Medycyna Wet. 2008, 64 (7) 903
Praca oryginalna Original paper
Pierwsze informacje o wystêpowaniu bakterii spiral-nego kszta³tu w ¿o³¹dkach zwierz¹t pochodz¹ z koñca XIX wieku (12, 14). W 1892 r. w³oski badacz Giulio Bizzozero opisa³ spiralne bakterie w ¿o³¹dku psów. W póniejszym okresie równie¿ inni autorzy Salomon (1896), Jaworski (1899), Krienitz (1906), Weber (1958) stwierdzili drobnoustroje o podobnym wygl¹dzie w ¿o-³¹dku ludzi i zwierz¹t. Dominowa³ jednak pogl¹d, i¿ w zwi¹zku z wydzielaniem kwasu solnego w wietle ¿o³¹dka panuj¹ sterylne warunki i sama obecnoæ kwa-su wystarcza do uszkodzenia b³ony luzowej, w myl stwierdzenia Schwarza no acid no ulcer, czyli nie ma wrzodu bez kwasu. Dopiero po wyizolowaniu w 1983 r. przez Warrena i Marshalla drobnoustrojów kszta³tu spi-ralnego, nazwanych póniej Helicobacter pylori, na-ukowcy szerzej zajêli siê ich patogennym wp³ywem na przewód pokarmowy cz³owieka i zwierz¹t (1, 4, 18). Roz-wój nauki z wykorzystaniem technik molekularnych i mikroskopii elektronowej, pozwoli³ na identyfikacjê wielu gatunków drobnoustrojów nale¿¹cych do rodzaju Helicobacter. W ¿o³¹dku psów zidentyfikowano H. fe-lis, H. heilmannii (dawniej nazwane Gastrospirillum hominis), H. bizzozeronii, H. salomonis, H. canis, H. cy-nogastricus (1, 4, 8, 17).
Przewlek³e zapalenie ¿o³¹dka wystêpuje u psów doæ czêsto. Do tej pory rzadko dociekano przyczyn stanu zapalnego u tych zwierz¹t, wi¹¿¹c go zazwyczaj z obec-noci¹ paso¿ytów, reakcj¹ na antygeny bakteryjne,
aler-gi¹ lub nietolerancj¹ na pokarmy. Wielu badaczy suge-ruje, ¿e wyjanieniem etiologii stanu zapalnego mo¿e byæ obecnoæ bakterii z rodzaju Helicobacter w ¿o³¹dku zwierz¹t (13). Poznanie zwi¹zku miêdzy zaka¿eniem Helicobacter spp. a zapaleniem ¿o³¹dka u psów utrud-nia fakt, ¿e diagnostyka bakteriologiczna jest procedu-r¹ inwazyjn¹, wymagaj¹c¹ pobrania w trakcie badania endoskopowego wycinków luzówki ¿o³¹dka. Dlatego poszukiwanie nieinwazyjnych metod diagnostycznych potwierdzaj¹cych zaka¿enie Helicobacter jest spraw¹ wci¹¿ aktualn¹ (11).
Celem badañ by³o okrelenie czêstoci wystêpowania przeciwcia³ skierowanych przeciw antygenom H. pylori i H. felis u psów.
Materia³ i metody
Ogó³em badaniami objêto 132 psy, od których próbki suro-wic oraz wycinki luzówki ¿o³¹dka pobrano w Katedrze Cho-rób Wewnêtrznych i Paso¿ytniczych z Klinik¹ ChoCho-rób Koni, Psów i Kotów przy Uniwersytecie Przyrodniczym we Wroc-³awiu.
