UTLENIANIE AZOTYNÓW PRZEZ NITROBACTER W ROZTWORACH WODNYCH O RÓŻNYCH pH
Z akład N a w o żen ia IU N G — B yd goszcz
Pierwsze moje badania nad nitryfikacją prowadzone w kulturach piaskowych wobec węglanu wapnia wskazują na to, że w okresie groma dzenia się azotynów mogą następować straty w azocie [1]. W dalszych badaniach okazało się, że straty w azocie nie następują, jeżeli azotyny zostają szybko utlenione.
W następnych pracach postanowiono zająć się dokładniej samą dzia łalnością Nitrobacter. Najpierw zbadano w p ływ odczynu na utlenianie azotynów do azotanów w roztworach wodnych. Podobne doświadczenie przeprowadził S i l v e r [4], który określał aktywność Nitrobacter w aparacie Warburga na podstawie ilości zużytego tlenu w roztworach fosforanowych o pH 5,6— 8,5. Przeprowadzone przez autora kolorym et ryczne oznaczenia azotynów i azotanów dały wyniki niezgodne z ilościa mi zużytego tlenu. Największe zużycie azotynów otrzymał dla niskiego pH, przy którym zużycie tlenu było niewielkie.
W badaniach podobnych do prac S i l v e r a starano się określić aktywność Nitrobacter na drodze chemicznej z przyrastającej ilości azotanów. Jednoczesne oznaczenia azotynów pozwalały stwierdzić, czy proces ten związany jest ze stratami azotu.
Roztwory do prowadzenia kultur przygotowano wzorując się na pracy Silvera z tą zmianą, że jako źródło węgla zamiast Na2C 03 wzięto N aH C 03 i w celu uzyskania niższych pH zastosowano kwas fosforowy.
Do sporządzenia pożywek przygotowano następujące roztwory:
— N a N 02 — 10 g, NaCl — 5 g, NaHCOs — 8,4 g, M g S 04-7H 20 — 3 g i F e S 04 — 0,03 g, rozcieńczone wodą do 8 1 i wysterylizow ane. — Trzy 0,lm roztwory fosforanowe: H3P 0 4, KH2P 04 i K2H P 0 4. Roztwory fosforanowe służyły do nadawania pożywkom określonego pH i w tym celu mieszano je w takich stosunkach, żeby uzyskać 15 roz tworów 0,lm o pH w granicach 2,6— 9. Roztwory te również w ysteryli- zowano.
Do sterylnych kolb Erlenmayera odmierzano po 40 m l pierwszego roz tworu i po 10 m l roztworu fosforowego o odpowiednim pH. W próbnych mieszaninach o takim samym składzie sprawdzano pH za pomocą peha metru „LBS-Eureka” z elektrodą szklaną. Z każdej kombinacji pH przy gotowano kilka powtórzeń pozwalających na pobieranie prób do analizy po różnych okresach inkubacji.
Kulturę Nitrobacter wyhodowano z gleby na opisanej pożywce o pH 8 i oczyszczano przez kolejne 16-krotne przeszczepianie do tej samej pożywki. Aktywność Nitrobacter kontrolowano przez kolorym e tryczne oznaczanie zaniku azotynów. Szczepionkę zagęszczano przez od wirowanie i przechowywano w roztworze fosforanowym o pH 8 w lo dówce w temperaturze ok. 7°C.
Do każdej erlanmayerki zawierającej 50 ml badanego roztworu (po żywki) wprowadzono po 1 kropli takiej szczepionki. Część prób pozostała nie zaszczepiona w warunkach sterylnych, celem zbadania chemicznych przemian azotynów. W szystkie próby inkubowano w termostacie w tem peraturze 24— 25°C. W określonych odstępach czasu pobierano próbki do analizy na zawartość azotynów i azotanów. Oznaczenia przeprowadzano metodą polegającą na usunięciu azotynów za pomocą azydku sodowego, zredukowaniu pozostałych azotanów stopem Dewarda i zmiareczkowaniu oddestylowanego amoniaku metodą podbrominową [3j. W równoległej próbce oznaczano sumę azotu azotanowego i azotynowego przez redukcję stopem Dewarda i oznaczenie amoniaku. Doświadczenia zostały powtó rzone trzykrotnie w różnych terminach. Wyniki dotyczące utleniania azotynów przedstawia rys. 1
Jak widać z przebiegu krzywych, środowisko alkaliczne sprzyja szyb kiemu utlenianiu bakteryjnem u azotynów do azotanów. W roztworze o pH 6,6 utlenianie przebiegało bardzo powoli i dopiero w roztworach o pH 7,4 i wyższych zachodziło dużo szybciej i prawie jednakowo. Inne doświadczenia pozwoliły wyznaczyć dolną granicę pH działalności N i
trobacter na 6,5, gdyż przy tym pH stwierdzono jeszcze całkowite utle
nienie azotynów po upływ ie ok 2 tygodni.
Rysunek 2 przedstawia dwie krzywe charakteryzujące przebieg nitryfikacji w zależności od pH po ti = 138 godz. oraz t2 — 234 godz.
Trzy powtórzenia przeprowadzone dla roztworów inkubowanych przez 138, 263 i 290 godz. dały wyniki różniące się w yłącznie szybkością przebiegu nitryfikacji. Różnice zostały zapewne spowodowane niejedna kową aktywnością szczepionek stosowanych w powtórzeniach.
