossible to analyse them both qualitatively and quantitatively with the use of other commonly known methods. owing to the coupled techniques, an early diagnosis of many diseases is possible including primarily metabolic disorders (such as different types of organic acidurias), cancers (such as breast cancer and colon cancer), lung disease (including tuberculosis), cardiovascular and neurological disorders (such as alzheimer’s disease). an application of a suitable technique not only helps in rapid diagnosis of the disease but it also allows the introduction of an appropriate therapy and a better understanding of the disease by doctors. This paper is a review of coupled techniques which are widely used in the diagnostics and monitoring of various diseases based on specific bioanalytes known as biomarkers. Key words: coupled techniques, medical diagnostics, biomarkers

WStęP

Diagnostyka medyczna to dynamicznie rozwijająca się dziedzina medycyny. Stwarza ona lekarzom realne możliwości na szybsze rozpoznanie choroby i pacjen­ tom szanse skutecznego leczenia w przypadku wielu chorób, w tym także tych, które są mało poznane. We współcze snym świecie diagnostyka medyczna jest nie­ odłącznym elementem procesu leczenia. Należy także zdawać sobie sprawę, że od czułości i specyficzności stosowanych w diagnostyce medycznej metod zależy szybkie i prawi dłowe rozpoznanie choroby. Współcze­ sna diagnostyka medyczna w głównej mierze opiera się na badaniach metabolitów w płynach ustrojowych czło­ wieka. Użyta do tych celów technika powinna spełniać określone kryte ria: selektywność rozdzielania pozwala­ jącą na dotarcie oznaczanych form analitu do detektora oddzielonych od potencjalnych interferentów matrycy, czułość detekcji oraz identyfikację formy chemicznej oznaczanego ana litu. te wszystkie kryteria spełniają techniki sprzężone (łączone), rozumiane jako połącze­ nia co najmniej dwóch metod badawczych, które umoż­ liwiają rozdzielenie ba danej próbki na poszczególne składniki oraz ich jedno znaczną identyfikację. Metody te stają się szczególnie przydatne, gdy jest potrzeba

identyfikowania analitów występujących w płynach ustrojowych w ekstremalnie ni skich poziomach stężeń oraz gdy chcemy identyfikować anality bez koniecz­ ności stosowania żmudnego procesu przygotowania próbki (1).

W badaniach diagnostycznych opartych o wydzieli­ ny i wydaliny w organizmie człowieka szczególną rolę pełnią następujące techniki łączone: chromatografia gazowa­spektrometria mas (GC­MS), chromatografia gazowa­tandemowa spektrometria mas (GC­MS/MS), chromatografia cieczowa­spektrometria mas (LC­MS), chromatografia cieczowa­tandemowa spektrometria mas (LC­MS/MS), wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC), coraz częściej stosowana elektroforeza kapilar­ na­spektrometria mas (CE­MS), a także spektrometria mas z analizatorem cyklotronowego rezonansu jonów z fourierowską transformacją Ft­ICR MS i magnetyczny rezonans jądrowy. techniki te stosowane są w diagnozie i wczesnym rozpoznaniu wielu chorób. Ponadto, dzięki nim jest możliwe monitorowanie zmian stężeń niektórych metabolitów w płynach ustrojowych po wprowadzeniu zindywidualizowanej terapii u pacjenta (2). Artykuł przed­ stawia najnowsze doniesienia literaturowe dotyczące wykorzystania technik łączonych w wybranych obszarach diagnostyki medycznej.

pozwala na wykonanie analizy profili acylokarnityn w osoczu, które stanowią podstawę diagnozy defektów w metabolizmie rozgałęzionych aminokwasów czy utlenia­ nia kwasów tłuszczowych (10). Choroba Crohna (CD), jej pochodzenie oraz diagnostyka stanowią kolejne wyzwanie dla klinicystów. W celu wykonania bezkie­ runkowego profilowania metabolicznego, mającego za zadanie określenie wpływu metabolitów produkowanych przez mikroflorę jelitową na wystąpienie stanu choro­ bowego u pacjenta, można zastosować spektrometrię mas z analizatorem cyklotronowego rezonansu jonów z fourierowską transformacją Ft­ICR MS (11).

