• Nie Znaleziono Wyników

Spektrometria mas jest technik

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "Spektrometria mas jest technik"

Copied!
36
0
0

Pełen tekst

(1)

1 Spektrometria mas (MS)

Spektrometria mas jest techniką analityczną, która w chemii organicznej i w naukach z niej się wywodzących służy zarówno do badania lub potwierdzenia struktury związków organicznych jak i oznaczania jakościowego oraz ilościowego określonych związków występujących w mieszaninie. Umożliwia wykrycie substancji znajdujących się w złożonych mieszaninach chemicznych nawet w minimalnych ilościach rzędu femtogramów.

Wykorzystywana jest przez chemików, fizyków, kryminologów, astronomów1, biologów, biochemików w medycynie jak również w ochronie środowiska oraz wielu innych dziedzinach nauki.

Metodę tę wykorzystuje się między innymi do:

 identyfikacji i oznaczania ilości poszczególnych składników w mieszaninach organicznych,

 badaniach kinetyki i termodynamiki reakcji chemicznych,

ustalania składu izotopowego analizowanych substancji, co m.in. umożliwia określenie ich źródła pochodzenia

 przeprowadzania ultraczułych wielopierwiastkowych analiz nieorganicznych,

 identyfikacji struktury cząstek,

 badań sekwencji białek i polisacharydów,

 identyfikacji substancji w kosmosie,

 monitoringu zanieczyszczeń środowiska,

 wykrywania fałszerstw i skażeń żywności,

 badaniach antydopingowych,

 monitorowania procesów przemysłowych.

Historia spektrometrii mas zaczęła się od badań Sir Josepha Johna Thomsona z Uniwersytetu w Cambridge dotyczących przewodzenia prądu przez gazy. Badania te doprowadziły do odkrycia elektronu w 1897 roku. Za te badania Thomson otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie fizyki w 1906 roku.

Na początku XX wieku Thomson zaobserwował, że promieniowanie katodowe (wiązka elektronów) może zostać odchylone przez pole elektrostatyczne. Urządzenie, w którym

1 http://nai.nasa.gov/annual-reports/2009/uwis/development-of-laser-ablation-electron-impact-ionization- miniature-mass-spectrometer-la-ei-mms-for-in-situ-chemical-and-isotopic-measurements-of-martian-rocks/

(2)

zaobserwowano to zjawisko, jest prekursorem spektrometru mas. Thomson nie poprzestał na obserwacji odchylenia wiązki elektronów i zaczął badać odchylenia wiązek różnych jonów.

Badania te doprowadziły do powstania w latach 1899-1911 pierwszego spektrometru mas, nazwanego przez Thomsona „Parabola spectrograph”. W urządzeniu tym jony były poddawane działaniu pola elektromagnetycznego, co powodowało odchylenie toru ich lotu.

Jony

o różnym stosunku masy do ładunku (m/z) charakteryzowały się różnym stopniem odchylenia. Detektorem spektrometru Thomsona była płyta fotograficzna lub ekran fluorescencyjny. Jony o różnym m/z uderzały w różnych miejscach ekranu detektora.

Po I wojnie światowej współpracownik Thomsona, Francis William Aston zbudował spektrometr mas o znacznie większej rozdzielczości. Spektrometr ten pozwolił na obserwację izotopów. Za zbudowanie spektrometru mas i odkrycie wielu nie promieniotwórczych izotopów Astonowi przyznano Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii w 1922 roku. W tym samym czasie Arthur Jeffrey Dempster, podobnie jak Aston udoskonalił analizator magnetyczny. Dempster opracował także stosowaną do dziś metodę jonizacji substancji za pomocą strumienia elektronów (źródło jonów EI).

Thomson, Aston i Dempster stworzyli teoretyczne podstawy do rozwoju spektrometrii mas.

Ponad sto lat od pierwszych doświadczeń Thomsona spektrometry mas są niezastąpionym narzędziem w pracy fizyków, chemików, biologów i lekarzy prowadzących badania naukowe na ziemi i w przestrzeni kosmicznej. Coraz częściej spektrometry mas są stosowane w przemyśle, wojsku, policji i innych instytucjach.

Biologia molekularna jest jedną z dziedzin intensywnie korzystających ze spektrometrii mas. Analiza wielkocząsteczkowych biopolimerów nie byłaby możliwa bez wykorzystania łagodnych metod jonizacji - elektrorozpylania (ESI) i desorpcji laserowej z udziałem matrycy (MALDI). W roku 2002 Szwedzka Akademia Nauk przyznała Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii Johnowi Fennowi i Koichi Tanace za zastosowanie metod łagodnej jonizacji w badaniach wielkocząsteczkowych biopolimerów.

