Artykuł przeglądowy Review
Anisakis simplex zwany też robakiem śledziowym jest pasożytniczym nicieniem, należącym do rzędu Ascaridida i rodziny Anisakidae. Jego żywicielem ostatecznym są liczne gatunki ssaków morskich, ży-wicielem pośrednim skorupiaki, a głowonogi i ryby morskie żywicielem pośrednim lub paratenicznym (5, 12). W wyniku zjedzenia z żywnością żywych larw trze-ciego stadium (L3) A. simplex u człowieka może dojść do rozwoju choroby zwanej anisakiozą. W przebiegu anisakiozy larwy L3 powodują uszkodzenie narządu, w którym się lokalizują, najczęściej dotyczy to żołądka lub jelit (6, 22). Ponadto białka larw L3 Anisakis mogą powodować także reakcje alergiczne, a nawet wstrząs anafilaktyczny. Należy podkreślić, że reakcje alergiczne mogą wystąpić również w przypadku spożycia prze-tworzonych produktów rybnych, w których stwierdza się obecność alergenów Anisakis (2, 9). Do 2010 r. na świecie zarejestrowano ponad 20 000 przypadków ani-sakiozy u ludzi (18). Rocznie notuje się około 2000 no-wych przypadków (33). W Polsce opisano jedynie kilka przypadków reakcji alergicznych na alergeny A. simplex (36), jednakże diagnostyka w kierunku anisakiozy oraz alergii na alergeny A. simplex u ludzi w Polsce jest rzadko przeprowadzana, brak jest też dostępnych
wy-ników badań dotyczących sytuacji epidemiologicznej anisakiozy w kraju.
Na podstawie wyników badań ryb i produktów rybnych w Polsce dotyczących występowania larw L3 A. simplex można przypuszczać, że ryzyko narażenia człowieka na larwy i alergeny A. simplex jest znaczne. W przeprowadzonych badaniach stwierdzono występo-wanie larw L3 A. simplex w 83,3% wędzonych śledzi pochodzących z lubelskich hipermarketów (23). W in-nych badaniach wykryto żywe larwy L3 A. simplex, w marynowanych i wędzonych śledziach przeznaczo-nych do spożycia i dopuszczoprzeznaczo-nych do obrotu w Polsce (43). Pasożyty te stwierdzono również w 72,5% bada-nych filetów gorbuszy (Oncorhynchus gorbuscha) (4). Badania przeprowadzone w Zakładzie Parazytologii i Chorób Inwazyjnych PIWet-PIB w 2015 r. (dane niepublikowane) wskazują na występowanie larw pa-sożytów z rodziny Anisakidae u 68% śledzi bałtyckich (Clupea harengus membras) i 28% dorszy bałtyckich (Gadus morhua callarias). Dane te wskazują na ist-nienie realnego ryzyka wystąpienia anisakiozy u ludzi również w Polsce. Co więcej, ryzyko to potęgowane jest w ostatnim czasie rosnącą popularnością potraw zawierających surowe mięso ryb, jak: sushi, sashimi
Metody wykrywania Anisakis simplex w rybach
i produktach rybnych
MACIEJ KOCHANOWSKI, MIROSŁAW RÓŻYCKI, JOANNA DĄBROWSKA, EWA BILSKA-ZAJĄC, JACEK KARAMON, EWELINA ANTOLAK,
KATARZYNA GRĄDZIEL-KRUKOWSKA, TOMASZ CENCEK
Zakład Parazytologii i Chorób Inwazyjnych, Państwowy Instytut Weterynaryjny – Państwowy Instytut Badawczy, Al. Partyzantów 57, 24-100 Puławy
Otrzymano 03.04.2017 Zaakceptowano 05.06.2017
Kochanowski M., Różycki M., Dąbrowska J., Bilska-Zając E., Karamon J., Antolak E., Grądziel-Krukowska K., Cencek T.
Methods for Anisakis simplex detection in fish and fishery products
Summary
Anisakis simplex is a zoonotic nematode which can cause human anisakiasis. Furthermore, A. simplex allergens, even of dead larvae, can cause allergic reactions, including anaphylaxis. Due to the frequent occurrence in fish muscles and pathogenicity, A. simplex is a serious danger for consumers of fish products. Therefore, it is necessary to examine fish and fish products for the presence of these parasites before placing them on the market. The purpose of this paper is the review of the methods for A. simplex detection in fish and fishery products. These methods differ according to their effectiveness and type of the target analyte. They also have different suitability for examination of matrices with different properties. Moreover, this paper presents legislation associated with A. simplex detection.
czy ceviche. Prognozowany jest także dalszy wzrost spożycia tych dań w Polsce (42).
Ze względu na zagrożenia związane z A. simplex stosowane są różne metody wykrywania tych paso-żytów w rybach i produktach rybnych. Są to metody polegające na wykrywaniu całych larw A. simplex, jak metoda badania makroskopowego, kompresorowa, wytrawiania oraz elucji. Wykorzystywane są również metody umożlwiające wykrycie DNA Anisakis za pomo-cą technik biologii molekularnej np. reakcji łańcucho-wej polimerazy (PCR) lub białek pasożyta za pomocą testów immunoenzymatycznych. Metody te różnią się czułością, dokładnością, specyficznością oraz rodzajem wykrywanego analitu. Mają one także różną przydatność do badania matryc o różnych właściwościach, zwłaszcza w przypadku produktów poddanych licznym procesom technologicznym.