D i a g n o s t y k a n o w o t w o r ó w

Diagnostyka nowotworów wymaga współpracy leka­ rzy wielu specjalności oraz zastosowania wielu metod badawczych. Każdego roku w Polsce i na całym świecie odnotowuje się setki tysięcy nowych przypadków zacho­ rowań na różnego typu nowotwory. Duża liczba zgonów związanych z wystąpieniem raka determinuje koniecz­ ność rozwoju nowych, skutecznych metod diagnostycz­ nych oraz terapeutycznych. Dużym zainteresowaniem na przestrzeni ostatnich lat cieszy się analiza zmian metabolicznych zachodzących przede wszystkim w komórkach rakowych (12). Najczęściej wykorzystywaną techniką jest spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) oraz spektroskopia mas (MS). Spo­ sób obserwacji komórek rakowych zaproponowany w 1956 roku przez Otto Warburga wykazał, iż odznaczają się one wysoką aktywnością glikolityczną, która z kolei przy ograniczonym dostępie tlenu prowadzi do wzmo­ żonej produkcji kwasu mlekowego. Długotrwała glikoliza może skutkować rozrostem komórek rakowych oraz ich agresywnością wobec zaatakowanego organizmu. Wy­ korzystanie dostępnych technik, w tym przede wszystkim technik sprzężonych, umożliwia lepsze i dokładniejsze poznanie choroby oraz możliwości jej leczenia. Do naj­ częściej występujących nowotworów u kobiet należy rak piersi. Zespół chińskich naukowców wykorzystując chro­ matografię gazową sprzężoną ze spektrometrią mas (13), oznaczył poziomy wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) oraz podjął próbę wskazania potencjalnych biomarkerów tego rodzaju raka. Wśród badanej populacji wyróżniono pacjentów dotkniętych nowotworem, osoby ze zdia­ gnozowaną łagodną postacią raka oraz osoby zdrowe. Badania wykazały istnienie istotnych różnic dla trzech kwasów nasyconych (w tym kwasu tetradekanowego i heksadekanowego) oraz trzech nienasyconych kwasów tłuszczowych (w tym linolowego i linolenowego) u wyżej wymienionych grup. Wnioskuje się, iż FFA mogą być uznane za biomarkery rozważanego rodzaju nowotwo­ ru. Metoda GC­MS dzięki niskiej granicy wykrywalności oraz dobrej precyzji umożliwia prowadzenie badań nad lotnymi biomarkerami obecnymi w oddechu pacjentów ze stwierdzonym nowotworem płuc (14, 15). W przeprowa­ dzonych analizach badaną populację stanowili ochotnicy, wśród których znajdowali się palacze, osoby niepalą­ ce oraz ze zdiagnozowanym rakiem płuc, którzy nie byli leczeni przy zastosowaniu chemioterapii ani metod WyBRANE PRZyKŁADy ZAStOSOWAń tECHNIK

ŁąCZONyCH W BADANIACH DIAGNOStyCZNyCH D i a g n o s t y k a w r o d z o n y c h

w a d m e t a b o l i z m u

Diagnostyka wrodzonych wad metabolizmu opiera się na metodach przesiewowych (badania u każdego nowo­ rodka) oraz przesiewu selektywnego (tylko w grupach szczególnego ryzyka). Podstawą skriningu jest wykonanie profili kwasów organicznych w moczu z zastosowaniem metody chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrome­ trią mas (GC/MS) bądź metody GC­MS/MS.