Trzydzieci psów zaliczono do grupy kontrolnej (zwierzêta zdrowe), u których na podstawie wywiadu, badania kliniczne-go, wyników badañ hematologicznych i biochemicznych krwi nie stwierdzono ¿adnych zaburzeñ w funkcjonowaniu organiz-mu, a podczas badania endoskopowego (ocena makroskopo-wa) nie obserwowano zmian w b³onie luzowej, uznaj¹c j¹ za prawid³ow¹. Grupê badan¹ stanowi³y 102 zwierzêta z objawa-mi dyspeptycznyobjawa-mi, wskazuj¹cyobjawa-mi na choroby ¿o³¹dka
(wy-Przeciwcia³a w zaka¿eniach Helicobacter spp. u psów
GRA¯YNA GOCINIAK, MONIKA BIERNAT, KRZYSZTOF KUBIAK*, KATARZYNA PAWLUS, JOANNA GRABIÑSKA, MARCIN JANKOWSKI*
Katedra i Zak³ad Mikrobiologii AM, ul. Cha³ubiñskiego 4, 50-368 Wroc³aw
*Katedra Chorób Wewnêtrznych i Paso¿ytniczych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UP, Pl. Grunwaldzki, 50-366 Wroc³aw
Gociniak G., Biernat M., Kubiak K., Pawlus K., Grabiñska J., Jankowski M. Serum antibodies to Helicobacter spp. in dogs
Summary
The aim of the study was to evaluate the frequency of the presence of antibodies to Helicobacter pylori and Helicobacter felis antigens in dogs. One hundred thirty two dogs of different age and sex were included in the study and divided in two groups. Serum samples and gastric biopsy specimens were taken during gastro-intestinal endoscopy. The examined group consisted of 102 dogs with dyspeptic symptoms and pathological changes in gastric mucosa. The control group contained 30 clinically healthy animals. In the examined group Helicobacter spp. infection was established by direct microscopy and urease test. It was detected in 89.2% of the dogs, whereas in the control group, in 96.7% animals. In the culture of gastric biopsy specimens Helicobacter felis was the most frequently isolated strain. The anti-H. pylori IgG antibodies were detected in 24.5% serum samples of the examined dogs. The anti-H. felis IgG antibodies were identified in 30.4% samples of animals with gastritis and in 20% of healthy animals respectively. Antibodies of H. pylori antigens were not evaluated in healthy dogs. The antibodies to H. pylori and H. felis antigens were detected more frequently in dogs with gastritis than in healthy dogs.
Medycyna Wet. 2008, 64 (7) 904
mioty, zmniejszony lub brak apetytu, fetor ex ore, postêpuj¹ca utrata masy cia³a, bolesnoæ okolicy ¿o³¹dka). Do grupy bada-nej w³¹czono tak¿e zwierzêta, u których nie zanotowano opi-sanych objawów, ale u których podczas gastroskopii stwier-dzano makroskopowe zmiany w b³onie luzowej, wskazuj¹ce na zapalenie ¿o³¹dka.
Z pobranych wycinków b³ony luzowej ¿o³¹dka wykonano: test na produkcjê ureazy, badanie bakteriologiczne, badania histopatologiczne i preparat bezporedni mikrobiologiczny barwiony metod¹ Grama.
Wycinki b³ony luzowej ¿o³¹dka, bezporednio po pobra-niu, nak³adano na bibu³owy kr¹¿ek szybkiego testu urazowego (producent Instytut ¯ywnoci i ¯ywienia w Warszawie). Za-sada testu urazowego opiera siê na ocenie zdolnoci produkcji przez drobnoustroje z rodzaju Helicobacter du¿ej iloci urea-zy, która hydrolizuje w krótkim czasie (30-60 minut) zawarty w kr¹¿ku bibu³owym mocznik do dwutlenku wêgla i amonia-ku, powoduj¹c alkalizacjê rodowiska, a tym samym, zmianê zabarwienia wskanika.