1.1 Zasada działania spektrometru masowego

Podstawą działania każdego spektrometru, bez względu na konstrukcję, jest jonizacja cząsteczek badanej substancji, co umożliwia przyspieszenie jej w polu elektrycznym w próżni. Jonizację próbki można przeprowadzić za pomocą jednej z metod wymienionych w dalszej części instrukcji. Heterogeniczny strumień jonów (dodatnich lub ujemnych) zostaje

(3)

rozdzielony na szereg składowych, zależnie od stosunku masy do ładunku (m/z). Ze stosunku masy do ładunku jonu można zwykle wywnioskować, jaka była masa cząsteczkowa analizowanego związku chemicznego lub jego fragmentu. Metody jonizacji w niektórych spektrometrach mas są tak dobrane, aby ładunek (z) był dla większości jonów równy 1, a zatem przy interpretacji widma można przyjąć, że m/z odpowiada po prostu masie cząsteczkowej jonu. Warto zauważyć, że masa cząsteczkowa jednokrotnie naładowanego jonu jest w przybliżeniu równa masie cząsteczkowej niezjonizowanej substancji tylko wtedy, gdy jonizacja jest dokonywana przez dołączenie elektronu (ze względu na bardzo małą masę elektronu). Jeśli do cząsteczki dołączany jest proton, to masa jonu jest większa od masy substancji niezjonizowanej o masę protonu (1,00727646688 Da).

Dokładną masę badanego, wyjściowego związku chemicznego, na podstawie miejsca występowania sygnału powstałego z jego niepofragmentowanego jonu w widmie można obliczyć według wzoru:

gdzie:

mzw - masa wyjściowej cząsteczki, która ulegała jonizacji bez fragmentowania

m/z - wartość odczytana z dobrze skalibrowanego widma dla niepofragmentowanego jonu, odpowiadająca stosunkowi masy analizowanej cząsteczki w Daltonach do liczby ładunków elementarnych (z) które niósł z sobą jon, który wygenerował analizowany sygnał;

mcz - suma mas cząstek lub jonów, które nadały ładunek poprzez przyłączenie się do wyjściowej cząsteczki w daltonach, (protonu - 1,00727646688 Da; elektronu około 0,00054862 Da). Jeśli jonizacja następuje na skutek oderwania cząstki to należy podstawić jej masę ze znakiem minus.

1.2 Rodzaje jonów w spektrometrii mas

Jon molekularny to kation rodnikowy M+.powstały podczas jonizacji próbki w wyniku utraty elektronu przez cząsteczkę badanego związku. Wartość m/z tego jonu odpowiada masie cząsteczkowej tych molekuł, które zbudowane są z najlżejszych izotopów pierwiastków wchodzących w skład związku.

Jony izotopowe. Pikom odpowiadającym jonom złożonym z izotopów o najmniejszych masach atomowych towarzyszą piki o wartości m/z większej o jedną, dwie, a czasem kilka jednostek o intensywności na ogół znacznie mniejszej, odpowiadające jonom zawierającym izotopy o większych masach atomowych.

(4)

Jon fragmentacyjny – jon powstały w wyniku spontanicznej fragmentacji substancji (np.

podczas jonizacji metodą EI) lub uzyskany techniką tandemowej spektrometrii masowej.

Dostarcza informacji o strukturze substancji analizowanej.

Jon podstawowy to najintensywniejszy jon w widmie.

1.3 Teoria procesu fragmentacji

Kierunki fragmentacji często daje się przewidzieć na podstawie dwu uzupełniających się teorii fragmentacji: teorii trwałości produktów fragmentacji oraz teorii lokalizacji ładunku.

Teoria trwałości produktów fragmentacji opiera się na założeniu, że energia stanu przejściowego w procesie fragmentacji jest niewiele większa od energii produktów fragmentacji (Rys. 1).

Rysunek 1: Zmiany energii podczas fragmentacji

Z założenia wynika, że im mniejsza jest sumaryczna energia wewnętrzna produktów fragmentacji, tym mniejsza jest energia aktywacji procesu fragmentacji. Uprzywilejowana powinna więc być fragmentacja prowadząca do produktów o większej trwałości (mniejszej energii wewnętrznej). Przy ocenie trwałości produktów fragmentacji należy brać pod uwagę sumaryczną energię wszystkich produktów fragmentacji. W szczególności należy brać pod uwagę następujące czynniki:

 Stabilizację kationów karbeniowych, co powoduje wzrost ich trwałości wraz ze wzrostem rzędowości;

 Stabilizację rezonansową kationów typu allilowego i benzylowego;

 Stabilizację rezonansową kationów z ładunkiem dodatnim przy węglu α względem

(5)

heteroatomu.