Choroby metaboliczne stanowią niekiedy zintegrowa­ ną część innych zaburzeń, często o odmiennym charak­ terze. Dobrym przykładem może być przeprowadzenie analizy profili kwasów organicznych w moczu dzieci ze stwierdzonym spektrum zaburzeń autystycznych. Na podstawie profili kwasów organicznych możliwa jest identyfikacja prawdopodobnych przyczyn wystę­ powania szeregu nieprawidłowości zarówno w sferze behawioralnej, jak i psychosomatycznej autystyków. Odpowiednią techniką do tych badań okazała się chro­ matografia gazowa sprzężona ze spektrometrią mas (3). Wykorzystanie tego połączenia umożliwiło również identyfikację kwasu homowanilinowego (HVA) oraz wa­ nilinomigdałowego (VMA) w moczu osób dotkniętych zespołem Costello (4). Jest to schorzenie metaboliczne uwarunkowane genetycznie, prowadzące do deforma cji ciała czy nawet do nowotworów. Innym obszarem wy­ korzystania sprzężenia GC­MS w badaniach moczu jest wykrywanie kwasów organicznych oraz aminokwa sów, których często sama obecność i nieprawidłowe poziomy stężeń mogą świadczyć o wystąpieniu m.in. różnego rodzaju kwasic organicznych, w tym kwasicy metylo­ malonowej, glutarowej typu I i II, dikarboksylowej, zabu­ rzeń cyklu mocznikowego, galaktozemii, alkaptonu rii, neuroblastomy oraz choroby syropu klonowego (5, 6). Oznaczanie w moczu metabolitów neuroaktywnych ste­ roidów, m.in. progesteronu, umożliwia diagnozę jeszcze innego wrodzonego zaburzenia metabolicznego, jakim jest zespół SLO (Smitha­Lemliego­Opitza), który charak­ teryzuje się niezdolnością do wytwarzania cholesterolu przez chorych. Brak diagnozy bądź błędna diagnoza może prowadzić nawet do śmierci. Chorzy odznaczają się szeregiem szczególnych cech zarówno w wyglądzie zewnętrznym, jak i wewnętrznym, a stopień zmian jest zależny od ilości cholesterolu oraz jego metabolitów obecnych w surowicy krwi (7, 8). Połączenie GC­MS otwiera możliwości analityczne także w przypadku innej powszechnie występującej choroby metabolicznej – cu­ krzycy. Przeprowadzone w Chinach badania polegające na wykonaniu profili metabolicznych wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) oraz zidentyfikowaniu biowskaźni­ ków, pozwoliły rozróżnić pacjentów z cukrzycą typu 2 oraz cierpiących na IPD (ang. isolated post-challenge

diabetes) od grupy kontrolnej (9). Za potencjalne biomar­

kery IPD uznano kwas palmitynowy, stearynowy, oleino­ wy, linolowy i α­linolenowy. Użycie techniki LC­MS/MS

tzw. nieinwazyjnych wskaźników zdrowia (15). W ludzkim oddechu standardowo oznacza się zaledwie kilka związ­ ków, w tym tlenek azotu będący markerem astmy, czy 13C­mocznik w przypadku podejrzenia infekcji bakteriami

Helicobacter pylori.

Dzięki wykorzystaniu techniki GC­MS możliwe jest oznaczenie oraz zbadanie wskaźników charakterystycz­ nych dla astmy oraz alergicznego nieżytu nosa (21). Badania te niosą ze sobą istotną wartość poznawczą oraz terapeutyczną. Ponadto stanowią ważne narzędzie w diagnostyce oraz w badaniach klinicznych z zakresu farmakologii. Zastosowanie chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (22) pozwala na ozna­ czenie w osoczu pacjentów poddanych terapii antyaler­ gicznej substancji czynnych leków przeciwhistamino­ wych oraz jednoczesną identyfikację pseudoefedryny i cetyryzyny.

D i a g n o s t y k a c h o r ó b u k ł a d u s e r c o w o - n a c z y n i o w e g o

Kolejny obszar wykorzystania technik łączonych sta­ nowi diagnostyka chorób układu sercowo­naczyniowego. Nowoczesne technologie wykorzystujące spektrometrię mas i magnetyczny rezonans jądrowy umożliwiają ozna­ czanie i monitorowanie wielu substancji obecnych w tkankach oraz płynach ustrojowych, mających znaczenie dla prawidłowego funkcjonowania układu sercowo­na­ czyniowego (23). Wśród związków tych wyróżnia się m.in tłuszcze, cukry, kwasy organiczne oraz aminokwasy. Zna czący wpływ na występowanie chorób tego układu ma palenie papierosów (24). Wykorzystanie metody GC­MS pozwala na zbadanie biowskaźników stresu oksydacyj­ nego w moczu i osoczu palaczy oraz osób niepalących. Osoby palące, nawet w czasie nocnej abstynencji nikoty­ nowej, charakteryzują się podwyższoną ilością niektórych substancji w odniesieniu do niepalących. Zaobserwowa­ no u nich m.in. odmienny skład kwasów tłuszczowych w osoczu. Stężenia biomarkerów zaburzeń oksydacyjnych są większe u palaczy niż u osób niepalących, nawet w czasie długotrwałego snu. Sprzężenie chromatografii gazowej ze spektrometrią mas służy również do ozna­ czania w oddechu pacjentów ze stwierdzoną przewlekłą niewydolnością serca poziomu innego wskaźnika stresu oksydacyjnego, jakim jest izopren (25). Poszukiwanie markerów stresu tlenowego opiera się również na bada­ niu składu lipidów błony komórkowej erytrocytów u cu­ krzyków (26). Przeprowadzone badania z zastosowaniem GC­MS wykryły w komórkach krwi produkty utleniania cholesterolu, tj. 3,5,7­cholestarien, który stanowi marker przedklinicznej miażdżycy tętnic (26).