Do badañ bakteriologicznych przeznaczano nastêpne wy-cinki, które poddawano homogenizacji i posiewano na pod³o-¿a wzrostowe: Columbia agar z dodatkiem 7% zhemolizowa-nej krwi koñskiej, Columbia agar z dodatkiem 7% zhemolizo-wanej krwi koñskiej oraz selektywnym suplementem wed³ug Denta (firmy Oxoid), Brucella agar z dodatkiem 7% zhemoli-zowanej krwi koñskiej i suplementem zawieraj¹cym: wanko-mycynê, polimyksynê i trimetoprim. Hodowlê inkubowano w 37°C przez 7-14 dni w warunkach mikroaerofilnych (10% CO2, 85%N2 i 5% O2). Wyizolowane szczepy Helicobacter ró¿nicowano biochemicznie (Api Campy firmy BioMerieux). Badanie serologiczne w kierunku obecnoci przeciwcia³ kla-sy IgG skierowanych przeciw H. pylori i H. felis wykonano w surowicach zwierz¹t rozcieñczonych 1 : 400 przy zastoso-waniu metody ELISA opisanej przez Gociniak i wsp. (5). Wy-niki odczytywano przy d³ugoci fali 450 nm na czytniku Dyna-tech MR500. Próbê uznawano za dodatni¹, je¿eli wartoæ eks-tynkcji wynosi³a 0,45 i powy¿ej.
Wyniki i omówienie
W ci¹gu ostatnich lat w ¿o³¹dku psów zidentyfikowa-no wiele ró¿nych gatunków z rodzaju Helicobacter oraz wykazano wspó³wystêpowanie kilku ró¿nych gatunków tych drobnoustrojów u jednego zwierzêcia (3, 8, 9, 16). Interesuj¹ce jest, ¿e czêsto zaka¿enie tymi bakteriami nie powoduje ¿adnych objawów klinicznych, a czêstoæ wystêpowania infekcji Helicobacter spp. jest podobna
u zwierz¹t chorych, jak i u zwierz¹t bez ¿adnych doleg-liwoci ze strony przewodu pokarmowego (6, 7, 12). W pimiennictwie nie brak jest danych potwierdzaj¹cych zwi¹zek zaka¿enia H. felis, jednego z g³ównych gatun-ków wykrywanych w ¿o³¹dku psów i kotów, z powsta-waniem zmian zapalnych ¿o³¹dka oraz wywo³ywaniu raka ¿o³¹dka, podobnie jak ma to miejsce w przypadku zaka¿enia H. pylori u ludzi (10). Pomimo prowadzonych w licznych orodkach badañ wiele pytañ dotycz¹cych udzia³u drobnoustrojów z rodzaju Helicobacter u zwie-rz¹t pozostaje wci¹¿ bez odpowiedzi.
Wyniki badañ w³asnych wykaza³y, ¿e w grupie bada-nej 102 psów zaka¿enie Helicobacter species na podsta-wie preparatu bezporedniego oraz testu ureazowego wykazano u 89,2%, natomiast w grupie kontrolnej 30 psów, bez ¿adnych dolegliwoci ze strony przewodu pokarmowego oraz bez ¿adnych zmian zapalnych w ob-rêbie b³ony luzowej ¿o³¹dka, wyniki testów ureazowych oraz preparat bezporedni by³y dodatnie u 96,7% zwie-rz¹t (tab. 1). Wyniki te s¹ zbie¿ne z danymi z pimien-nictwa. Sapierzyñski i wsp. (14) otrzymali nieco ni¿szy wynik testu ureazowego, który by³ dodatni u 85,1% ba-danych psów. Natomiast Jalava i wsp. (9) u 95 psów, gdzie 54 by³y to psy zdrowe, 23 z objawami kliniczny-mi, a 18 zosta³o poddanych eutanazji z ró¿nych przy-czyn, otrzymali pozytywny wynik testu ureazowego u 100% zwierz¹t. Dane te wskazuj¹, ¿e w bioptatach po-branych z ¿o³¹dka drobnoustroje wytwarzaj¹ce ureazê, do których nale¿y wiêkszoæ gatunków z rodzaju Heli-cobacter, wystêpuj¹ powszechnie tak u zwierz¹t zdro-wych, jak i chorych (2).