Teoria lokalizacji ładunku zakłada, że ładunek dodatni jonu jest zlokalizowany w pewnych szczególnych jego miejscach. Tymi miejscami są orbitale heteroatomów obsadzone w neutralnych cząsteczkach przez niewiążące pary elektronowe, a także wiązania π nie wchodzące w skład układów sprzężonych. Miejsce lokalizacji ładunku działa jako inicjator fragmentacji, która może się odbywać w sposób homolityczny, polegający na niezależnym przemieszczaniu się niesparowanych elektronów lub w sposób heterolityczny, polegający na przemieszczaniu się par elektronowych.

1.4 Fragmentacja głównych klas związków

1.4.1 Alkany

Jon molekularny w widmach alkanów prosto-łańcuchowych jest z reguły widoczny.

Jego intensywność maleje wraz ze wzrostem długości i stopnia rozgałęzienia łańcucha.

W widmach alkanów prosto-łańcuchowych obserwuje się grupy jonów przy wartościach m/z różniących się o 14 daltonów. Najmocniejszy jon w każdej grupie odpowiada jonom o wzorze CnH2n+1 występującym przy m/z=29, 43, 57, 71, 85, 99, 113 itd., a powstałym w wyniku rozpadu wiązań C-C w różnych miejscach łańcucha węglowego.

Rysunek 2: Rozpad wiązań C-C w różnych miejscach łańcucha węglowego

Przykładem może być widmo mas dekanu (Rys. 3).

Rysunek 3: Widmo mas dekanu

(mainlib) Decane

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150

0 50 100

14

27 29

30 39

41 43

44 53

56 57

67 69

71

77 83

85

99 113 142

(6)

Rozgałęzienie węglowodoru zmienia wygląd widma w sposób radykalny. Zwiększa się intensywność jonów odpowiadających stabilniejszym kationom o wyższej rzędowości, powstającym w wyniku rozszczepienia łańcucha węglowego przy jego rozgałęzieniu. W widmie 3-etyloheksanu jonom tym odpowiadają piki przy m/z=58 i 71 (Rys. 4).

Rysunek 4: Widmo mas 3-etyloheksanu

1.4.2 Alkeny

Jon molekularny w widmach alkenów prosto-łańcuchowych jest zazwyczaj widoczny.

Ładunek dodatni w jonie molekularnym jest zlokalizowany w znacznym stopniu w obrębie wiązania podwójnego, co stabilizuje jon, a równocześnie inicjuje rozpad wiązania α , β względem wiązania podwójnego. Prowadzi to do powstania stabilizowanego rezonansowo kationu allilowego lub jego pochodnych. Kation allilowy w widmie 1-decenu daje pasmo główne przy m/z=41 (Rys. 5).

Rysunek 5: Widmo mas 1-decenu

(mainlib) Hexane, 3-ethyl-

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

0 50 100

1 12 15

27 28

29

30 37

39 41

42 43

44 50 53

57

58 63 66 69 71

72 77 79 81 83 84

85

86 91 93 98 114

(mainlib) 1-Decene

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150

0 50 100

15

27 29

30 37

39 41

44

56

57

65 69

70

77 83

84

91 96 97

111

125

140

(7)

1.4.3 Węglowodory aromatyczne i alkiloaromatyczne

Jony molekularne niepodstawionych związków aromatycznych są wyjątkowo stabilne i ulegają fragmentacji w niewielkim tylko stopniu, dlatego odpowiednie jony molekularne są z reguły jonami podstawowymi, tak jak w widmie naftalenu (Rys. 6).

Rysunek 6: Widmo mas naftalenu

Charakterystycznym typem fragmentacji węglowodorów aromatycznych jest odszczepienie cząsteczki acetylenu od jonu molekularnego.

Dominującym typem fragmentacji węglowodorów alkiloaromatycznych jest rozpad wiązania między atomami α i β względem pierścienia aromatycznego. Rozpad ten prowadzi do powstania silnie stabilizowanego rezonansowo, aromatycznego kationu tropyliowego (Rys.

7), któremu odpowiada zazwyczaj mocny jon o m/z = 91, tak jak np.

Rysunek 7: Kation tropyliowy

Kation tropyliowy może odszczepić cząsteczkę acetylenu, przekształcając się w kation cyklopentadienylowy [C5H5]+ o m/z=65.

1.5 Aparatura

Każdy spektrometr mas składa się z następujących elementów:

 układ wprowadzenia próbki,

 źródło jonów,

(mainlib) Naphthalene

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140

0 50 100

26 37 39

51 52

64

65 75 78 85 87 89 97 102

113

128

(8)

 analizator,

 detektor,

 rejestrator (najczęściej komputer).

