Medycyna Wet. 2008, 64 (11) 1340
Praca oryginalna Original paper
Plazma nasienia jest z³o¿onym pod wzglêdem sk³a-du p³ynem zawieraj¹cym zarówno sk³adniki ne, jak i nieorganiczne. Sporód zwi¹zków organicz-nych bia³ka stanowi¹ najwiêkszy procentowy udzia³. Synteza tego kompleksu bia³ek zachodzi w j¹drach, naj¹drzach i w dodatkowych gruczo³ach p³ciowych, do których zalicza siê: gruczo³y pêcherzykowe, gru-czo³ krokowy i grugru-czo³y opuszkowo-cewkowe (3, 7, 12). Rodzina psowatych Canidae jest szeroko repre-zentowana przez psy i lisy. Wymienione gatunki cha-rakteryzuj¹ siê miêdzy innymi tym, i¿ posiadaj¹ tylko jeden gruczo³ dodatkowy prostatê. Dlatego te¿ zmie-niaj¹ca siê zawartoæ bia³ka w plazmie nasienia wiad-czy o zmieniaj¹cym siê ich procentowym udziale w wydzielinach naj¹drzy i gruczo³u krokowego pro-staty (2, 13). St¹d oznaczenie zawartoci i okrelanie heterogennoci bia³ek stanowi podstawê do uzyska-nia wstêpnych informacji niezbêdnych do dalszej iden-tyfikacji enzymów, hormonów czy innych zwi¹zków bia³kowych, takich jak: inhibitory proteinaz,
glikopro-teiny (4). Wystêpuj¹ce w plazmie nasienia bia³ka pe³-ni¹ wiele fizjologicznych funkcji zarówno w uk³adzie rozrodczym mêskim (1), jak i ¿eñskim po zap³od-nieniu (3, 14). Jednak najwa¿niejsz¹ rol¹ bia³ek plaz-mowych jest ochrona plemników (poprzez stabiliza-cjê ich b³on komórkowych), co z kolei warunkuje zdol-noæ zap³adniaj¹c¹ plemników i w rezultacie decydu-je o p³odnoci danego samca. Dlatego coraz czêciej dokonuje siê identyfikacji i powi¹zania bia³ek plazmy nasienia z p³odnoci¹ (4).
W dostêpnym pimiennictwie niewiele uwagi po-wiêca siê bia³kom plazmowym nasienia lisa polarne-go. St¹d potrzeba przeprowadzenia badañ, których celem by³a ocena sk³adu bia³kowego plazmy nasienia lisa polarnego przy u¿yciu metod elektroforetycznych, a tak¿e porównanie uzyskanych profili bia³kowych pomiêdzy pocz¹tkiem a koñcem sezonu reprodukcyj-nego. Okrelono tak¿e korelacje miêdzy wzglêdn¹ ilo-ci¹ poszczególnych frakcji bia³kowych a wyznaczni-kami jakociowymi nasienia.
