Załącznik do instrukcji z Technik

29  Download (0)

Pełen tekst

(1)

Chromatogramy –

Załącznik do instrukcji z Technik

Rozdzielania Mieszanin

(2)

Kolumna DIOL 100, 4µm, 250x4,6mm Kolumna DIOL 1000,

4µm, 250x4,6mm

Albumina - monomer

Chromatogram

UV-DAD serwatki (200-350nm)

Chromatogram

UV-DAD serwatki (205-330nm)

Badania dotyczące dobrania wypełnienia o odpowiednim zakresie wielkości porów, zapewniają- cych wnikanie wszystkich molekuł – warunki niestosowane na ćwiczeniach

Monomeryczne formy wnikają takŜe do porów 100A; Sorbent o porach 1000A ma zbyt małą powierzchnię sorpcyjną.

(3)

Kolumna: Si 60 Superspher, 5µm, 250x4mm Eluent: woda

NatęŜenie przepływu: 0,8 mL/min.

Dozowano: 50 µL serwatki otrzymanej z uŜyciem kwasu mlekowego, pH=4.6

Wniosek dodatkowy : Układ mało selektywny i mało sprawny - nie osiągnięto warunków pozwalających na rozdzielenie składników serwatki, a takŜe spolimeryzowanej formy

albuminy.

albumina

Wniosek główny !!!

Widać, Ŝe,

spolimeryzowana forma albuminy nie wnika do porów 60A, (ani do 100A);

Do preparatywnej separacji zastosowano warunki

wykluczania. (Nie jest to optymalne rozwiązanie).

(4)

Kolumna: SI 60 Superspher, 5µm, 250x4mm Eluent: 0,1 M bufor fosforanowy, 0,05 M NaCl, 0,02% NaN3; pH = 4,6

NatęŜenie przepływu: 0,6 mL/min.

Dozowano: 50 µL serwatki (kwas mlekowy, pH=4.6)

chromatogram UV-DAD serwatki(230-660 nm)

albumina

Przykład wniosku: Zakwaszenie eluentu i

zmniejszenie przepływu spowodowało poprawę symetrii i wzrost sprawności kolumny - spadek szerokości pików - wzrost rozdzielczości

(5)

Kolumna Si 60 Superspher, 5µm, 250x4mm

Eluent: 0,1 M bufor fosforanowy, 0,05 M NaCl, 0,02%

NaN3 – dwa razy rozcieńczony pH = 4,6 NatęŜenie przepływu: 0,6 mL/min.

Dozowano: 50 µL serwatki (kwas mlekowy, pH=4,6) albumina

Przykład wniosku:

Zmniejszenie siły elucyjnej eluentu spowodowało wzrost retencji składników serwatki i poprawę rozdzielczości

(6)

Kolumna Si 60 Lichrosorb, 5µm, 250x4mm

Eluent 0,1 M bufor fosforanowy, 0,05 M NaCl, 0,02% NaN3 – dwa razy rozcieńczony pH = 4,6

NatęŜenie przepływu: 0,5 mL/min.

Dozowano: 20 µL serwatki (kwas mlekowy, pH=4,6) chromatogram UV-DAD serwatki (220-400 nm)

albumina

A

(7)

Kolumna Si 100 Lichrospher, 5µm, 250x4mm

Eluent: 0,1 M bufor fosforanowy, 0,05 M NaCl, 0,02% NaN3 – dwa razy rozcieńczony pH = 4,6

NatęŜenie przepływu: 0,5 mL/min.

Dozowano: 20 µL serwatki (kwas mlekowy, pH=4,6) albumina

B

(8)

Kolumna Si 60 Lichrosorb, 5µm, 250x4mm

Eluent: woda+20% EtOH+0,05% kwasu mlekowego NatęŜenie przepływu: 0,5 mL/min.

Dozowano: 20 µL serwatki (kwas mlekowy, pH=4,6) albumina

chromatogram UV-DAD serwatki (220-400 nm)

C

(9)

Kolumna Si 100 Lichrospher, 5µm, 250x4mm

Eluent: woda+20% EtOH+0,05% kwasu mlekowego NatęŜenie przepływu: 0,5 mL/min.

Dozowano: 20 µL serwatki (kwas mlekowy, pH=4,6) albumina

D

(10)

Dozowano: 20 µL serwatki (kwas mlekowy, pH=4,6) NatęŜenie przepływu:0,5 mL/min.