Rysunek 8: Schemat ideowy zasady działania spektrometru mas

1.5.1 Układ wprowadzania próbki

W spektrometrii mas, analizuje się jony w stanie gazowym.

 wlot zimny: nie ma problemu z próbkami w fazie gazowej (gazy, substancje lotne – zasysane (przeciek) w wyniku różnicy ciśnień). Stosuje się wprowadzenia składające się z komory, do której wprowadza się próbki, oraz zawór dozującego próbkę do aparatu,

 wlot gorący – próbki w postaci cieczy i roztworów wymagają wstępnego ogrzewania injektora. Maks. temperatura portu ~ 480°C. Ciśnienie ~ 10-5 Torr,

 sondy wprowadzające – substancje stałe,

 Układy GC-MS,

 Układy LC-MS,

 Układy HPLC-MS.

1.5.2 Źródła jonów

Źródła jonów służą do przeprowadzania substancji analizowanych w spektrometrze w jony znajdujące się w fazie gazowej pod bardzo niskim ciśnieniem. W analizie ilościowej stosowane są następujące rodzaje jonizacji: jonizacja elektronami i jonizacja chemiczna.

(9)

1.5.2.1 Electron impact (EI)

Historycznie pierwsze i dotychczas najbardziej rozpowszechnione źródło jonów.

Składa się ono z dwóch elektrod – ogrzewanej katody, najczęściej w postaci wolframowego żarnika i zimnej anody (zwanej również kolektorem lub pułapką). Po przyłożeniu napięcia między elektrody, z katody w wyniku termoemisji wybijane są elektrony, które przyśpieszając w polu elektrycznym podążają w kierunku anody. W momencie zderzenia elektronu z anodą, jego energia wyrażona w elektronowoltach (eV) jest równa liczbowo różnicy potencjałów (napięciu) między katodą i anodą (w woltach). Ogrzewanie katody ma na celu obniżenie pracy wyjścia elektronów, tj. energii potrzebnej na uwolnienie elektronu z ciała stałego.

Anoda i katoda występują najczęściej w postaci elektrod zespolonych, w których katodę stanowi żarnik rozpięty między dwoma wyprowadzeniami, natomiast anodą jest metalowa płytka umieszczona za żarnikiem i połączona elektrycznie z jednym z wyprowadzeń (Rysunek 9).

Rysunek 9: Zespolone elektrody źródła jonów

W źródle jonów znajdują się dwa takie zestawy elektrod, umieszczone naprzeciwko siebie. Celem stosowania takiego układu jest zapewnienie ciągłości pracy aparatu w przypadku przepalenia jednego z żarników. Nie jest konieczna jego natychmiastowa wymiana, która wymaga kilku godzin (zapowietrzenie spektrometru, wymiana żarnika i odpompowanie). W oprogramowaniu obsługującym spektrometr istniej możliwość przełączenia pomiędzy żarnikami. W takim przypadku kierunek wiązki elektronów zostaje odwrócony i może być wymagane przeprowadzenie kalibracji kształtu wiązki jonów, jednakże czynność ta jest zazwyczaj zautomatyzowana i zajmuje ok. 15 minut. Na rysunku 10 przedstawiony został schemat układu jonizacji EI.

(10)

Rysunek 10: Schemat jonizacji elektronowej

Strumień cząstek obojętnych (analitu) przecina wiązkę elektronów. Energia elektronów wzrasta wraz z odległością od katody i dopiero w momencie zderzenia osiąga wartość wynikającą z przyłożonej różnicy potencjałów. W punkcie przecięcia się wiązki i strumienia próbki jest niższa niż różnica potencjałów między katodą i anodą, ale wartość energii w tym miejscu można łatwo obliczyć na podstawie geometrii układu i podstawowych praw fizyki. Praktycznie każdy spektrometr masowy ma możliwość regulacji energii jonizacji przez zmianę tego napięcia. Typową stosowaną wartością jest 70 eV. Elektrony zderzając się z cząsteczkami próbki wybijają elektron lub elektrony z ich orbit walencyjnych. Powstają dodatnio naładowane jony. Jony te wypychane są ze strumienia przez elektrodę o potencjale wyższym niż katoda. Elektroda ta nazywana jest repellerem (dosł. „odpychacz”). Od potencjału tej elektrody zależna jest skuteczność odpychania jonów o różnych masach.

Wartość tego potencjału ustala się na etapie kalibracji tak, aby uzyskać optymalne natężenie jonów o możliwie szerokim zakresie mas (Rysunek 11).