Profile bia³kowe plazmy nasienia lisa polarnego
na pocz¹tku i na koñcu sezonu reprodukcyjnego
KAROLINA STASIAK, BOGDAN JANICKI, RADOS£AW KOWALSKI*, JAN GLOGOWSKI*
Katedra Biologii Ma³ych Prze¿uwaczy i Biochemii rodowiska Wydzia³u Hodowli i Biologii Zwierz¹t UTP, ul. Mazowiecka 28, 85-024 Bydgoszcz
*Zak³ad Andrologii Molekularnej Instytutu Rozrodu Zwierz¹t i Badañ ¯ywnoci PAN, ul. Tuwima 10, 10-747 Olsztyn
Stasiak K., Janicki B., Kowalski R., Glogowski J. Protein profile of the polar foxs semen plasma at the beginning and at the end of the reproductive season
Summary
The aim of the studies was to assess the protein composition of the polar foxs (Alopex lagopus L.) semen plasma with the use of the electrophoretic method (SDS-PAGE) and to find out whether there are statistically important differences in the protein profiles between the beginning and the end of the reproductive period and between the selected proteins and the semen traits. The examined material was the semen plasma obtained with the use of the manual method from nine nine-year-old polar foxes. Both in the plasma obtained at the beginning and at the end of the season ten protein fractions (10.9÷107.5 kDa) were distinguished. On the basis of the densitometric analysis of electrophoretic images, a quantitative decrease of multimolecular forms at the end of the reproductive period was observed. This may indicate either a decreasing synthesis of proteins in the reproductive system or partial proteolysis in progress. The analysis of correlations, in turn, indicated significant relationships (p < 0.05) between the masses of protein fractions (107.5 and 58.9 kDa) and the volume of the semen collected at the beginning of the season (r = 0.76 and r = 0.72 respectively): between proteins 74.8 and 34.9 kDa and the volume of the semen at the end of the season (r = 0.92 and r = 0.79 respectively), and also between proteins 58.9; 34.9; 27.0 and the percentage of the sperm with major flaws in the semen collected at the beginning of the reproductive season (r = 0.69; r = 0.89 and r= 0.76 respectively). Even though significant correlations between the plasma proteins and the traits of the semen obtained from young (one-year-old) individuals were observed, it is necessary to continue the research with reference to older animals (two-year-old foxes).
Medycyna Wet. 2008, 64 (11) 1341 Materia³ i metody
Przygotowanie materia³u dowiadczalnego. Badania przeprowadzono na nasieniu lisów polarnych Alopex lago-pus L. pobrane od dziewiêciu jednorocznych osobników po-chodz¹cych z fermy zwierz¹t futerkowych w województwie kujawsko-pomorskim. Próbki nasienia pozyskano metod¹ manualn¹ na pocz¹tku (po³owa lutego) i na koñcu (po³owa kwietnia) sezonu reprodukcyjnego tego gatunku. Po odwirowaniu plemników z ejakula-tów (10 minut przy 8000 × g) uzyskano plazmê na-sienia, w której oznaczono profil elektroforetyczny bia³ek. Przed wykonaniem rozdzia³u elektroforetycz-nego w próbach oznaczono równie¿ zawartoæ bia³-ka ca³kowitego z wykorzystaniem metody Lowry i wsp. (6). Niniejsze badania wykonano w Instytucie Rozrodu Zwierz¹t i Badañ ¯ywnoci Polskiej Aka-demii Nauk w Olsztynie.
Elektroforeza denaturuj¹ca SDS-PAGE. Procen-towy udzia³ poszczególnych frakcji bia³kowych w pró-bach plazmy nasienia okrelono na podstawie roz-dzia³u elektroforetycznego w warunkach denaturuj¹-cych (SDS-PAGE) zgodnie z metodyk¹ opracowan¹ przez Laemmliego (5) z zastosowaniem aparatu Mighty Small II firmy Amersham Pharmacia Biotech. (Szwecja). Przed elektroforez¹, próby plazmy nasie-nia rozcieñczono roztworem soli fizjologicznej w sto-sunku 1 : 3, a nastêpnie uzyskany roztwór zmieszano z buforem lizuj¹cym zawieraj¹cym SDS i DTT (di-tiotreitol) w stosunku 1 : 1. Z tak przygotowanej mie-szaniny pobrano 5 µl i naniesiono do odpowiednich studzienek startowych. Jako wzorce mas cz¹steczko-wych zastosowano zestaw od 7,2 kDa do 206,0 kDa firmy BIO-RAD. Rozdzia³ elektroforetyczny prowa-dzono przy sta³ym natê¿eniu 40 mA i napiêciu 200 V w 12,5% ¿elu poliakrylamidowym, przy zastosowa-niu buforu Tris-glicyna-SDS (pH 8,3). Po zakoñczo-nym rozdziale elektroforetyczzakoñczo-nym (ok. 90 minut) ¿ele barwiono 0,1% roztworem Coomassie Brillant Blue R-250. Z tak przygotowanego elektroforegramu, na podstawie mas molekularnych wzorców (7,2÷206,0 kDa), wyznaczono masy cz¹steczkowe rozdzielonych frakcji bia³kowych, a w przeprowadzonej analizie den-sytometrycznej oznaczono relatywn¹ gêstoæ optycz-n¹ (RGO) pr¹¿ków bia³kowych. Do analizy poszcze-gólnych elektroforegramów zastosowano program Kodak 1D (Eastman Kodak company, New Haven, USA).