Regulacje prawne związane z badaniem ryb i produktów rybnych w kierunku występowania
pasożytów
Mimo dość częstego występowania pasożytów w ry-bach i produktach rybnych regulacje prawne w tym zakresie niecałkowicie chronią konsumenta przed ewentualnym zagrożeniem, zwłaszcza przed obecnością alergenów Anisakis. Rozporządzenie (WE) nr 853/2004 wskazuje, że przedsiębiorca jest zobowiązany do ba-dania wizualnego produktów rybnych przed ich wpro-wadzeniem do obrotu w celu wykrycia „widocznych” pasożytów (34). Przedsiębiorca nie może wprowadzać do obrotu przeznaczonych do konsumpcji dla ludzi produktów „jednoznacznie” zanieczyszczonych paso-żytami. W rozporządzeniu tym nie uwzględniono ko-nieczności poszukiwania „niewidocznych” pasożytów oraz ich alergenów występujących we wnętrzu tkanek ryb, przeznaczonych do spożycia przez ludzi. Istotne jest, że rozporządzenie to mówi również o koniecz-ności przeprowadzenia mrożenia produktów rybnych (w temperaturze nie wyższej niż –20°C we wszystkich punktach produktu, przez co najmniej 24 godziny): prze-znaczonych do spożycia w stanie surowym lub prawie surowym; solonych i/lub marynowanych (jeżeli procesy te nie pozwalają na zabicie larw nicieni); produktów ze śledzi, makreli, szprota, dzikiego łososia atlantyckiego i pacyficznego – poddane wędzeniu zimnemu, które nie powoduje wzrostu temperatury we wnętrzu pro-duktu powyżej 60°C. W przypadku produktów rybnych wprowadzonych do obrotu wymagana jest informacja producenta dotycząca rodzaju obróbki, jakiemu poddane zostały produkty, z wyjątkiem produktów dostarczonych konsumentowi ostatecznemu. Należy jednak podkreślić, że zgodnie z dostępnymi wynikami badań, pojedyncze larwy A. simplex mogą przeżywać w temperaturze –20°C nawet do 60 godzin (1). Jest to czas znacznie dłuższy niż wymagany przepisami okres mrożenia w temperaturze –20°C. Rozporządzenie nr 853/2004 dopuszcza także możliwość odstąpienia od mrożenia produktów rybnych pochodzących z ryb z obszarów połowowych, które
wg dostępnych danych epidemiologicznych nie stano-wią zagrożenia, wynikającego z obecności pasożytów oraz jeśli zezwolą na to właściwe władze. Przykładem tego jest region Apulia we Włoszech, który za zgodą władz odstąpił od obowiązkowego mrożenia ryb (17). Z drugiej strony, wg opinii Europejskiej Agencji ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA) z 2010 r., żaden obszar połowowy nie może być uznany za wolny od występowania A. simplex (18). Z kolei w rozporządzeniu (WE) nr 2074/2005 zdefiniowano termin „widocznego pasożyta” jako pasożyta lub grupę pasożytów o wymia-rach, kolorze oraz teksturze pozwalających na wyraźne ich odróżnienie od tkanek ryb (14). Rozporządzenie to nakłada obowiązek przeprowadzenia jedynie badania wizualnego ryb i produktów rybnych przed ich wpro-wadzeniem do obrotu. Badanie wizualne jest określone jako niedestrukcyjne badanie ryb z wykorzystaniem, jeśli jest to konieczne, prześwietlania. Rozporządzeniu nr 2074/2005 nie wskazuje innej metody badania pro-duktów, wobec których stosowanie wizualnej inspekcji w celu poszukiwania pasożytów jest niemożliwe, np. w przypadku produktów poddanych homogenizacji. W przepisach dotyczących obowiązkowego badania ryb i produktów rybnych nie uwzględniono również metod badawczych o wyższej czułości i dokładności niż me-toda makroskopowej obserwacji. Rozporządzenie (WE) nr 1020/2008 mówi o konieczności przeprowadzania kontroli wzrokowej także produktów sprzedawanych w ramach handlu detalicznego (15). Rozporządzenie (WE) nr 1276/2011 z kolei zezwala na odstąpienie od mrożenia produktów rybnych otrzymanych z ryb hodo-wanych w warunkach akwakultury pod warunkiem, że ryby wyhodowane zostały z zarodków, a ich pożywienie nie zawiera żywych pasożytów oraz spełniają jeden z wymogów: były hodowane wyłącznie w środowisku pozbawionym żywych pasożytów; przedsiębiorstwo za pomocą procedur zatwierdzonych przez właściwy organ weryfikuje brak zagrożenia konsumenta produk-tów rybnych ze względu obecność żywych pasożyproduk-tów (16). Zgodnie z rozporządzeniem, przedsiębiorca jest zwolniony z obowiązku mrożenia produktów, które były przechowywane w zamrożeniu wystarczająco długo, aby możliwe było zabicie żywych pasożytów. Również z tego obowiązku zwolnione są produkty, które zostały lub przed konsumpcją będą poddane obróbce cieplnej za pomocą temperatury umożliwiającej zabicie żywych pasożytów. W przypadku pasożytów innych niż przywry produkt powinien być poddany działaniu temperaturze minimum 60°C przez co najmniej 1 minutę (po jej osiągnięciu w centralnym punkcie produktu). Ponadto w rozporządzeniu nr 1276/2011 rozszerzono zagrożenie związane z występowaniem Anisakis także na głowono-gi. W rozporządzeniu tym dopuszczono również prze-prowadzenie mrożenia ryb i produktów rybnych w tem-peraturze co najmniej –35°C przez okres minimum 15 godzin. Zgodnie z rozporządzeniem, przedsiębiorca przed wprowadzeniem do obrotu produktu, który nie był objęty mrożeniem lub który nie jest przeznaczony
przed konsumpcją do obróbki zabijającej żywe pasożyty, stanowiące zagrożenie dla zdrowia, musi mieć pewność, że produkty rybne pochodzą z obszarów połowowych lub z akwakultury wolnych od pasożytów. Przepis ten może być spełniony przez dokumentację handlową lub inną informację dołączoną do produktów rybnych.