(11)

Rysunek 11: Zależność natężenia jonów o różnych masach w zależności od napięcia repellera

Strumień jonów przyśpieszany jest przez elektrodę przyśpieszającą o niskim potencjale (niższym od repellera, 0 V na rysunku 10). Kształt wiązki (zbieżność) formowany jest przez przyłożenie odpowiedniego napięcia do soczewki skupiającej. Nazwa „soczewka” wzięła się stąd, że podobnie jak klasyczna soczewka optyczna zmienia kierunek biegu promieni świetlnych, tak ta soczewka może zmieniać kierunek w którym poruszają się naładowane cząstki. W praktyce taka soczewka to metalowa płytka z otworem w środku. Zmianę trajektorii uzyskuje się przez odpychanie lub przyciąganie elektrostatyczne wynikające z różnicy potencjałów.

Najczęściej stosowany zakres analizy: 10-1000 Da. Cząsteczki o wyższych masach ulegają łatwo dekompozycji przy stosowaniu jonizacji typu EI. W takich przypadkach należy rozważyć użycie innej techniki jonizacji.

Zastosowania: potwierdzanie masy cząsteczkowej substancji po syntezie, ochrona środowiska (analiza niskocząsteczkowych zanieczyszczeń), nadzór prawidłowości procesów technologicznych, kontrola antydopingowa.

Postać wyników: piki obserwowane na widmie masowym posiadają zazwyczaj ładunek +1.

W przypadku niskorozdzielczej analizy typu EI masa cząsteczkowa próbki jest zazwyczaj równa m/z.

1.5.2.2 Jonizacja chemiczna (CI)

Metoda jonizacji “łagodniejsza” w porównaniu do EI, tzn. daje możliwość uzyskania jonu molekularnego o większej intensywności w porównaniu do jonów fragmentacyjnych niż w metodzie EI. Jonizacja substancji następuje na skutek zderzeń z tzw. jonami pierwotnymi występującymi w źródle jonów. Najczęściej są to jony gazów obojętnych, metanu, izobutanu, amoniaku. W praktyce stosowany może być każdy gaz zawierający w cząsteczce wodór. Aby zderzenia pomiędzy analitem i jonami pierwotnymi zachodziły wystarczająco często, w źródle jonów typu CI należy wytworzyć ciśnienie około 60 Pa. Jest to ciśnienie wielokrotnie

(12)

wyższe niż ciśnienie panujące wewnątrz spektrometru masowego. W przypadku stosowania jonizacji chemicznej próbek wprowadzanych z chromatografu gazowego konieczne jest wprowadzanie gazu jonizującego w ilości ok. 100 razy większej niż ilość gazu wprowadzanego przez kolumnę GC.

Źródło jonów w jonizacji chemicznej nie różni się zasadą działania od źródła EI. Inna jest natomiast konstrukcja mechaniczna. Źródło to posiada znacznie więcej otworów niż źródło EI, dzięki czemu wprowadzany gaz może być lepiej oddzielony od strumienia jonów.

Wygląd i budowę obu typów źródeł przedstawiono tu:

http://www.agilent.com/cs/library/flyers/public/Sources.pdf.

Najczęściej stosowany zakres analizy: 10 - 3000 Da.

Zastosowania: detekcja w chromatografii gazowej, farmakologia, kontrola antydopingowa, ochrona środowiska (np. analiza TCDD, PCB).

Postać wyników: jonizacja następuje zazwyczaj poprzez przyłączenie protonu(-ów) do analizowanych cząsteczek co należy uwzględnić podczas obliczania rzeczywistej masy analitu (dla z=+1 m/z = M-1).

1.5.2.3 Electrospray (ESI)

Electrospray to jedna z nowszych metod jonizacji próbki w spektrometrii masowej.

Próbka ulega jonizacji pod ciśnieniem atmosferycznym przy użyciu napięcia rzędu 2000- 5000V.

Podstawowe zalety metody to:

minimalna fragmentacja próbki podczas jonizacji,

wysoka czułość oznaczeń,

kompatybilność z technikami chromatograficznymi (HPLC) oraz elektroforetycznymi (CE),

możliwość analizy dużych cząsteczek (do ok. 80 000 Da).

Rysunek 12: Jonizacja ESI

(13)

Cechą charakterystyczną widm masowych ESI są serie pików odpowiadających kolejnym, wielokrotnie naładowanym, protonowanym jonom [M+zH]z+, [M+(z+1)H](z+1)+, itd. Powyższe zjawisko umożliwia analizowanie mas znacznie większych niż nominalny zakres pomiarowy analizatora przy zachowaniu stosunkowo wysokiej rozdzielczości, np.

związek o masie 5000 Da po przyłączeniu 5 protonów będzie obserwowany przy m/z=1001 ([5000 + 5]/5=1001). W celu transformacji widma jonów wielokrotnie zjonizowanych do masy rzeczywistej (dekonwolucja) stosuje się oddzielny program komputerowy.