D i a g n o s t y k a c h o r ó b n e u r o l o g i c z n y c h

Choroby neurologiczne mają niezwykle ważny wpływ na właściwe funkcjonowanie organizmu, w tym ośrodko­ wego układu nerwowego (ang. Central Nervous System – CNS), obwodowego układu nerwowego. Ponadto mają istotny wpływ na zachowanie człowieka i stanowią duże wyzwanie zarówno w obszarze diagnostycznym, ra diologicznych. Na podstawie wyników uzyskanych me­

todą analizy multiwariacyjnej stwierdzono, że substancje obecne w oddechu osób dotkniętych tym schorzeniem oraz grupy kontrolnej różnią się zasadniczo. U chorych zidentyfikowane zostały liniowe oraz rozgałęzione wę­ glowodory C14 i C23, które potencjalnie mogą pełnić funkcję wskaźników tej choroby. Innym nowotworem, który stanowi ogromne zagrożenie dla mężczyzn, jest rak prostaty (16). Szacowano, iż w samych Stanach Zjed­ noczonych w 2011 roku miało zostać zdiagnozowanych ok. 240 000 nowych przypadków zachorowań. W celu identyfikacji biomarkerów tego schorzenia zespół ame­ rykańskich naukowców wykorzystał sprzężenie NMR­MS. Badania wykazały charakterystyczny spadek ilości cy­ trynianów, poliamidów oraz jednoczesny wzrost ilości cholin, glicerofosfolipidów, a także mleczanów w moczu i osoczu. W skali światowej największą ilością zgonów wśród chorób nowotworowych odznacza się rak jelita grubego, co powoduje konieczność poszukiwania no­ wych metod diagnostycznych oraz terapeutycznych. Po raz pierwszy Zimmermann i wsp. (17) zbadali różnice jakościowe w profilach lotnych metabolitów komórek rakowych jelita grubego w stosunku do zdrowych ko­ mórek, wykorzystując w tym celu sprzężenie GC­MS. W profilach badanych osób widać było istotne różnice wśród alkoholi i ketonów. techniki sprzężone znalazły także zastosowanie w monitorowaniu terapii nowotwo­ rowych. Jednym z poznanych sposobów leczenia jest terapia borowo­neutronowa (ang. Boron Neutron Capture

Therapy – BNCt), która wykorzystywana jest w leczeniu

niektórych nowotworów, w tym także mózgu (18). Meto­ da opiera się na wprowadzeniu do organizmu chorego nieradioaktywnych związków boru. Dzięki stosunkowo selektywnemu osadzaniu się tych substancji w tkankach rakowych możliwe jest niszczenie komórek nowotwo­ rowych po naświetleniu pacjenta wiązką neutronów. Najczęściej monitorowanie terapii prowadzi się, badając próbki moczu pacjentów przy zastosowaniu elektrofore­ zy kapilarnej sprzężonej ze spektrometrią mas CE­MS. Zespół Zorza i Puzzo (19) zastosował połączenie LC­MS do oznaczenia i monitorowania w osoczu krwi, moczu i kale pacjenta alkaloidowego leku podawanego w terapii nowotworowej.