W granicach 6— 9 pH, w których prowadzono badania, nie stw ier dzono wyraźnego maksimum działalności Nitrobacter. Jakkolwiek wyniki przedstawione na rys. 2 wykazują maksimum przy pH 8,65, to przy powtórzeniu doświadczeń nie stwierdzono wyraźnego obniżenia aktyw
ności Nitróbacter powyżej tego pH. Utrzym ywała się ona na stałym po ziomie aż do zastosowanego granicznego pH 9. U tlenianie azotynów do azotanów przez Nitróbacter zachodziło bez żadnych strat w azocie w
ca-R ys. 1. S zyb k ość u tle n ia n ia a zo ty n ó w p rzez R ys. 2. U tle n ia n ie a zotyn ów
N i t r ó b a c t e r w roztw orach o różnych pH p rzez N i t r ó b a c t e r w roztw orach o różn ych pH po dw óch o k re sach czasu od zaszczep ien ia: po
138 godz. i po 234 godz.
łym zakresie stosowanego pH. Wyniki te są podobne do w yników S i
1-V e r a, który mierząc zużycie tlenu otrzymał maksimum aktywności dla
pH 6,8—8,2.
W kulturach sterylnych zachodziło również utlenianie azotynów do azotanów, ale tylko w środowiskach kwaśnych. Było ono tym większe, im niższe było pH roztworu, natomiast nie zachodziło wcale w zakresie pH 6,5— 9, w którym w ystępuje aktywność Nitróbacter. W tym zakresie pH nawet po 11 dniach stężenie azotynów w roztworze nie uległo żad nym zmianom. Dane te ilustruje diagram przedstawiony na rys. 3.
Chemiczne utlenianie azotynów do azotanów przy niskich pH jest związane ze stratami azotu. Zgodnie z poglądem C l a r k a , B e a r d a i S m i t h a [1] chemiczne przemiany kwasu azotawego w środowisku kwaśnym można przedstawić za pomocą schematu:
3H N 0 2-> 2N 0 + H N 0 3 + H20
Jak z równania wynika, stratom azotynów powinno odpowiadać na gromadzanie się azotanów w ilości odpowiadającej 1/3 przereagowanych
azotynów. Drugi produkt reakcji „NO” może się ulotnić, a przy dostępie tlenu powietrza przejść w N 0 2 i po reakcji z wodą także w ytw orzyć częściowo kwas azotowy.
Chemiczne utlenianie zachodzi bardzo szybko. W roztworze o pH 2,6 już po 3 dniach nie znaleziono azotynów, a w roztworze o pH 3,3 tylko m ałe ilości.
R ys. 3. P rzem ia n y azo ty n ó w w s te r y l n ych roztw orach o różn ych pH po 11
d niach od p rzy g o to w a n ia roztw orów
Zanotowane przez S i 1 v e r a większe zużycie azotynów przy niższych pH można by wyjaśnić stwierdzonym chemicznym rozkładem azotynów. Być może jednak, że m etody chemiczne (kolorymetryczne) zastosowane przez S i 1 V e r a były za mało dokładne i dlatego przy ich pomocy nie uzyskał w yników zgodnych z pomiarami zużycia tlenu.
L IT E R A T U R A
[1] C l a r k F. E., B e a r d W. E., S m i t h D. E.: D issim ila r n itrify in g ca p a cities o f soils in rela tio n to losses of ap p lied nitrogen. S o il Sei. Soc. Am . Proc., t. 24, 1960, 50— 54.
[2] K a j a L.: N itry fik a cja a straty azotu w k u ltu rach p ia sk o w y ch . Roczn. G lebozn., d od atek do tom u X , 1961, 693— 697.
[3] K a j a L.: O zn aczan ie azotu azotan ow ego, a zo ty n o w eg o i a m o n o w eg o z z a sto so w a n iem azydku sodu. Roczn. G lebozn., 1963, d odatek do tom u X III. [4j S i l v e r W. S.: S tu d ies on N itrite O x id izin g M icroorgan ism s. I. N itr ite
O x id ation by N itrob acter. S o il Sei. Soc. A m . Proc. t. 25, 1961, 197— 199.
л. КАЯ О КИ СЛ ЕН ИЯ Н И Т РИ ТО В М И К РО Б А М И N I T R O S O M O N A S В В О Д Н Ы Х Р А С Т В О Р А Х С Р А ЗЛ И Ч Н Ы М pH О т д е л У д о б р е н и я И н с т и т у т а А г р о т е х н и к и У д о б р е н и й и П о ч в о в е д е н и я , Б ы д г о щ Р е з ю м е А втор и зуч ал влияние pH в одн ы х растворов на ок и слен и е нитратны ми м и кробами нитритов в нитраты. А ктивность процесса оп р едел ял и хим ическим п у тем обозн ач ая периоди чно со д ер ж а н и е нитратов и нитритов. Н и ж н ей границей ж и зн ед ея т ел ь н о ст и N itr o so m o n a s ок азал ось pH 6,5, м ак симум варьировал в п р ед ел а х 8,65 — 9,0 pH. L . K A J A O X ID A T IO N OF N IT R IT E S B Y N I T R O B A C T E R IN A Q U E O U S SO L U T IO N W ITH D IF FE R E N T pH S u m m a r y
T he in flu e n c e of pH in aq u eou s so lu tio n s on th e o x id a tio n o f n itra tes to n i tr ite s by n i t r o b a c t e r w a s in v e stig a te d . Its action w a s d eterm in ed ch em ica lly by m ea su rin g the con ten ts of n itra tes and n itr ite s at certain in terv a ls.
The lo v er lim it for n i t r o b a c t e r action w a s found to be pH 6,5, m axim u m e ff e c t w a s ob served at 8.65 to 9 pH.