Najczęściej stosowany zakres analizy: 50 – 80 000 Da.

Najczęściej analizowane próbki: średnio- i wysokocząsteczkowe substancje organiczne, peptydy, białka, polimery, kwasy nukleinowe w postaci ciekłej.

Zastosowania: biochemia, biotechnologia, farmakologia, neurochemia, medycyna sądowa, detekcja w chromatografii cieczowej.

Postać wyników: serie pików o różnej ilości przyłączonych/oderwanych protonów. M = (m- nz)/nz dla z+.

1.5.2.4 MALDI (desorpcja/jonizacja laserowa w matrycy)

W metodzie MALDI analizowaną substancję jonizuje się po jej uprzednim zmieszaniu z roztworem matrycy (małe cząsteczki organiczne silnie absorbujące promieniowanie przy stosowanej długości fali lasera). Po odparowaniu rozpuszczalnika próbkę naświetla się impulsami lasera, co powoduje wzbudzenie elektronów w matrycy. Jony, utworzone przez przeniesienie protonu między wzbudzoną matrycą a analizowaną substancją, ulegają następnie desorpcji. Jedną z zalet metody jest możliwość analizowania substancji o masach nawet do 1 000 000 Da.

Rysunek 13: Jonizacja MALDI

(14)

Zakres analizy: 500-1 000 000 Da. Najczęściej analizowane próbki: średnio- i wysokocząsteczowe substancje organiczne, peptydy, białka, polimery, kwasy nukleinoweZastosowania: biochemia, biotechnologia, farmakologia, neurochemia, immunologiaPostać wyników: zazwyczaj jonizacja +1, rzadziej +2, możliwość obserwacji niekowalencyjnych kompleksów

1.5.2.5 Termorozpylanie (Termospray, TE)

Jonizacja przez podgrzanie przy pomocy prądu elektrycznego roztworu zawierającego sól i analizowaną substancję wewnątrz stalowej kapilary. Gorąca substancja jest rozpylana w komorze próżniowej z prędkością naddźwiękową.

1.5.2.6 Bombardowanie szybkimi atomami (Fast-Atom Bombardment FAB)

Jonizacja polegającą na bombardowaniu cząsteczki obojętnymi atomami o wysokiej energii (zwykle 17 lub 70 eV). Cząsteczki mogą znajdować się w fazie gazowej lub być rozpuszczone w ciekłej, mało lotnej substancji (matrycy) np. glicerolu.

1.5.2.7 Bombardowanie jonami (spektrometria mas jonów wtórnych – Secondary Ion Mass Spectrometry – SIMS)

Metoda ta początkowo była stosowana do substancji przewodzących prąd lub substancji naniesionych na metalowe płytki. Obecnie metodę SIMS stosuje się z powodzeniem do substancji nie przewodzących prądu. Istnieje odmiana techniki SIMS, w której badana substancja jest rozpuszczona w ciekłej matrycy (najczęściej glicerolu).

Technika ta jest nazywana czasami LSIMS (Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry) lub FIB (Fast Ion Bombardment).

1.5.2.8 Desorpcja laserowa (Laser Desorption – LD)

W metodzie tej jonizacja następuje przez naświetlanie próbki silnym laserem, a zatem bombardującymi cząstkami są wysokoenergetyczne fotony.

1.5.2.9 Plazma wzbudzona indukcyjnie (ICP)

Jonizowana substancja jest wprowadzana do plazmy płomienia palnika znajdującego się w kwarcowej rurze. Rura otoczona jest cewką, przez którą przepływa prąd zmienny o wysokiej częstotliwości. Plazma ogrzewa się do temperatury rzędu 10 000 K w wyniku

(15)

wzbudzenia polem magnetycznym wytworzonym przez prąd płynący w cewce. Metoda nadaje się doskonale do analizy pierwiastków metalicznych.

1.5.3 Analizator

W spektrometrach mas stosowane są różne typy analizatorów masy, tj.:

1.5.3.1 Analizator czasu przelotu (Time Of Flight TOF)

Jony wprowadzane do analizatora są przyspieszane przy pomocy impulsu elektrycznego i zaczynają dryfować przez komorę analizatora. Na końcu analizatora znajduje się detektor jonów połączony z urządzeniem rejestrującym czas od impulsu przyspieszającego do momentu uderzenia określonego jonu w detektor. Pomiar m/z jest oparty na fakcie, że ze wzrostem masy cząsteczkowej jonów, wydłuża się ich czas przelotu. Obecnie stosuje się często analizatory czasu przelotu ze zwierciadłem elektrostatycznym, które zwiększa rozdzielczość aparatu, ale zmniejsza zakres dopuszczalnych mas cząsteczkowych.