Kolumna: A, C - Si 60 Lichrosorb B, D - Si 100 Lichrospher Eluent: A, B - bufor fosforanowy

C, D – woda + 20% EtOH + 0,05% kwasu mlekowego

C B A

D I

n t e n s i t y [AU]

albumina

albumina albumina

albumina

Zestawienie chromatogramów serwatki przy λ= 280 nm dla róŜnych kolumn i układów separacyjnych

(11)

Kolumna: Si 60 Lichrosorb, 5µm, 250x4mm

Eluent: woda+20% EtOH+0,1% kwasu mlekowego NatęŜenie Przepływu: 0,5 mL/min.

Dozowano: 20 µL serwatki (kwas mlekowy, pH=4,6) albumina

Przykład wniosku: Zwiększenie dodatku kwasu mlekowego w eluencie wpływa korzystnie w przypadku substancji X, lecz nie wpływa na retencję albuminy (białko jest nadal wykluczane)

X

(12)

Nastrzyk 20 µL serwatki (kwas mlekowy, pH=4,6) NatęŜenie przepływu:0,5mL/min.

Kolumna Si 60 Lichrosorb 5µm, 250x4mm

Eluent A – woda + 20% EtOH + 0,05% kwasu mlekowego B – woda + 20% EtOH + 0,1% kwasu mlekowego

A

B

albumina

albumina

Zestawienie chromatogramów serwatki przy λ= 280 nm dla kolumny Si60 i róŜny skład eluentów

(13)

Kolumna DIOL 250, 4µm, 250x4,6mm Eluent: woda

NatęŜenie przepływu: 0,8 mL/min.

Dozowano: 20 µL serwatki (kwas mlekowy, pH=4,6) albumina

(14)

Kolumna DIOL 250, 4µm, 250x4,6mm Eluent woda

NatęŜenie przepływu: 0,3 mL/min.

Dozowano: 20 µL serwatki (kwas mlekowy, pH=4,6) albumina chromatogram UV-DAD serwatki (220-410 nm)

(15)

Kolumna DIOL 250, 4µm, 250x4,6mm Eluent: woda + 10% alkoholu etylowego + 0,05% kw. mlekowego

NatęŜenie przepływu: 0,3 mL/min.

Dozowano: 20 µL serwatki (kwas mlekowy, pH=4,6) albumina

(16)

C B A

Kolumna DIOL 250, 4µm, 250x4,6mm

Dozowano: 20µL serwatki (kwas mlekowy pH=4,6)

Eluent A woda B woda C woda + 10%EtOH + 0,05% kw. mlekowego NatęŜenie przepływu A 0,8 mL/min. B 0,3 mL/min. C 0,3 mL/min.

Zestawienie chromatogramów serwatki przy λ= 280 nm dla kolumny DIOL250 - zmienne natęŜenie przepływu i skład eluentu

(17)

Przykładowy chromatogram testu kolumny modelowej A

Kolumna Si 60 Lichrosorb, 5µm, 250x4mm

Eluent woda+20% EtOH+0,05% kwasu mlekowego Natęrzenie przepływu: 0,5 mL/min.

Dozowano: 20µL acetonu o stęŜeniu 50 µL/ml eluentu chromatogram UV-DAD

acetonu (220-400 nm)

aceton

(18)

Kolumna: Si 100 Lichrospher, 5µm, 250x4mm

Eluent: woda+30% EtOH+0,05% kwasu mlekowego NatęŜenie przepływu: 0,5 mL/min.

Dozowano: 20µL acetonu o stęŜeniu 25µL/ml eluentu chromatogram UV-DAD acetonu

(220-400 nm)

aceton

Przykładowy chromatogram testu kolumny

modelowej B

(19)

Kolumna preparatywna Si 60, 10µm, 250x16 mm Eluent: woda+30% EtOH+0,05% kwasu mlekowego NatęŜenie przepływu: 4,8 mL/min.

Dozwano: 20 µL acetonu o stęŜeniu 25 µL/ml eluentu

aceton

Przykładowy chromatogram testu kolumny

preparatywnej, λ=260 nm

(20)

A B

Test kolumny modelowej A Test kolumny modelowej B Test kolumny preparatywnej

C

aceton

aceton

Zestawienie chromatogramów acetonu przy λ= 260 nm, dla róŜnych kolumn

(21)

t[min.]