D i a g n o s t y k a c h o r ó b p ł u c

Diagnostyka chorób płuc charakteryzuje się dużą róż­ norodnością stosowanych metod badawczych w zależ­ ności od rozpoznawanego schorzenia. Znane są badania prowadzone nad poszukiwaniem biomarkerów nowo­ tworów płuc. Inny obszar działań naukowców w zakresie analizy wydychanego przez człowieka powietrza opiera się na poszukiwaniu lotnych biowskaźników np. gruź­ licy (20). Najbardziej odpowiednia w tym celu okazała się metoda GC­MS. Dzięki niej można zidentyfikować wiele związków, m.in. naftalen, heptan, 1­metyloetyl czy cykloheksan. Na podstawie analiz rozróżniono wśród ba­ danej populacji gruźlików i osoby zdrowe. Lotne związki organiczne (ang. Volatile Organic Compounds – VOC) znajdujące się w wydychanym powietrzu są zaliczane do

neuropoznawczych mózgu (31). Analiza ilościowa oraz jakościowa kwasów organicznych (m.in. kwasu homowa­ nilinowego oraz wanilinomigdałowego) w moczu dzieci autystycznych z zastosowaniem technik chromatogra­ ficznych stanowi cenne źródło informacji na temat pracy neuroprzekaźników oraz występujących tzw. zaburzeń współtowarzyszących (32).

PODSUMOWANIE

Analiza płynów ustrojowych, w tym głównie moczu oraz krwi, umożliwia nie tylko diagnozę i rozpoznanie wielu schorzeń, lecz także jest kluczowa w monitoro­ waniu przebiegu choroby oraz ma istotne znaczenie w prowadzeniu terapii u pacjenta. Nie tylko obecność, ale również brak niektórych składników może być istotnym źródłem informacji na temat stanu zdrowia pacjenta. Pośród różnych metod diagnostycznych stosowanych w obszarze medycyny metody łączone są w diagnostyce i profilaktyce wielu chorób coraz częściej wykorzystywane. Stają się obok innych metod diagnostycznych, tj. badań endoskopowych, ultrasonograficznych, istotnym narzę­ dziem w ręku lekarzy. Coraz częstsze wprowadzanie ich do diagnostyki stwarza ogromne możliwości poznawcze danej choroby i umożliwia podjęcie odpowiednich działań ze strony lekarzy.

Piśmiennictwo

1. Witkiewicz Z, Czaplińska-Kałużna J: Podstawy chromatografii i tech-nik elektromigracyjnych. Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, Warszawa 2011. 2. Kałużna-Czaplińska J, Grys W, Rynkowski J: Techniki łączone oparte na spektrometrii mas we współczesnych badaniach klinicznych. Medycyna rodzinna 2009; 1: 15-21. 3. Kałużna-Czaplińska J, Socha E, Rynkowski J: Wartość badań chromatograficznych we wczesnym rozpo-znaniu zaburzeń rozwojowych u dzieci na przykładzie autyzmu. Nowa Pediatria 2011; 2: 37-41. 4. Bowron A, Scott JG, Brewer C et al.: Increased HVA detected on organic acid analysis in a patient with Costello syndrome. J Inherit Metab Dis 2005; 28: 1155-1156. 5. Kuhara T: Diagnosis of inborn errors of metabolism using filter paper urine, urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B 2001; 758: 3-25. 6. Barshop BA: Metabolomic approaches to mitochon-drial disease. Correlation of urine organic acids. Mitochondrion 2004; 4: 521-527. 7. Macros J, Guo LW, Wilson WK et al.: The implications of 7-dehydrosterol-7-reductase deficiency (Smith-Lemli-Opitz syndrom) to neurosteroid production. Steroids 2004; 69: 51-60. 8. Sieja A, Bujewski M, Misiuk-Hojło M: Powikłania oczne w zespole Smitha-Lemliego-Opitza. No-winy Lekarskie 2009; 78: 60-62. 9. Liu L, Li Y, Guan C et al.: Sun. Free fatty acid metabolic profile and biomarkers of isolated post-challenge diabetes and type 2 diabetes mellitus based on GC-MS and multivariate statistical analisis. J of Chromatogr B 2010; 878: 2817-2825. 10. Ferrer I, Ruiz- -Sala P, Vincente Y et al.: Separation and identification of plasma short- -chain acylocarnitine isomers by HPLC/MS/MS for the differential diagnosis of fatty acids oxidation defects and organic acidemias. J Chromatogr B 2007; 860: 121-126. 11. Jansson J, Willing B, Lucio M et al.: Metabolom-ics reveals metabolic biomarkers of Crohn’s disease. PLoS ONE 2009; 4: e6386. 12. Chiaradonna F, Moresco RM, Airoldi C et al.: From cancer metabolism to new biomarkers and drug targets. Biotechnology Advances 2012; 30: 30-51. 13. Wuwen LV, Tongshu Y: Identification of possible biomarkers for breast cancer from free fatty acid profiles determined by GC-MS and multivariate statistical analysis. Clinical Biochemistry 2012; 45: 127-133. 14. Kischkel S, Miekisch W, Sawacki A et al.: Breath biomark-ers for lung cancer detection and assessment of smoking related effects jak i terapeutycznym. Nieprawidłowości w przypadku