Analizatory TOF charakteryzują się stosunkowo dużymi rozdzielczościami rzędu kilkudziesięciu tysięcy (do 100 000) oraz dosyć dużą czułością. Są najczęściej stosowane razem ze źródłami jonów MALDI. Analizatory te pozwalają na oznaczenie masy cząsteczkowej z dokładnością do 0,0001 Da, a co za tym idzie – ustalenie wzoru sumarycznego analizowanej substancji wyłącznie na podstawie jej masy cząsteczkowej, wykorzystując fakt, że masy atomowe poszczególnych pierwiastków nie są liczbami całkowitymi i tylko określone kombinacje atomów i ich liczby w cząsteczce mogą dać masę cząsteczkową o danej wartości. Możliwe jest dzięki temu oznaczanie składu fragmentów łańcuchów białkowych wyłącznie na podstawie widma masowego.

1.5.3.2 Sektor magnetyczny (Magnetic sector)

Analizator ten wykorzystuje zjawisko zmiany toru lotu jonów w polu magnetycznym.

Tor lotu jonów jest zakrzywiany, stopień zakrzywienia lotu zależy od stosunku masy do ładunku (m/z) i prędkości jonu a także od parametrów pola magnetycznego. Sektor magnetyczny charakteryzuje się stosunkowo małą rozdzielczością – mniej niż 5000.

Związane jest to głównie z dużymi różnicami prędkości cząsteczek wpadających do urządzenia. Problem ten rozwiązuje przez zastosowanie sektora elektrycznego przed sektorem magnetycznym, w którym cząsteczki są rozpędzane, dzięki czemu różnice prędkości są mniejsze.

(16)

Rysunek 14: Spektrometr mas z sektorem magnetycznym

Na rysunku linią przerywaną zaznaczone zostały trajektorie jonów o różnym stosunku m/z lub różnej prędkości. Jony zbyt lekkie lub zbyt wolne odchylane są silniej przez pole magnetyczne, przez co nie trafiają do detektora, lecz zderzają się ze ścianką urządzenia. Jony o zbyt dużej masie lub zbyt dużej prędkości odchylane są zbyt słabo z podobnym skutkiem.

Jedynie jony o odpowiedniej masie i energii kinetycznej są w stanie przemieścić się po zakrzywionym torze i trafić do detektora. Stosunek m/z jonów trafiających do detektora ustalić można przez zmianę natężenia pola magnetycznego lub zmianę energii kinetycznej (prędkości) jonów, manipulując napięciem elektrody przyśpieszającej.

1.5.3.3 Sektor elektryczny

Urządzenie to wykorzystuje zjawisko zmiany toru lotu jonów w polu elektrostatycznym, jest zbudowane z dwóch równoległych, zakrzywionych płyt do których przyłożono potencjał elektryczny. Jony o jednakowej energii translacyjnej mają jednakowe tory lotu w sektorze elektrycznym. Za sektorem elektrycznym znajduje się szczelina przez którą przelatują tylko jony o określonej energii. Sektor elektryczny jest stosowany przed sektorami magnetycznymi w spektrometrach mas o podwójnym ogniskowaniu.

(17)

Rysunek 15: Analizator wykorzystujący połączenie sektora elektrostatycznego z sektorem magnetycznym

Ideą takiego połączenia jest zmiana toru lotu jonów o różnej prędkości tak, aby jony o tej samej masie, niezależnie od prędkości, trafiały zawsze w ten sam punkt znajdujący się za sektorem magnetycznym.

Na rysunku 15 dodatnio naładowane jony trafiają do sektora elektrostatycznego. Jony o dużej prędkości przebywają w sektorze krótszy czas, przez co ich tory lotu zakrzywiane są w mniejszym stopniu (lewa i górna linia przerywana). Następnie trafiają one do sektora magnetycznego, gdzie przemieszczają się po łuku i z powodu ich większej prędkości odchylane są o mniejszy kąt (dolna lewa linia). W przypadku jonów o mniejszej prędkości sytuacja jest odwrotna – najpierw jony odchylane są silniej w sektorze elektrostatycznym, a następnie silniej w sektorze magnetycznym – o większy kąt, ale ich trajektoria jest dłuższa. W efekcie możliwe jest uzyskanie skupienia jonów o tym samym stosunku m/z ale różnej energii kinetycznej w tym samym punkcie.