Czêstoæ wystêpowania ró¿nych gatunków z rodzaju Helicobacter zosta³a okrelona przy u¿yciu metod ho-dowlanych. Sporód 25 dodatnich hodowli najczêciej stwierdzano wzrost H. felis (tab. 2). O trudnociach w zastosowaniu mikrobiologicznych metod hodowlanych donosi³o wielu autorów. Happonen i wsp. (6) pozytyw-ne wyniki hodowli otrzymali u 3 sporód 8 przebada-nych psów i u 1 sporód 6 przebadaprzebada-nych kotów, przy czym najczêciej izolowanymi gatunkami by³y: Helico-bacter heilmannii like organisms oraz HelicoHelico-bacter felis. Z przeprowadzonej analizy uzyskanych wyników oraz na podstawie danych z pimiennictwa mo¿na wnios-kowaæ, i¿ metody hodowlane s¹ trudne, czasoch³onne, wy-magaj¹ specjalnych pod³o¿y hodowlanych, warunków tem-peraturowych i atmosferycz-nych i pomimo spe³nienia tych wymogów bardzo czêsto koñ-cz¹ siê niepowodzeniem.
W celu okrelenia charak-teru odpowiedzi immunolo-gicznej u badanych zwierz¹t wykorzystano test immunoen-zymatyczny ELISA. Opieraj¹c siê na badaniach prowadzo-nych u ludzi z zaka¿eniem H. pylori, dotycz¹cych obec-noci przeciwcia³ anty-H. py-lori w surowicy zaka¿onych
e i n a n z o p z o R e n z c i n il k a n a d a b a p u r G Grupakonrtolna a b z c i L t ¹ z r e i w z p p s r e t c a b o c il e H . e i c a r a p e r p w m i n d e r o p z e b t s e t i n t a d o D y w o z a e r u zLwiicezrbza¹t p p s r e t c a b o c il e H . e i c a r a p e r p w m i n d e r o p z e b t s e t i n t a d o D y w o z a e r u y n o ³ b e i n e l a p a Z a k d ¹ ³ o ¿ j e w o z u l 73 (906,46%) (906,64%) 0 0 0 a k d ¹ ³ o ¿ d ó z r W 4 (753,0%) (1040%) 0 0 0 a k d ¹ ³ o ¿ k a R 4 (1040%) (1040%) 0 0 0 a w o z u l a n o ³ B a w o ³ d i w a r p 21 (851,87%) (811,07%) 30 (962,79%) (962,97%) a m u S 102 (899,12%) (899,21%) 30 (962,79%) (962,97%) Tab. 1. Czêstoæ wystêpowania drobnoustrojów z rodzaju Helicobacter w b³onie luzowej ¿o³¹dka psów z ró¿nym rozpoznaniem klinicznym
Medycyna Wet. 2008, 64 (7) 905
chorych, przyjêto za³o¿enie, ¿e w surowicy zwierz¹t rów-nie¿ wystêpuj¹ przeciwcia³a anty-Helicobacter. W ni-niejszych badaniach wykryto przeciwcia³a klasy IgG przeciw antygenom H. pylori u 25 (24,5%) chorych psów. Dodatni¹ reakcjê z antygenami H. felis stwierdzono u 31 (30,4%) zwierz¹t z grupy badanej i u 6 (20%) z grupy kontrolnej. W grupie zdrowych psów nie wykryto prze-ciwcia³ skierowanych przeciw antygenom H. pylori (tab. 2).
W grupie psów z objawami dyspeptycznymi i zmia-nami w obrêbie b³ony luzowej ¿o³¹dka obecnoæ prze-ciwcia³ skierowanych przeciwko antygenowi H. pylori wykryto u 28,4% psów, a przeciw antygenom H. felis u 29,63%. U zwierz¹t z dolegliwociami ze strony prze-wodu pokarmowego, ale z prawid³ow¹ b³on¹ luzow¹ przeciwcia³a dla H. pylori stwierdzono w 3,92%, a dla H. felis w 17,65% badanych surowic (tab. 3). W dostêp-nym pimiennictwie niewiele jest publikacji dotycz¹cych tego zagadnienia u zwierz¹t. Strauss-Ayali i wsp. (15) badali czêstoæ wystêpowania przeciwcia³ IgG przeciw antygenom H. pylori i H. felis u psów z objawami gas-trycznymi i u psów zdrowych. Wykazali wy¿sz¹ czêstoæ wystêpowania przeciwcia³ w grupie chorych zwierz¹t ni¿ w grupie kontrolnej. Natomiast Wiinberg i wsp. (19) nie stwierdzili korelacji pomiêdzy infekcj¹ Helicobacter spp. a ekspresj¹ cytokin prozapalnych, stopniem nasilenia zmian zapalnych w ¿o³¹dku i poziomem przeciwcia³ obecnych w surowicy badanych psów.