Badanie makroskopowe (wizualne)
Jak już wspomniano, zgodnie z rozporządzeniem nr 2074/2005 ryby i produkty rybne przed ich wprowa-dzeniem do obrotu podlegają kontroli wzrokowej (14). Kontroli wzrokowej podlegają wypatroszone ryby – ściany jamy brzusznej oraz wątroba i ikra przeznaczone do spożycia przez człowieka oraz filety i płaty rybne. Kontrola wzrokowa odbywa się za pomocą optycznych przyrządów powiększających lub bez nich. Badanie przeprowadza się w dobrych warunkach oświetlenio-wych. W razie potrzeby stosowane jest również prze-świetlanie, zwłaszcza w przypadku ryb flądrokształtnych lub filetów rybnych, które podczas obserwacji mogą być prześwietlane w zaciemnionym pomieszczeniu, w celu wykrycia pasożytów. Właściwy personel przed-siębiorstw lub statków przetwórni określa skalę oraz częstotliwość badania makroskopowego w zależności od rodzaju produktu, jego pochodzenia geograficznego i przeznaczenia. Badanie przeprowadza się na repre-zentatywnej liczbie próbek. W przypadku patroszenia ręcznego należy przeprowadzić kontrolę wzrokową w sposób ciągły, przez osobę patroszącą w czasie pa-troszenia i mycia. W przypadku papa-troszenia mechanicz-nego, badana jest reprezentatywna liczba próbek, lecz nie mniejsza niż 10 ryb na partię. Kontrola wzrokowa filetów rybnych lub płatów rybnych powinna być prze-prowadzona podczas wykrawania i po filetowaniu lub cięciu na płaty, przez wykwalifikowany personel. Jeżeli badanie indywidualne nie jest możliwe z powodu wiel-kości filetów lub czynności związanych z filetowaniem, należy sporządzić plan pobierania próbek, który będzie dostępny dla właściwego urzędu kontrolującego. Jeżeli prześwietlanie filetów jest konieczne, należy je uwzględ-nić w planie pobierania próbek. Na podstawie badań określono, że wizualna inspekcja jest mało skuteczna do oceny występowania A. simplex w tkance mięśniowej ryb (28). Nie stwierdzono wyraźnego związku między liczbą larw Anisakis wykrytych w jamie ciała a liczbą larw w tkance mięśniowej. Z powodu tych ograniczeń stosowanie badania makroskopowego jako podstawowej metody wykrywania larw A. simplex wiąże się z dużą niepewnością uzyskiwanych wyników.
Metoda kompresorowa
Do badania występowania larw A. simplex w rybach i produktach rybnych stosowane są przeważnie metody o lepszej czułości i dokładności niż badanie makro-skopowe, np. metoda kompresorowa z zastosowaniem podświetlenia (światło białe lub UV). W przypadku metody kompresorowej ryby najpierw poddaje się fi-letowaniu. Filety ze skórą odskórza się, a w przypadku
ryb z ciemną otrzewną usuwa się błonę otrzewną. Próbki umieszcza się w kompresorze, a następnie dociska tak, aby odległość pomiędzy dwoma płytami kompresora wynosiła nie więcej niż 5 mm. Źródło światła białego umieszczone pod kompresorem powinno zapewnić na-tężenie oświetlenia w granicach 50 luksów. Przeglądając preparat, poszukuje się pasożytów w próbce. Warto zaznaczyć, że większość larw A. simplex znajdują-cych się w mięśniach ryb stwierdza się w mięśniach w pobliżu jamy ciała, jednakże w przypadku braku szybkiego wytrzewienia i mrożenia ryb po złowieniu larwy Anisakis wędrują w głąb tkanki mięśniowej (40). Przeprowadzone badania wskazują, że metoda kompre-sorowa z podświetleniem światłem białym nie zapewnia wysokiej czułości, zwłaszcza w przypadku badania ryb o ciemnej tkance mięśniowej oraz zbyt grubych filetów (29). Znaczna część larw A. simplex w badanej próbce pozostaje nie wykryta. Metoda kompresorowa lepiej sprawdza się w wykrywaniu larw L3 Phocanema deci -piens (długość ok. 45 mm), które są większe niż A. sim-plex (długość ok. 30 mm) i mają wyraźniejszy kolor (P. decipiens – żółty, czerwony lub brązowy, A. simplex – jasny kremowy) (7). W przypadku ryb poddanych mrożeniu lub produktów rybnych poddanych obróbce termicznej (mrożenie lub wysoka temperatura) możliwe jest zastosowanie podświetlenia preparatu światłem UV (366 nm). Uszkodzone w wyniku obróbki termicznej larwy A. simplex wykazują niebieską fluorescencję w świetle UV. W przypadku zastosowania światła UV niektórzy autorzy wskazują na wysoką skuteczność tej metody, nawet wyższą niż metody wytrawiania (10, 21), jednakże zastosowanie tej metody wymaga szczególnej ostrożności i użycia właściwych środków ochrony osób wykonujących badanie w związku ze szkodliwym dzia-łaniem promieni UV.