H2O+

0,05%TFA

ACN+

0,05%TFA

0 90 10

15 0 75

20 0 100

albumina

albumina chromatogram UV-DAD serwatki (250-400nm) Kolumna

RP18 100,

5µµµµm, 250x4mm

Kolumna WP300, 5µµµµm, 250x4mm

Przepływ eluentu 1,5 ml/min.

Program elucji:

Dozowano:

20 µ L serwatki zakwaszonej

kwasem mlekowym

pH=4,6

(22)

Przepływ eluentu 1,5 ml/min.

Program elucji:

Dozowano:

20 µ L serwatki zakwaszonej

kwasem mlekowym pH=4,6

t[min.]

H2O+

0,05%TFA

ACN+

0,05%TFA

0 90 10

15 45 55

15,1 0 100

20 0 100

chromatogram UV-DAD serwatki (200-400nm)

chromatogram UV-DAD serwatki (250-400nm) Kolumna

RP18 100,

5µµµµm, 250x4mm

Kolumna WP300, 5µµµµm, 250x4mm

(23)

t[min.]

H2O+0,075%

TFA

ACN+0,075%

TFA

0 95 5

15 25 75

15,1 0 100

20 0 100

Albumina

Chromatogram serwatki (λ=280 nm)

Kolumna WP 300, 5 µ m, 250x4 mm Program elucji

Przepływ 1,0 mL/min.

Dozowano 20uL serwatki zakwaszonej

kwasem mlekowym pH=4,6

(24)

t[min.]

H2O+0,075%

TFA

ACN+0,075%

TFA

0 95 5

15 25 75

15,1 0 100

20 0 100

Albumina

Kolumna RP-18 100, 5 µ m, 250x4 mm Program elucji

Przepływ 1,0 mL/min.

Dozowano 20uL serwatki zakwaszonej kwasem mlekowym pH=4,6

Chromatogram serwatki (λ=280 nm)

(25)

t[min.]

H2O+0,075%

TFA

ACN+0,075%

TFA

0 95 5

15 25 75

15,1 0 100

20 0 100

Kolumna Ph 3 µ m, 150x4mm Program elucji

Przepływ 1,0 mL/min.

Dozowano 20uL serwatki zakwaszonej kwasem mlekowym pH=4,6

Albumina

Chromatogram serwatki (λ=280 nm)

(26)

Chromatografia preparatywna – zebranie frakcji

Zbieranie frakcji

Albumina

Kolumna 250x16,8mm Lichrospher Si 60 - 10µm;

Eluent : woda+20% EtOH+0,05%

kwasu mlekowego (v/v) Przepływ - 4,0 mL/min.

Dozowano:

1- 50uL roztworu wzorca albuminy

2- 200uL serwatki zakwaszonej

kwasem mlekowym – pH=4,6

Chromatograf preparatywny

(27)

Chromatografia preparatywna – zebranie frakcji

1

2

Albumina - wzorzec

Kolumna 250x16,8mm Lichrospher Si 60 - 10µm;

Eluent : woda+20% EtOH+0,05%

kwasu mlekowego (v/v) Przepływ - 4,8 mL/min.

Dozowano:

1- 50uL roztworu wzorca albuminy

2- 200uL serwatki zakwaszonej

kwasem mlekowym – pH=4,6

Chromatograf HP 1050

(28)

Albumina ZEBRANA FRAKCJA

Kolumna RP-18 WP300, 5 µ m, 250x4mm Program elucji

Przepływ 1,0 mL/min.

Dozowano 20uL frakcji

t[min.]

H2O+0,075%T FA

ACN+0,075%

TFA

0 95 5

15 25 75

15,1 0 100

20 0 100

(29)

Kolumna RP-18 WP300, 5 µ m, 250x4mm Program elucji

Przepływ 1,0 mL/min Dozowano 20uL frakcji Membrana typu PP

t[min.]

H2O+0,075%

TFA

ACN+0,075

%TFA

0 95 5

15 25 75

15,1 0 100

20 0 100

Albumina

Chromatogram frakcji eluatu - po wzbogaceniu z wykorzystaniem

techniki membranowej

Obraz

Updating...

Cytaty

Powiązane tematy :