Bior¹c pod uwagê podzia³ badanych psów na grupy wiekowe, stwierdzono, i¿ czêstoæ wystêpowania
prze-ciwcia³ skierowanych przeciw antygenom H. felis by³a najwy¿sza u psów poni¿ej pierwszego roku ¿ycia oraz powy¿ej 5 lat (tab. 4). Wyniki te stano-wi¹ w pewnym stopniu potwierdzenie obserwacji poczynionych przez Sapierzyñskiego i wsp. (14), którzy izolowali drobnoustroje z rodzaju Helicobac-ter najczêciej od zwierz¹t do 6 miesi¹ca ¿ycia i po-wy¿ej 5 lat.
Wyniki badañ w³asnych wskazuj¹ na wystêpowa-nie znaczwystêpowa-nie czêciej podwy¿szonego poziomu prze-ciwcia³ skierowanych przeciw antygenom Helico-bacter felis u psów z zaka¿eniem tym drobnoustro-jem i z objawami dyspeptycznymi ni¿ u zwierz¹t zdro-wych.
Pimiennictwo
1.Andersen L. P.: New Helicobacter species in humans. Dig. Dis. 2001, 19, 112--115.
2.Beale M., Van den Bulck K., Decostere A., Vandamme P., Hanninen M. L., Ducatelle R., Haesebrouck F.: Multiplex PCR assay for differentiation of Helicobacter felis, H. bizzozeronii, and H. salomonis. J. Clin. Microbiol. 2004, 42, 1115-1122.
3.De Bock M., Van den Bulck K., Hellemans A., Daminet S., Coche J. C., Debong-nie J. C., Decostere A., Haesebrouck F., Ducatelle R.: Peptic ulcer disease asso-ciated with Helicobacter felis in a dog owner. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 2007, 19, 79-82.
4.Fox J. G.: The non-H. pylori helicobacters: their expanding role in gastrointesti-nal and systemic diseases. Gut 2002, 50, 273-293.
5.Gociniak G.: IgG and IgA antibodies in Helicobacter pylori infections. Zntb. Bacteriol. 1992, 286, 494-502.
6.Happonen I., Linden J., Saari S., Karjalainen M., Hanninen M. L., Jalava K., Westermarck E.: Detection and effects of Helicobacters in healthy dogs and dogs with signs of gastritis. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1998, 213, 1767-1774. 7.Hwang C. Y., Han H. R., Youn H. Y.: Prevalence and clinical characterization of
gastric Helicobacter species infection of dogs and cats in Korea. J. Vet. Sci. 2002, 3, 123-133.
8.Jalava K., Kaartinen M., Utriainen M., Happonen I., Hänninen M. L.: Helico-bacter salomonis sp. Nov., a canine gastric HelicoHelico-bacter sp. related to Helicobac-ter felis and HelicobacHelicobac-ter bizzozeronii. Int. J. Syst. BacHelicobac-teriol. 1997, 47, 975-982. 9.Jalava K., On S. L., Vandamme P. A., Happonen I., Sukura A., Hänninen M. L.: Isolation and identification of Helicobacter spp. from canine and feline gastric mucosa. Appl. Environ. Microbiol. 1998, 64, 3998-4006.
10.Kobayashi M., Lee H., Schaffer L., Gilmartin T. J., Head S. R., Takaishi S., Wang T. C., Nakayama J., Fukuda M.: A distinctive set of genus is upregulated during the inflammation- carcinoma sequence in mouse stomach infected by Helicobacter felis. J. Histochem. Cytochem. 2007, 55, 263-274.