Metoda wytrawiania
Często stosowaną w laboratoriach służb weteryna-ryjnych metodą wykrywania larw A. simplex w rybach i produktach rybnych jest metoda wytrawiania tkanki mięśniowej ryb w sztucznym kwasie żołądkowym. Została ona opracowana na podstawie powszechnie stosowanej metody badania mięsa w kierunku włośni (Rozporządzenie WE 2075/2005) (15). Zgodnie z meto-dyką Laboratorium Referencyjnego UE ds. Pasożytów, próbkę tkanki mięśniowej ryby o masie 100 g poddaje się rozdrobnieniu w blenderze przez 1-2 sekundy. Rozdrobnioną próbkę umieszcza w zlewce z płynem trawiącym. W skład płynu trawiącego wchodzą: woda – 2 l, kwas solny 25% – 16 ml, pepsyna o mocy 2000 FIP – 10 g. Zlewka z płynem i próbką jest umieszczana na mieszadle magnetycznym i mieszana, a temperatura płynu trawiącego utrzymywana jest w zakresie 40-42°C. Proces wytrawiania trwa około 15-20 minut, aż do roz-puszczenia tkanki mięśniowej. Po rozpuszczeniu tkanki mięśniowej płyn przelewa się przez sito o średnicy oczek 180-1000 µm. Jeżeli w badanej próbce znajdowały się larwy, pozostają one na sitku. W Zakładzie Parazytologii
PIWet-PIB stosowana jest modyfikacja tej metody, któ-rej istotnym etapem jest rozdrobnienie tkanki mięśnio-wej ryb za pomocą rąk, bez użycia ostrych przedmiotów, ze względu na ryzyko fragmentacji larw pasożytów. Ponadto istotne jest, aby podczas wytrawiania nie prze-kraczać temperatury 50°C, gdyż do maksymalnie takiej temperatury larwy A. simplex są odporne na wytrawianie (41). Większość badań wskazuje na wysoką skuteczność metody wytrawiania do wykrywania Anisakis w rybach. Na przykład w przeprowadzonej walidacji metody osiągnięto odzysk 86,6% larw L3 Anisakis sztucznie dodanych do próbek tkanki mięśniowej łososia hodow-lanego (26). Odzysk larw Anisakis nie jest całkowity. Część z larw ulega fragmentacji. Prawdopodobnie długie przechowywanie w warunkach mrożenia ryb, w których występują larwy A. simplex, powoduje wzrost odsetka larw ulegających fragmentacji podczas wytrawiania. Rozwiązaniem tego problemu może być zastosowanie płynnej pepsyny (o mocy 660 U Ph Eur/ ml), która poprawia efektywność trawienia tkanki mięśniowej ryby oraz nie powoduje uszkodzenia larw (29). Ponadto zastosowanie pepsyny w płynie zmniejsza ryzyko występowania alergii u osób wrażliwych na ten odczynnik. Kolejną modyfikacją klasycznej metody wytrawiania jest zastosowanie urządzenia Trichineasy (CTSV), zautomatyzowanego i szczelnie zamkniętego podczas procesu wytrawiania. Główną zaletą urządzenia jest ograniczenie kontaktu osób wykonujących badanie z drażniącymi odczynnikami (8).
Metoda elucji (metoda larwoskopowa)
Do wykrywania żywych larw A. simplex stosowana jest również metoda elucji (25). W metodzie tej 200 g tkanki mięśniowej ryby umieszczane jest na sicie w lej-ku. Do szyjki lejka umocowany jest przewód gumowy, mający zaciśnięte zakończenie. Lejek należy wypełnić płynem fizjologicznym, przykryć folią aluminiową i po-zostawić na noc w temperaturze pokojowej. Żywe larwy będą migrowały przez tkankę, sito w dół przewodu. Po 16-18 godzinach należy spuścić 100 ml płynu do zlewki. W płynie należy poszukiwać larw A. simplex. Metoda ta bywa także używana do poszukiwania różnych innych pasożytów bytujących w tkankach ryb. Pasożyty te często są mniej odporne na działanie płynu trawiące-go i w metodzie wytrawiania ulegają rozpuszczeniu. Należy zaznaczyć, że metoda elucji jest mniej czuła w wykrywaniu larw Anisakis niż metoda wytrawiania, która umożliwia wykrywanie również martwych larw. Ponadto elucja nie zawsze skutecznie umożliwia izolację larw A. simplex umieszczonych głęboko w tkance.