chorób neurologicznych dotyczą nie tylko ośrodkowego układu nerwowego, ale także naczyń krwionośnych od­ powiedzialnych za transport krwi do mózgu. Zaburzenia CNS (27) związane są z szeregiem nieprawidłowości metabolicznych, błędnym funkcjonowaniem systemów neuroprzekaźników (tj. dopaminy, serotoniny, kwasu gamma­aminomasłowego (GABA) oraz glutaminy) i stresem oksydacyjnym. Możliwe jest śledzenie procesów zachodzących w wielu szlakach metabolicznych. te z kolei stanowią kluczową informację w poszukiwaniu biowskaźników różnych chorób, w tym także choroby Alzheimera, schizofrenii czy zaburzeń depresyjnych (ang. Major Depressive Disorder – MDD). Zastosowanie techniki magnetycznego rezonansu jądrowego umożli­ wia badanie tkanek oraz osocza u pacjentów ze zdia­ gnozowaną schizofrenią. Połączenie GC­MS i LC­MS jest wykorzystywane do oznaczenia wielu metabolitów (kwasów organicznych, aminokwasów, cukrów, alkoholi, amin, amidów i tioli) w płynach ustrojowych. Uzyskane dotychczas wyniki posłużyły do stworzenia profili meta­ bolicznych oraz identyfikacji biomarkerów zaburzeń CNS. Połączenie elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas z plazmą indukcyjnie sprzężoną CE­ICP­MS zostało z powodzeniem wykorzystane przez zespół Michalke (28) do identyfikacji manganu w osoczu i płynie mózgowo­­ ­rdzeniowym. toksyczność tego pierwiastka względem ośrodkowego układu nerwowego może prowadzić w efekcie do neurozwyrodnieniowych zaburzeń ruchu, przypominających chorobę Parkinsona. Versio i wsp. (29) wykorzystali osocze w celu oznaczenia w nim i identyfi­ kacji peptydów beta­amyloidowych (Ab) oraz markerów choroby Alzheimera (ang. Alzheimer Disease – AD) przy zastosowaniu metody LC­MS. Było to możliwe z uwagi na fakt, iż związki te gromadzą się pierwotnie w mózgu, a następnie we krwi osób z tymi zaburzeniami. Pomocną w tego typu badaniach okazała się także LC­MS ze względu na dużą czułość. Zespół chińskich naukowców podjął się oznaczenia nasyconych oraz nienasyconych kwasów tłuszczowych w surowicy osób hospitalizowanych oraz grupy kontrolnej przy użyciu połączenia GC­MS. Poziomy niektórych z nich (C14:0, C16:0, C18:1, C18:3, C22:6) okazały się znacznie niższe u osób chorych. Wyniki otrzymane metodą statystycznej analizy multiwariacyjnej pozwalają wysnuć wniosek, iż związki te mogą zostać uznane za potencjalne biomarkery AD. technika ta służy również do oznaczenia w moczu (30) substancji psycho­ aktywnej występującej w mózgu – β­fenyloetyloaminy (PEA). Pełni ona funkcję neuroprzekaźnika, a jej niski poziom jest charakterystyczny dla osób cierpiących na depresję. Coraz większym zainteresowaniem cieszą się badania w zakresie autyzmu. Choroba ta definiowana jest jako zaburzenie ogólnorozwojowe, dla którego cha­ rakterystycznymi cechami jest występowanie szeregu nieprawidłowości w obszarze trzech podstawowych sfer życia codziennego: interakcji społecznych, zdolności do komunikacji oraz powtarzalności zachowań. Mimo iż nie­ znana jest dokładna jej etiologia, wiele z poznanych teorii upatruje przyczyn autyzmu we wczesnych uszkodzeniach