11.Prachasilpchai W., Nuanualsuwan S., Chatsuwan T., Techanbamsuwan S., Wangnaitham S., Sailasuta A.: Diagnosis of Helicobacter spp. infection in canine stomach. J. Vet. Sci. 2007, 8, 139-145.
12.Recordati C., Gualdi V., Tosi S., Facchini R. V., Pengo G., Luini M., Simpson K. W., Scanziani E.: Detection of Helicobacter spp. DNA in the oral cavity of dogs. Vet. Microbiol. 2007, 119, 346-351.
13.Sapierzyñski R., Malicka E.: Effect of gastric Helicobacter-like organisms on gastric epithelial cell proliferation rate in dogs. Pol. J. Vet. Sci. 2004, 7, 275-281. 14.Sapierzyñski R., Malicka E., Bielecki W., Sendecka H.: The presence of
Helico-bacter-like microorganisms in the gastric mucosa in dogs. Pol. J. Vet. Sci. 2003, 6, 247-252.
15.Strauss-Ayali D. S., Simpson K. W., Schen A. H., McDonought P. L., Jacob-son R. H., Valentine B. A., Peacock J.: Serological discrimination of dogs infected with gastric Helicobacter sp. and infected dogs. J. Clin. Microbiol. 1999, 37, 1280-1287.
16.Van den Bulck K., Decostere A., Baele M., Driesse A., Debongnie J. C., Burette A., Stolte M., Ducatelle R., Haesebrouck F.: Identification of non-Helico-bacter pylori spiral organisms in gastric samples from humans, dogs and cats. J. Clin. Microbiol. 2005, 43, 2256-2260.
17.Van den Bulck K., Decostere A., Baele M., Vandamme P., Mast J., Ducatelle R., Haesebrouck F.: Helicobacter cynogastricus sp nov., isolated from the canine gastric mucosa. J. Sys. Evl. Microbiol. 2006, 56, 1559-1564.
18.Weber A. F., Hasa O. H., Sauter J. H.: Some observations concerning the presen-ce of spirilla in the funding glands of dogs and cats stomach. Am. J. Vet. Res. 1958, 19, 677-680.
19.Wiinberg B., Spohr A., Dietz H. H., Egelund T., Greiter-Wilke A., McDonough S., Olsen J., Priestnall S., Chang Y. F., Simpson K. W.: Quantitative analysis of inflammatory and immune responses in dogs with gastritis and their relationship to Helicobacter spp. infection. J. Vet. Intern. Med. 2005, 19, 4-14.
Adres autora: dr hab. Gra¿yna Gociniak, ul. Cha³ubiñskiego 4, 50-368 Wroc³aw; e-mail: gosgra@mbio.am.wroc.pl
a p u r G t ¹ z r e i w z e n z c i g o l o ir e t k a b e i n a d a B Przeciwcia³aIgG -y t n a Heilcobacter r e t c a b o c il e H ir o l y p helimannii feils spp* pyloir feils a n a d a B 2 0 1 0 0 (161,77%) (22%) (242,55%) (303,41%) a n l o rt n o K 0 3 0 0 (20,60%) 0 0 (206%) a m u S 2 3 1 0 0 (172,34%) (1,25%) (182,59%) (2387%) Tab. 2. Czêstoæ wystêpowania ró¿nych gatunków Helicobacter u psów
Tab. 3. Wystêpowanie przeciwcia³ skierowanych przeciw an-tygenom Helicobacter spp. u psów e n z c i n il k e i n a n z o p z o R Przeciwcia³aIgG -y t n a H.pyloir anty-H.feils a k d ¹ ³ o ¿ j e w o z u l y n o ³ b e i n e l a p a Z 28,4% 29,63% a w o ³ d i w a r p a w o z u l a n o ³ B 3,92% 17,65%
Tab. 4. Wystêpowanie przeciwcia³ anty-Helicobacter spp. w zale¿noci od wieku psów k e i W Obecnoæprzeciwcia³skierowanychprzeciw ir o l y p . H H.feils 1 < 16,7% 33,3% 5 -1 24,4% 26,8% 5 > 18,2% 36,4%