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)
W laboratoriach badawczych do wykrywania obec-ności larw A. simplex w rybach i produktach rybnych stosowane są również metody biologii molekularnej, a przede wszystkim techniki PCR. Reakcja PCR umoż-liwia amplifikację DNA A. simplex obecnego w próbce. Przed przystąpieniem do właściwego badania testem
PCR bardzo ważne jest odpowiednie przygotowanie próbki. Warto podkreślić, że żywność jest matrycą bardzo skomplikowaną, zawierającą liczne inhibitory reakcji PCR, jak: tłuszcze, polisacharydy, jony metali czy enzymy (37). Ponadto, procesy technologiczne, jakim poddawane są produkty (m.in. działanie wyso-kiej temperatury, ciśnienia, enzymów, zmiany pH), powodują degradację DNA patogenu, co zmniejsza efektywność testu PCR (11), dlatego też istotna jest efektywna izolacja DNA Anisakis, pozwalająca na uwolnienie DNA z fragmentów tkanek larw nicieni wy-stępujących w matrycy oraz oczyszczenie izolowanego DNA. Należy zaznaczyć, że bezpośrednio w reakcji PCR badana jest bardzo niewielka objętość próbki (ok. 1-5 µl), dlatego niezwykle ważna jest koncentracja DNA. W celu izolacji, oczyszczenia i koncentracji DNA stosowane są najczęściej komercyjne zestawy do izolacji przeznaczone do żywności czy tkanek. Do izolacji DNA Anisakis powszechnie stosowana jest też mieszanina fenol-chloroform-alkohol izoamylowy, jednak niektóre badania wskazują, że mieszanina ta nie usuwa skutecznie inhibitorów reakcji PCR (32, 37). Ponadto, ze względu na kutikulę odporną na różne czyn-niki chemiczne oraz fizyczne wskazana jest dokładna i silna mechaniczna dezintegracja larw Anisakis, np. za pomocą homogenizatora typu „bead beater” (38). W celu amplifikacji wyizolowanego materiału genetycznego A. simplex stosowane są przede wszystkim startery amplifikujące wewnętrzne sekwencje transkrybowane (ITS) oraz sekwencje podjednostek oksydazy cytochro-mowej (COX) (19, 24, 30, 31). Do badania żywności w kierunku występowania DNA A. simplex szczególną przydatność, ze względu na wyższą czułość niż kla-syczny PCR oraz brak konieczności przeprowadzania rozdziału elektroforetycznego produktu PCR, wykazuje ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (real time PCR). Istotną zaletą metody real time PCR jest także możliwość obserwowania przyrostu produktu reakcji w czasie jej trwania. Na rynku dostępny jest komercyjny test real time PCR umożliwiający wykrywanie DNA pasożytów z rodzaju Anisakis oraz Pseudoterranova w żywności – Anisakids-PCR Real Time kit (4LAB Diagnostics). Według producenta tego testu, granica wykrywalności metody wynosi 0,001% DNA Anisakis spp. I Pseudoterranova spp. w DNA ryby. Głównym atutem metod PCR jest możliwość ich stosowania do badania produktów przetworzonych, w których larwy A. simplex uległy uszkodzeniu i niemożliwe jest ich zidentyfikowanie na podstawie budowy morfologicznej.
Metody immunoenzymatyczne
Testy immunoenzymatyczne stosowane są do wykry-wania białek A. simplex. Podobnie jak w przypadku wie-lu innych alergenów występujących w żywności, metodą najczęściej stosowaną do wykrywania białek A. simplex jest ELISA. ELISA jest testem prostym w wykonaniu i stosunkowo szybkim. Przed przeprowadzeniem testu ELISA konieczna jest izolacja białek A. simplex z
pro-duktu. Proces ten rozpoczyna się od dokładnej homo-genizacji produktu, np. za pomocą wysokoobrotowego homogenizatora laboratoryjnego. Ze względu na wspo-mnianą oporność kutikuli Anisakis na dezintegrację, efektywność homogenizacji wzmacnia użycie sonikacji. Po homogenizacji próbki odbywa się ekstrakcja alerge-nów A. simplex, która jest przeprowadzana w buforach, głównie fosforanowym (PBS) lub Tris-HCL (TBS), o pH około 7 (35, 44-46). Po procesie ekstrakcji próbka badana jest testem ELISA. Skuteczność testu ELISA zależy przede wszystkim od jakości stosowanych prze-ciwciał anty-Anisakis. W testach ELISA do wykrywania alergenów Anisakis w żywności stosowane są przede wszystkim przeciwciała klasy IgG. Stosowanie przeciw-ciał przeciwko antygenowi pełnemu Anisakis zapewnia wyższą czułość testów niż w przypadku używania prze-ciwciał przeciwko konkretnym alergenom A. simplex, jednakże w przypadku przeciwciał przeciwko antyge-nowi pełnemu istnieje ryzyko reakcji niespecyficznych np. z białkami innych nicieni. Natomiast stosowanie przeciwciał przeciwko konkretnym alergenom Anisakis, zwłaszcza wydzielniczo-wydalniczym, może zwiększać specyficzność badania. W testach stosowane mogą być zarówno przeciwciała poliklonalne przeciwko antyge-nowi pełnemu, jak i poszczególnym alergenom oraz przeciwciała monoklonalne. Użycie przeciwciał poliklo-nalnych wiąże się na ogół z wyższą czułością i mniejszą specyficznością reakcji niż w przypadku stosowania przeciwciał monoklonalnych. Granica wykrywalności istniejących testów mieści się w zakresie od kilku do kilkudziesięciu larw Anisakis w 100 g tkanki rybnej. Podobnie jak w przypadku testów PCR, zaletą metod immunoenzymatycznych jest możliwość wykrywania obecności Anisakis w produktach silnie przetworzonych, w których larwy uległy uszkodzeniu. Należy zauwa-żyć, że metody immunoenzymatyczne są szczególnie przydatne w przypadku badania produktów zanieczysz-czonych jedynie alergenami A. simplex. Niestety, brak jest komercyjnych testów immunoenzymatycznych umożliwiających wykrywanie antygenów A. simplex w rybach i produktach rybnych. Wymaga to od labo-ratoriów wdrażania własnych metod badawczych, na przykład Zakład Parazytologii PIWet-PIB wprowadził do stosowania własny test ELISA do wykrywania białek A. simplex, o granicy wykrywalności wynoszącej 1 larwę w 200 g produktu rybnego.