W celu porównania relatywnych gêstoci optycz-nych poszczególoptycz-nych frakcji bia³kowych w plazmie pozyskanej na pocz¹tku i na koñcu sezonu reproduk-cyjnego zastosowano test t-Studenta, za ocenê wspó³-zale¿noci miedzy zmiennymi
przepro-wadzono w oparciu o wspó³czynnik korelacji Spearmana.
Wyniki i omówienie
Wybrane wskaniki ejakulatów zebrano w tab. 1. Zawartoæ bia³ka ogólnego by³a dwukrotnie wy¿sza od wyników uzyskanych dla plaz-my nasienia psów, u których
war-toæ ta wynosi³a 21,9 mg/cm3 (9). W plazmie nasienia
uzyskanej na pocz¹tku sezonu zawartoæ bia³ka ogól-nego by³a nieco wy¿sza ani¿eli w plazmie z koñca se-zonu, co znalaz³o potwierdzenie w intensywniejszym zabarwieniu elektroforegramów (ryc. 1 i 2).
a k s W kni Pocz¹teksezonu Koniecsezonu Zakre(s8,u1C0a)nine m c ( u t a l u k a j e æ o t ê j b O 3) 0,33±0,14 0,61±0,25 1,5-5,6 0 1 ( w ó k i n m e l p a j c a rt n e c n o K 6/cm3) 819,69±294,67 300,28±151,38 134,2-980,6 % h c y n l a m r o n w ó k i n m e l p k e t e s d O 89,30±3,37 92,18±2,01 42,5-91 m c / g m ( a i n e i s a n e i m z a l p w e n l ó g o o k ³ a i B 3) 46,18±10,03 44,87±16,31 11,2-51,9
Tab. 1. Wybrane wyznaczniki jakociowe ejakulatów (x ± s)
Ryc. 1. Profile bia³kowe plazmy nasienia lisa polarnego uzyskane na pocz¹tku sezonu rozrodczego
Objanienia: 7 standardy mas; 1-6 oraz 8-10 badane próbki plazmy nasienia
Ryc. 2. Profile bia³kowe plazmy nasienia lisa polarnego uzyskane na koñcu sezonu rozrodczego
Objanienia: jak na ryc. 1.
+
kDa kDa 51,4 34,7 28,1 20,4 7,2 206,0 91,0 119,0 107,5 30,6 27,0 24,7 10,9 50,4 43,5 34,9 74,8 58,9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10–
+
–
kDa kDa 91,0 7,2 28,1 20,4 51,4 34,7 206,0 119,0 107,5 74,8 34,9 58,9 30,6 27,0 24,7 10,9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Medycyna Wet. 2008, 64 (11) 1342
Analiza uzyskanych rozdzia³ów wykaza³a podobieñ-stwo w profilach bia³kowych plazmy nasienia pozy-skanej od samców zarówno na pocz¹tku, jak i na koñ-cu sezonu rozrodczego. Zastosowany w rozdzia³ach elektroforetycznych SDS spowodowa³ rozbicie bia³ek plazmy nasienia lisa polarnego na podjednostki ³añ-cuchy polipeptydowe, a u¿yty dodatkowo DTT (ditio-treitol), ze wzglêdu na obecnoæ w swym sk³adzie dwóch grup tiolowych, zredukowa³ mostki disiarcz-kowe wystêpuj¹ce w bia³kach.