Metabolomics to Cardiovascular Biomarker and Pathway Discovery. Jour-nal of the Americal College of Cardiology 2008; 52: 117-123. 24. Seet RC, Lee CY, Loke WM et al.: Biomarkers of oxidative damage in cigarette smok-ers: Which biomarkers might reflect acute versus chronic oxidative stress? Free Radical Biology & Medicine 2011; 50: 1787-1793. 25. McGrath LT, Patric R, Silke B: Breath isoprene in patients with heart failure. Eur J Heart Failure 2001; 3: 423-427. 26. Miwa S, Inouye M, Ohmura C et al.: Relation-ship between carotid atherosclerosis and erythrocyte membrane choleste-rol oxidation products in type 2 diabetic patients. Diabetes Res Clin Pract 2003; 61: 81-88. 27. Quinones MP, Kaddurah-Daouk R: Metabolomics tools for identifying biomarkers for neuropsychiatric diseases. Neurobiology of Disease 2009; 35: 165-176. 28. Michalke B, Berthele A, Mistriotis P et al.: Manganese species from human serum, cerebrospinal fluid analyzed by size exclusion chromatography-, capillary electrophoresis coupled to induc tively coupled plasma mass spectrometry. J Trace Elem Med Biol 2007; 21: 4-9. 29. Kałużna-Czaplińska J: Current medical research with the applica tion of coupled techniques with mass spectrometry. Med Sci Monit 2011; 17: 117-123. 30. Clarke A, Brewer F, Johnson ES et al.: A new formulation of selegiline: improved bioavailability and selectivity for MAO-B inhibition. J Neural Transm 2003; 110: 1241-1255. 31. Kałużna-Czaplińska J, Grys W, Rynkowski J: Czynniki neurotoksyczne w środowisku życia dzieci przyczy-ną zaburzeń rozwojowych w aspekcie autyzmu. Nowa Pediatria 2008; 3: 50-57. 32. Kałużna-Czaplińska J, Socha E, Rynkowski J: Wartość badań chromatograficznych we wczesnym rozpoznaniu zaburzeń rozwojowych u dzieci na przykładzie autyzmu. Nowa Pediatria 2011; 2: 37-41.

– confounding variables, influence of normalization and statistical al-gorithms. Clinica Chimica Acta 2010; 411: 1637-1644. 15. Gaspar EM, Lucena AF, Duro da Costa J, Chaves das Neves H: Organic metabolites in exhaled human breath – A multivariate approach for identification of biomarkers in lung disorders. J of Chromatogr A 2009; 1216: 2749-2756. 16. Trock BJ: Application of metabolomics to prostate cancer. Uro logic Oncology: Seminars and Orginal Investigations 2011; 29: 572-581. 17. Zimmermann D, Hartmann M, Moyer MP et al.: Determination of volatile products of human colon cell line metabolism by GC/MS analysis. Metabolomics 2007; 3: 13-17. 18. Pitois A, de las Heras LA, Zampolli A et al.: Capillary electrophoresis-electrospray mass spectrometry and HR-ICP-MS for the detection and quantification of 10_{B-boronophenylalanine}

(10_{B-BPA) used in boron neutron capture therapy. Anal Bioanal Chem}

2006; 384: 751-760. 19. Mei S, Yao Q, Wu C, Xu G: Determination of urinary 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine by two approaches-capillary electro-phoresis and GC MS: An assay for in vivo oxidative DNA damage patients. J Chromatogr B 2005; 827: 83-87. 20. Philips M, Cataneo RN, Condos R et al.: Volatile biomarkers of pulmonary tuberculosis in the breath. Tu-berculosis 2007; 87: 44-52. 21. Diamant Z, Boot JD, Mantzouranis E et al.: Biomarkers in asthma and allergic rhinitis. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics 2010; 23: 468-481. 22. Ming M, Feng F, Sheng Y et al.: Development and evaluation of an efficient HPLC/MS/MS method for the simultaneous determination of pseudoephedrine and cetirizine in human plasma: application to phase-I pharmacokinetic study. J of Chromatogr B 2007; 846: 105-111. 23. Lewis GD, Asnani A, Gerszten RE: Application of

Adres do korespondencji: *Joanna Kałużna-Czaplińska Instytut Chemii Ogólnej i Ekologicznej Wydział Chemiczny Politechnika Łódzka ul. Żeromskiego 116, 90-924 Łódź tel.: +48 (42) 631-31-10 e-mail: jkaluzna@p.lodz.pl nadesłano: 04.12.2012 zaakceptowano do druku: 05.02.2013