Inne metody
Do wykrywania obecności A. simplex w produktach rybnych opracowano także inne metody. Jak dotąd nie znalazły one jeszcze szerokiego zastosowania. Wśród tych metod na uwagę zasługuje chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LC-MS/MS). Jest to technika umożlwiającą identyfikację, ustalenie struktury cząsteczek, oznaczenie ilościowe oraz masę związków chemicznych. LC-MS/MS została wykorzystana do półilościowego i ilościowego wykrywania obecności dwóch białek A. simplex: hemoglobiny (anisakid
hemo-globin) oraz SXP/RAL-2 (20). Granica wykrywalności tej metody mieści się w zakresie 0,1-10 µg/ml. Mimo wysokiej czułości, ze względu na wysokie koszty oraz duże wymagania sprzętowe technika ta jest zalecana przez autorów jako metoda potwierdzająca obecność białek Anisakis w próbce.
Z kolei ciekawym rozwiązaniem do wykrywania ni-cieni w filetach rybnych, w warunkach przemysłowych jest zastosowanie techniki obrazowania wielospektral-nego (39). Opracowana technika opiera się na zasto-sowaniu połączenia spektroskopii światła widzialnego oraz bliskiej podczerwieni. Metoda ta pozwoliła na przeprowadzenie badania w tempie jednego fileta dor-sza na sekundę. Jej wadą jest jednak znaczny odsetek wyników fałszywie dodatnich, nawet do 60%.
Do wykrywania larw L3 Anisakis spp. oraz Pseudo -terranova spp. w jamie ciała i mięśniach śledzi zasto-sowano również badanie rezonansem magnetycznym (3). Dzięki zastosowaniu rezonansu magnetycznego możliwe było nawet zaobserwowanie ruchu larw. Waż-ną zaletą tej techniki jest niedestrukcyjne badanie ryb. Metoda ta nie została jeszcze zastosowana do badania ryb w warunkach przemysłowych.
Zgodnie z obowiązującymi regulacjami, ryby i pro-dukty rybne przed wprowadzeniem na rynek muszą pod-legać badaniu w kierunku obecności pasożytów. Tylko produkty, w których nie wykryto pasożytów, mogą być wprowadzone do obrotu. Jedyną określoną w przepisach metodą wykrywania pasożytów, w tym larw A. simplex, jest badanie makroskopowe, będące metodą niedestruk-cyjną, lecz jednocześnie mało efektywną. Z powodu rosnącej świadomości na temat zagrożeń związanych z występowaniem A. simplex w produktach rybnych na-stąpił rozwój metod bardziej czułych i dokładniejszych niż badanie wzrokowe. Wśród tych metod najczęściej stosowana jest metoda kompresorowa oraz wytrawia-nia, które są technikami destrukcyjnymi, stosowanymi przede wszystkim do badania filetów rybnych. Metoda wytrawiania jest bardziej efektywna w wykrywaniu larw Anisakis niż kompresorowa z wykorzystaniem pod-świetlenia światłem białym. Znaczną poprawę czułości metody kompresorowej uzyskano poprzez zastosowanie podświetlenia światłem UV, jednakże zastosowanie pod-świetlenia UV możliwe jest jedynie wobec produktów poddanych obróbce termicznej. W przypadku produktów wysoce przetworzonych (np. konserwy rybne, pasztety rybne i in.) zastosowanie mają metody umożliwiające wykrywanie DNA – jak PCR – oraz białek – najczęściej za pomocą testu ELISA. Metody te mają generalnie dobrą czułość i niską granicę wykrywalności, lecz wy-magają specjalistycznego wyposażenia laboratorium oraz generują wyższe koszty badań. Ponadto cały czas prowadzone są badania nad metodami nieniszczącymi, umożliwiającymi wykonywanie badań w warunkach przemysłowych, np. z zastosowaniem spektroskopii lub rezonansu magnetycznego. Metody te wymagają dalszego dopracowania, aby mogły być wykorzystane na szeroką skalę.
Piśmiennictwo
1. Adams A. M., Ton M. N., Wekell M. M., MacKenzie A. P., Dong F. M.: Survival of Anisakis simplex in arrowtooth flounder (Atheresthes stomia) during frozen storage. J. Food Prot. 2005, 68, 1441-1446.
2. Audicana M. T., Ansotegui I. J., Corres L. F. de, Kennedy M. W.: Anisakis simplex: dangerous- dead and alive? Trends Parasitol. 2002, 18, 20-25. 3. Bao M., Strachan N. J. C., Hastie L. C., MacKenzie K., Seton H. C., Pierce
G. J.: Employing visual inspection and Magnetic Resonance Imaging to investigate Anisakis simplex s. l. infection in herring viscera. Food Control 2017, 75, 40-47.
4. Bilska-Zając E., Lalle M., Różycki M., Chmurzyńska E., Kochanowski M., Karamon J., Sroka J., Pozio E., Cencek T.: High prevalence of Anisakidae larvae in marketed frozen fillets of pink salmons (Oncorhynchus gorbuscha). Food Control 2016, 68, 216-219.