Na elektroforegramie przedstawiaj¹cym bia³ka na-sienia z pocz¹tku sezonu we wszystkich próbach stwierdzono obecnoæ dziesiêciu ró¿nych frakcji bia³-kowych (10,9 ÷ 107,5 kDa). Frakcja o najwiêkszej masie cz¹steczkowej (107,5 kDa) stanowi³a pasmo o najs³abszej intensywnoci (RGO = 0,0081 czyli 0,81% ca³kowitej gêstoci optycznej profilu bia³ek). W nieco wiêkszej iloci wystêpowa³y bia³ka o masie 50,4 i 43,5 kDa. Oko³o 4÷6-krotnie wiêksz¹ od nich, wartoci¹ relatywnej intensywnoci (relatywnej gês-toci optycznej RGO) charakteryzowa³y siê bia³ka o masie 78,4; 58,9; 34,9 i 30,6 kDa. Pr¹¿ki bia³kowe o masie cz¹steczkowej 27 i 24,7 kDa w porównaniu z frakcj¹ o masie 50,4 kDa posiada³y a¿ 10-krotnie wy¿sze wartoci relatywnej gêstoci optycznej. Spo-ród wszystkich dziesiêciu frakcji bia³kowych w ba-danych plazmach najwiêkszy udzia³ stanowi³o bia³ko o niskiej masie cz¹steczkowej (10,9 kDa). Uzyskane w tym przypadku najintensywniejsze zabarwienie pas-ma znalaz³o odzwierciedlenie w najwy¿szej wartoci relatywnej gêstoci optycznej (RGO = 0,457, co ozna-cza 45,7% ca³kowitej gêstoci optycznej profilu bia-³ek).
Ryc. 2. przedstawia profil elektroforetyczny bia³ek plazmy nasienia pobranej od dziewiêciu osobników pod koniec sezonu. Na podstawie uzyskanego elek-troforegramu stwierdzono we wszystkich badanych plazmach obecnoæ omiu frakcji bia³kowych (zakres od 10,9 do 107,5 kDa). Podobnie jak na pocz¹tku se-zonu, najs³absz¹ intensywnoci¹ barwy charakteryzo-wa³o siê pasmo odpowiadaj¹ce bia³ku o najwiêkszej masie cz¹steczkowej 107,5 kDa. Kolejnym pasmem o niskiej wartoci RGO charakteryzowa³o siê bia³ko o masie 30,6 kDa. Pozosta³e pr¹¿ki odpowiadaj¹ce po-szczególnym frakcjom bia³kowym by³y silniej zazna-czone, przez co charakteryzowa³y siê wy¿szymi war-tociami relatywnej intensywnoci. Najwiêkszy pro-centowy udzia³ przypad³ na bia³ka o nastêpuj¹cej ma-sie cz¹steczkowej: 74,8; 58,9; 34,9; 27 i 24,7 kDa. Ostatnim, wyró¿nionym pasmem by³o bia³ko (10,9 kDa) charakteryzuj¹ce siê najwy¿sz¹ wartoci¹ RGO (0,6167).
W dostêpnej literaturze brak jest informacji na te-mat profili bia³kowych w plazmie nasienia lisa polar-nego, dlatego uzyskane wartoci porównano z wyni-kami przedstawionymi przez innych autorów, a doty-cz¹cymi innych gatunków. Podobny zakres wyró¿nio-nych frakcji bia³kowych (3,6 ÷ 100,6 kDa) do
otrzy-manego w badaniach w³asnych przedstawili Souza i wsp. (8), u¿ywaj¹c do rozdzia³u ¿eli poliakrylami-dowych o stê¿eniu 13 i 22%. Badania te dotyczy³y roz-dzia³u elektroforetycznego bia³ek plazmy nasienia psów. Sporód wyodrêbnionych frakcji bia³kowych zespó³ ten zidentyfikowa³, miêdzy innymi, bia³ko zwi¹-zane z heparyn¹ HBP (heparin-binding protein) o masie cz¹steczkowej oko³o 58,6 kDa. Natomiast w niniejszych badaniach wyodrêbniono frakcjê o ma-sie 58,9 kDa. Podobieñstwo mas cz¹steczkowych mo¿e sugerowaæ obecnoæ w plazmie nasienia lisów polar-nych bia³ka HBP, które mo¿e wywo³ywaæ reakcjê akro-somow¹ (10).
W obrazie elektroforetycznym plazmy nasienia uzys-kanej pod koniec sezonu reprodukcyjnego nie stwier-dzono obecnoci frakcji bia³kowych o masie cz¹stecz-kowej 50,4 i 43,5 kDa (ryc. 2). Prawdopodobnie poja-wiaj¹ce siê na pocz¹tku sezonu te dwa dodatkowe bia³-ka mog¹ byæ odpowiedzialne za dojrzewanie plemni-ków. Podobnym wnioskiem zakoñczy³y siê badania prowadzone u psów (9). Wyró¿niona w niniejszych badaniach frakcja (43,5 kDa) posiada³a zbli¿on¹ masê cz¹steczkow¹ do zidentyfikowanego wczeniej bia³-ka o masie 42,6 kDa (9), wydzielanego przez naj¹-drza. Pozosta³e frakcje bia³kowe, w zakresie od 30,6 do 107,5 kDa, wystêpowa³y relatywnie w wiêkszych stê¿eniach na pocz¹tku ni¿ na koñcu sezonu rozrod-czego. Z kolei w plazmie pozyskanej pod koniec okresu rozrodczego stwierdzono wiêkszy udzia³ bia³ek o ma-sie cz¹steczkowej 10,9 kDa ni¿ w plazmie pochodz¹-cej z pobrania pierwszego.
W wyniku porównania obrazów profili bia³kowych w analizowanych plazmach nasienia stwierdzono ilo-ciowy, statystycznie istotny spadek zawartoci form wysokocz¹steczkowych pod koniec sezonu reproduk-cyjnego (tab. 2). Potwierdzone to zosta³o jednoznacz-nie w badaniach densytometrycznych na podstawie
a w o k z c e t s ¹ z c a s a M ) a D k ( a n z c y t p o æ o t s ê g a n w y t a l e R u n o z e s k e t ¹ z c o p koniecsezonu 5 , 7 0 1 1 0,0081a±0,0051 0,0017b±0,0007 4 , 8 7 0,0342a±0,0163 0,01b±0,0057 9 , 8 5 0,0412a±0,0196 0,0134b±0,0079 4 , 0 5 0,0161±0,0052 5 , 3 4 0,0111±0,0081 9 , 4 3 0,0562a±0,0263 0,0111b±0,0063 6 , 0 3 0,0526a±0,0230 0,0049b±0,0084 0 , 7 2 0,1424±0,0284 0,1701±0,0313 7 , 4 2 0,1834±0,0182 0,1723±0,0292 9 , 0 1 0,457a±0,0630 0,6167b±0,0527
Tab. 2. Relatywna gêstoæ optyczna (RGO) pr¹¿ków bia³ko-wych plazmy nasienia uzyskanych w rozdziale z SDS-PAGE (x ± s)
Objanienia: wartoci oznaczone ró¿nymi literami w wierszu ró¿-ni¹ siê statystycznie istotnie przy p < 0,05
Medycyna Wet. 2008, 64 (11) 1343 okrelenia relatywnej
gê-stoci optycznej (RGO). Jedn¹ z wielu frakcji bia³-kowych, które wykazy-wa³y wyran¹ tendencjê spadkow¹ by³o bia³ko, którego masa cz¹steczko-wa (30,6 kDa) by³a zbli¿o-na do masy ok. 29,2 kDa wykazanej przez Souzê i wsp. (9). Miejscem syn-tezy wyró¿nionego przez tych autorów pasma bia³-kowego by³y naj¹drza oraz gruczo³ krokowy. Taka tendencja spadkowa mo¿e wiadczyæ albo o zmniej-szaj¹cej siê syntezie tych
bia³ek w uk³adzie rozrodczym, albo o zachodz¹cej ju¿ czêciowej proteolizie.