5. Bilska-Zając E., Różycki M., Chmurzyńska E., Karamon J., Sroka J., Kochanowski M., Kusyk P., Cencek T.: Parasites of Anisakidae Family – Geographical Distribution and Threat to Human Health. Journal of Agricultural Science and Technology A 2015, 5, 146-152.
6. Bucci C., Gallotta S., Morra I., Fortunato A., Ciacci C., Iovino P.: Anisakis, just think about it in an emergency! Int. J. Infect. Dis. 2013, 17, e1071-e1072. 7. Buchmann K., Mehrdana F.: Effects of anisakid nematodes Anisakis simplex
(s.l.), Pseudoterranova decipiens (s.l.) and Contracaecum osculatum (s.l.) on fish and consumer health. Food and Waterborne Parasitology 2016, 4, 13-22. 8. Cammilleri G., Chetta M., Costa A., Graci S., Collura R., Buscemi M. D.,
Cusimano M., Alongi A., Principato D., Giangrosso G., Vella A., Ferrantelli V.: Validation of the TrichinEasy digestion system for the detection of Anisakidae larvae in fish products. Acta Parasitol. 2016, 61, 369-375.
9. Carballeda-Sangiao N., Olivares F., Rodriguez-Mahillo A. I., Careche M., Tejada M., Moneo I., González-Muñoz M.: Identification of autoclave-resistant Anisakis simplex allergens. J. Food Prot. 2014, 77, 605-609.
10. Celano G. V., Paparella A., Fransvea A., Balzaretti C., Celano G.: Rapid Method for Detection of Anisakidae Larvae in Marine Fishes, Based on UV Transillumination. Int. J. Biosci. Biochem. Bioinforma 2013, 3, 392-394. 11. Ceuppens S., Li D., Uyttendaele M., Renault P., Ross P., Ranst M. Van,
Cocolin L., Donaghy J.: Molecular Methods in Food Safety Microbiology: Interpretation and Implications of Nucleic Acid Detection. Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. 2014, 13, 551-577.
12. Cipriani P., Acerra V., Bellisario B., Sbaraglia G. L., Cheleschi R., Nascetti G., Mattiucci S.: Larval migration of the zoonotic parasite Anisakis pegreffii (Nematoda: Anisakidae) in European anchovy, Engraulis encrasicolus: Implications to seafood safety. Food Control 2016, 59, 148-157.
13. Commission Regulation (EC) No 1020/2008 amending Annexes II and III to Regulation (EC) No 853/2004 of the European Parliament and of the Council laying down specific hygiene rules for food of animal origin and Regulation (EC) No 2076/2005 as regards identification marking, raw milk and dairy products, eggs and egg products and certain fishery products.
14. Commission Regulation (EC) No 2074/2005 laying down implementing measures for certain products under Regulation (EC) No 853/2004 of the European Parliament and of the Council and for the organisation of official controls under Regulation (EC) No 854/2004 of the European Parliament and of the Council and Regulation (EC) No 882/2004 of the European Parliament and of the Council, derogating from Regulation (EC) No 852/2004 of the European Parliament and of the Council and amending Regulations (EC) No 853/2004 and (EC) No 854/2004.
15. Commission Regulation (EC) No 2075/2005 of 5 December 2005 laying down specific rules on official controls for Trichinella in meat.
16. Commission Regulation (EU) No 1276/2011 amending Annex III to Regulation (EC) No 853/2004 of the European Parliament and of the Council as regards the treatment to kill viable parasites in fishery products for human consumption. 17. D’amico P., Malandra R., Costanzo F., Castigliego L., Guidi A., Gianfaldoni D.,
Armani A.: Evolution of the Anisakis risk management in the European and Italian context. Food Res. Int. 2014, 64, 348-362.
18. EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ): Scientific Opinion on risk assessment of parasites in fishery products. EFSA Journal. 2010, 8, 1543. Doi: 10.2903/j.efsa.2010.1543.
19. Espiñeira M., Herrero B., Vieites J. M., Santaclara F. J.: Detection and iden-tification of anisakids in seafood by fragment length polymorphism analysis and PCR–RFLP of ITS-1 region. Food Control 2010, 21, 1051-1060. 20. Fæste C. K., Moen A., Schniedewind B., Haug Anonsen J., Klawitter J.,
Christians U.: Development of liquid chromatography-tandem mass spec-trometry methods for the quantitation of Anisakis simplex proteins in fish. J. Chromatogr. A 2016, 1432, 58-72.
21. Gómez-Morales M. A., Castro C. M., Lalle M., Fernández R., Pezzotti P., Abollo E., Pozio E.: UV-press method versus artificial digestion method to detect Anisakidae L3 in fish fillets: Comparative study and suitability for the industry. Fish Res. http://dx.doi.org/10.1016/j.fishres.2016.12.011
22. Guz L., Studzińska M. B., Sadzikowski A. B., Gundłach J. L.: Anisakioza. Ann. Univ. Maria Curie-Sklodowska, Sect. DD 2005, 60, 75-87.
23. Guz L., Studzińska M. B., Sadzikowski A. B., Gundłach J. L.: Larwy Anisakis simplex w wędzonych śledziach. Ann. Univ. Maria Curie-Sklodowska, Sect. DD 2005, 60, 89-94.