Przeprowadzona analiza korelacji wykaza³a ujem-ne, statystycznie istotne zale¿noci miêdzy objêtoci¹ ejakulatów pozyskanych na pocz¹tku sezonu a war-tociami relatywnej gêstoci optycznej pasm o masie 107,5 i 58,9 kDa. Z kolei istotne statystycznie do-datnie korelacje stwierdzono pomiêdzy objêtoci¹ na-sienia pozyskanego pod koniec sezonu rozrodczego a frakcjami bia³kowymi (o masie 107,5; 74,8 oraz 34,9 kDa). Wykazano równie¿ istotne statystycznie zale¿-noci miêdzy odsetkiem plemników z wadami g³ów-nymi plemników w nasieniu pobranym na pocz¹tku sezonu a wartociami relatywnej gêstoci optycznej pasm o masie 58,9 kDa i 34,9 kDa (korelacje dodat-nie) oraz 27,0 kDa (korelacja ujemna). W przeciwieñ-stwie do Souzy i wsp. (8), w badaniach w³asnych nie stwierdzono istotnych zale¿noci miêdzy pozosta³ymi wyznacznikami jakociowymi nasienia a wynikami analizy densytometrycznej poszczególnych pasm bia³-kowych.
Reasumuj¹c mo¿na stwierdziæ, ¿e w plazmie nasie-nia z ejakulatów pobranych pod koniec sezonu roz-rodczego jest mniej frakcji bia³kowych o wysokiej masie cz¹steczkowej. Uzyskane rezultaty pokrywaj¹ siê z wynikami z wczeniejszych badañ w³asnych (11). Wówczas wykazano w plazmie nasienia lisa polarne-go obecnoæ trzech form inhibitora o ró¿nym tempie migracji w polu elektrycznym. Ponadto pod koniec sezonu reprodukcyjnego obok wyranego obni¿enia aktywnoci antytrypsynowej w plazmie nasienia od-notowano tak¿e zanik formy o najwolniejszym tem-pie migracji (inhibitor wysokocz¹steczkowy). Ilocio-wy spadek form mo¿na t³umaczyæ zmniejszon¹ synte-z¹ tych bia³ek w uk³adzie rozrodczym lub zachodsynte-z¹c¹ ju¿ czêciow¹ proteoliz¹. W przeprowadzonych ba-daniach, pomimo stwierdzenia istotnych korelacji miê-dzy bia³kami plazmowymi a cechami nasienia, p³od-noæ u¿ytych lisów polarnych by³a nieznana (osobniki jednoroczne). St¹d te¿ ostro¿na interpretacja
uzyska-a h c e C Sezon Masacz¹steczkowapr¹¿kówbia³kowych(kDa) 5 , 7 0 1 74,8 58,9 34,9 30,6 27,0 24,7 10,9 u t a l u k a j e æ o t ê j b O A *0,76* 0,54 *0,72* 0,16 0,15 0,55 0,01 0,23 B *0,91* *0,92* 0,46 *0,79* 0,37 0,57 0,28 0,27 a j c a rt n e c n o K w ó k i n m e l p A 0,18 0,20 0,08 0,28 0,43 0,03 0,40 0,43 B 0,28 0,15 0,33 0,28 0,14 0,09 0,00 0,08 w ó k i n m e l p k e t e s d O h c y n l a m r o n A *0,01* 0,24 0,12 0,05 0,21 0,08 0,20 0,08 B 0,20 0,10 0,14 0,57 0,35 0,09 0,34 0,35 w ó k i n m e l p k e t e s d O i m y n w ó ³ g i m a d a w z A 0,56 0,61 *0,69* *0,89* 0,15 *0,76* 0,55 0,56 B 0,43 0,24 0,06 0,26 0,02 0,43 0,29 0,06 w ó k i n m e l p k e t e s d O i m y n w ó ³ g i m a d a w z A 0,17 0,45 0,30 0,22 0,22 0,18 0,21 0,30 B 0,03 0,05 0,13 0,44 0,48 0,00 0,47 0,38
Tab. 3. Wspó³czynniki korelacji miêdzy bia³kami plazmy a wybranymi cechami nasienia
Objanienia: A pocz¹tek sezonu; B koniec sezonu; * istotnoæ przy p < 0,05
nych wyników. Kontynuacja i rozszerzenie metodyki badañ umo¿liwi wiêksz¹ rozdzielczoæ rozdzielanych bia³ek, lepsz¹ ich charakterystykê, a tak¿e pozwoli na wyszukanie w plazmie nasienia odpowiedniego mar-kera wskanika potencjalnej p³odnoci.