24. Herrero B., Vieites J. M., Espiñeira M.: Detection of anisakids in fish and seafood products by real-time PCR. Food Control 2011, 22, 933-939. 25. Jackson G. J., Bier J. W., Payne W. L., McClure F. D.: Recovery of parasitic
nematodes from fish by digestion or elution. Appl. Environ. Microbiol. 1981, 41, 912-914.
26. Karl H., Ostermeyer U., Bauer H., Miller A., Mohn K., Müller-Hohe E., Neuhaus H., Pölzelbauer C., Stumme B., Walter M., Wernusch J., Werth B.-M., Wittmann C.: Collaborative study for quantification of Anisakis larvae in spiked salmon fillets (Salmo salar) by a modified Codex digestion method. J. Verbr. Lebensm. 2014, 9, 359-365.
27. Levsen A., Lunestad B. T., Berland B.: Low detection efficiency of candling as a commonly recommended inspection method for nematode larvae in the flesh of pelagic fish. J. Food. Prot. 2005, 68, 828-832.
28. Llarena-Reino M., González Á. F., Vello C., Outeiriño L., Pascual S.: The accuracy of visual inspection for preventing risk of Anisakis spp. infection in unprocessed fish. Food Control 2012, 23, 54-58.
29. Llarena-Reino M., Piñeiro C., Antonio J., Outeriño L., Vello C., González Á. F., Pascual S.: Optimization of the pepsin digestion method for anisakids inspection in the fishing industry. Vet. Parasitol. 2013, 191, 276-283. 30. Lopez I., Pardo M. A.: Evaluation of a real-time polymerase chain reaction
(PCR) assay for detection of Anisakis simplex parasite as a food-borne allergen source in seafood products. J. Agric. Food Chem. 2010, 58, 1469-1477. 31. Mossali C., Palermo S., Capra E., Piccolo G., Botti S., Bandi C., D’Amelio S.,
Giuffra E.: Sensitive detection and quantification of anisakid parasite residues in food products. Foodborne Pathog. Dis. 2010, 7, 391-397.
32. Pachner A. R., Delaney E.: The polymerase chain reaction in the diagnosis of Lyme neuroborreliosis. Ann. Neurol. 1993, 34, 544-550.
33. Pozio E.: Integrating animal health surveillance and food safety: the example of Anisakis. Rev. Sci. Tech. 2013, 32, 487-496.
34. Regulation (EC) No 853/2004 of the European Parliament and of the Council of 29 April 2004 laying down specific hygiene rules for food of animal origin. 35. Rodríguez-Mahillo A. I., González-Muñoz M., Heras C. de las, Tejada M.,
Moneo I.: Quantification of Anisakis simplex allergens in fresh, long-term frozen, and cooked fish muscle. Foodborne Pathog. Dis. 2010, 7, 967-973. 36. Rudzki E.: Pasożyt ryb Anisakis simplex. Med. Prakt. 2005, 09, 159-161. 37. Schrader C., Schielke A., Ellerbroek L., Johne R. L.: PCR inhibitors –
occur-rence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 2012, 113, 1014-1026. 38. Seesao Y., Audebert C., Verrez-Bagnis V., Merlin S., Jérôme M., Viscogliosi E.,
Dei-Cas E., Aliouat-Denis C. M., Gay M.: Monitoring of four DNA extraction methods upstream of high-throughput sequencing of Anisakidae nematodes. J. Microbiol. Methods 2014, 102, 69-72.
39. Sivertsen A. H., Heia K., Hindberg K., Godtliebsen F.: Automatic nematode detection in cod fillets (Gadus morhua L.) by hyperspectral imaging. J. Food Eng. 2012, 111, 675-681.
40. Šimat V., Miletić J., Bogdanović T., Poljak V., Mladineo I.: Role of biogenic amines in the post-mortem migration of Anisakis pegreffii (Nematoda: Anisakidae Dujardin, 1845) larvae into fish fillets. Int. J. Food Microbiol. 2015, 214, 179-186.
41. Smith J. W., Wootten R.: Anisakis and Anisakiasis. Adv Parasitol. 1978, 16, 93-163.
42. Szczebyło A., Halicka E.: Analiza zachowań konsumentów sushi na rynku warszawskim. ITP. 2015, 2, 384-396.
43. Szostakowska B., Myjak P., Wyszyński M., Pietkiewicz H., Rokicki J.: Prevalence of anisakin nematodes in fish from Southern Baltic Sea. Pol. J. Microbiol. 2005, 54, 41-45.
44. Tejada M., Olivares F., Heras C. de las, Careche M., Solas M. T., García M. L., Fernandez A., Mendizábal A., Navas A., Rodríguez-Mahillo A. I., González-Muñoz M.: Antigenicity of Anisakis simplex s.s. L3 in parasitized fish after heating conditions used in the canning processing. J. Sci. Food Agric. 2015, 95, 922-927.
45. Werner M. T., Fæste C. K., Levsen A., Egaas E.: A quantitative sandwich ELISA for the detection of Anisakis simplex protein in seafood. Eur. Food Res. Technol. 2011, 232, 157-166.
46. Xu X., Sui J., Cao L., Lin H.: Direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for rapid screening of anisakid larvae in seafood. J. Sci. Food Agric. 2010, 90, 877-881.
Adres autora: lek. wet. Maciej Kochanowski, Al. Partyzantów 57, 24-100 Puławy; e-mail: maciej.kochanowski@piwet.pulawy.pl