Pimiennictwo
1.Arangasamy A., Singh L. P., Ahmed N., Ansari M. R., Ram G. C.: Isolation and characterization of heparin and gelatin binding buffalo seminal plasma proteins and their effect on cauda epididymal spermatozoa. Anim. Reprod. Sci. 2005, 90, 243-254.
2.Janicki B., Soliñska J., £akota P.: Ocena jakoci i wartoci biologicznej na-sienia lisów polarnych w okresie sezonu rozrodczego. Medycyna Wet. 2006, 62, 1076-1079.
3.Jonáková V., Maòásková P., Tichá M.: Separation, characterization and identification of boar seminal plasma proteins. J. Chromat. B2007, 849, 307--314.
4.Kordan W., Strze¿ek J., Soliwoda D., Celewicz M., Mogielnicka G.: Mapo-wanie bia³ek plazmy nasienia knura przy wykorzystaniu metody elektrofore-zy dwukierunkowej w ¿elu poliakryloamidowym. Medycyna Wet. 2008, 64, 223-226.
5.Laemmli U. K.: Cleavage of structural proteins duringthe assembly of the head bacteriophage T4, Nature 1970, 227, 680-685.
6.Lowry O. H., Rosebrough N. J., Faar A. L., Randall R. J.: Protein measure-ment with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951, 193, 265-275. 7.Maòásková P., Liberda J., Tichá M., Jonáková V.: Isolation of
non-heparin--binding and heparinnon-heparin--binding proteins of boar prostate. J. Chromat. B 2002, 770, 137-143.
8.Souza F. F., Barreto C. S., Lopes M. D.: Characteristics of seminal plasma proteins and their correlation with canine semen analysis. Theriogenology 2007, 68, 100-106.
9.Souza F. F., Martins M. I. M., Lopes M. D.: Vasectomy effect of canine semi-nal plasma biochemical components and their correlation with semisemi-nal para-meters. Theriogenology 2006, 66, 1621-1625.
10.Souza F. F., Martins M. I. M., Santos Fernandes C. E., Ribolla P. E. M., Lopes M. D.: Heparin-binding proteins of canine seminal plasma. Therioge-nology 2006, 66, 1606-1609.
11.Stasiak K., Janicki B.: Aktywnoæ inhibitora trypsyny w plazmie nasienia lisa polarnego w sezonie rozrodczym. Medycyna Wet. 2007, 63, 990-993. 12.Strze¿ek J.: Plazma nasienia a niektóre funkcje biologiczne plemników. Post.
Biol. Kom. 1999, 26, Supl. 12, 59-68.
13.Strze¿ek R., Janowski T.: Markery enzymatyczne gruczo³u krokowego psa. Medycyna Wet. 2003, 59, 6-9.
14.Troedsson M. H., Desvousges A., Alghamdi A. S., Dahms B., Dow C. A., Hayna J., Valesco R., Collahan P. T., Macpherson M. L., Pozor M., Buhi W. C.: Components in seminal plasma regulating sperm transport and elimination. Anim. Reprod. Sci. 2005, 89, 171-186.
Adres autora: dr in¿. Karolina Stasiak, ul. Mazowiecka 28, 85-084 Byd-goszcz; e-mail: szynder@utp.edu.pl