1.5.3.4 Kwadrupol (Quadrupole)

Jest to jeden z najczęściej stosowanych analizatorów ze względu na jego dobre parametry użytkowe i niewielkie wymiary. Analizator ten jest zbudowany z czterech symetrycznie ułożonych równoległych prętów.

Rysunek 16: Analizator kwadrupolowy

(18)

Działa jako filtr masy – w jednym momencie przepuszcza tylko jony o określonym stosunku masy do ładunku (m/z). Dzieje się to dzięki przykładaniu do prętów prądu zmiennego o określonej częstotliwości i napięciu oraz napięcia stałego. Zmieniając stosunek napięcia przemiennego do napięcia stałego, kwadrupol można ustawić tak, aby przepuszczał jony o szerokim lub wąskim zakresie m/z. Jony w kwadrupolu poruszają się po skomplikowanych trajektoriach wykonując ruchy oscylacyjne w dwóch płaszczyznach.

Stosunek m/z jonów opuszczających kwadrupol (trafiających do detektora) uzależniony jest od amplitudy napięcia przemiennego i wartości napięcia stałego. W przypadku jonów o zbyt małej masie w wyniku działania przemiennego pola elektrycznego są one wyrzucane na zewnątrz kwadrupola. W przypadku jonów o zbyt dużej masie dryfują one powoli na zewnątrz.

Rysunek 17: Stabilność trajektorii jonów w analizatorze kwadrupolowym. A – jon o zbyt małej masie, niestabilny, wyrzucany na zewnątrz pod wpływem przemiennego pola elektrycznego; B – jon o odpowiedniej masie (przelatujący

przez analizator); C – jon o zbyt dużej masie – dryfuje na zewnątrz w wyniku działania stałego pola elektrycznego

Zwiększając szerokość zakresu uzyskać można większą czułość (więcej jonów trafia do detektora) kosztem gorszej rozdzielczości – do detektora będą trafiały również jony o m/z zbliżonym do pożądanego. Typową rozdzielczością uzyskiwaną w analizatorach kwadrupolowych jest 1 Da, oznacza to, że możliwe jest rozdzielenie i obserwowanie pików izotopowych, nie jest natomiast możliwe wyznaczenie dokładnych mas analizowanych związków.

1.5.3.5 Pułapka jonowa (Ion trap – IT)

Jest analizatorem pozwalającym na przetrzymywanie jonów. Analizator ten działa na zasadzie podobnej do kwadrupola. Manipulując parametrami prądu przyłączonego do elektrod można uwięzić w pułapce jony o określonym stosunku masy do ładunku (m/z) lub można uwięzić jony o szerokim zakresie m/z. Pomiaru masy dokonuje się przez uwięzienie w

(19)

pułapce jonów o szerokim zakresie m/z i wyrzucanie z pułapki kolejnych grup jonów o określonym m/z. Wnętrze pułapki jonowej wypełnione jest gazem obojętnym – helem pod ciśnieniem rzędu 10-1 Pa. Jeżeli jony w pułapce zostaną wzbudzone (przyspieszone), zderzenia z atomami helu spowodują fragmentację jonów. Pułapki jonowe charakteryzują się zwykle dość niewielką rozdzielczością (kilku tysięcy) oraz bardzo dużą czułością.

1.5.3.6 Liniowa pułapka jonowa (Linear Ion Trap, Linear Trap Quadrupole – LTQ) Pułapka jonowa jest zbudowana, jak kwadrupol, z czterech równoległych prętów. Na obu końcach analizatora przykładany jest potencjał elektryczny, który uniemożliwia ucieczkę jonów z analizatora. Pomiar masy odbywa się przez wyrzucanie jonów o określonym m/z z analizatora i detekcję. W liniowych pułapkach jonowych stosuje się często dwa detektory, co zwiększa czułość. Liniowe pułapki jonowe charakteryzują się bardzo dużą czułością (większą niż zwykłe pułapki jonowe) i stosunkowo niską rozdzielczością (kilka tysięcy). W liniowej pułapce jonowej, jony można przechowywać, poddawać fragmentacji i mierzyć masy fragmentów.

1.5.3.7 Analizator cyklotronowego rezonansu jonów (Ion Cyclotron Resonance ICR) Analizator cyklotronowy wykorzystuje zjawisko zakrzywienia toru lotu jonów w polu magnetycznym. Jony są pułapkowane w cyklotronie, gdzie wpadają w ruch kołowy. Widmo m/z jest tworzone przez działanie na jony polem elektromagnetycznym o zmieniającej się częstotliwości i rejestrację zmian natężenia prądu w płytach detektorowych lub zmiany absorpcji fali elektromagnetycznej. W analizatorze panuje bardzo wysoka próżnia – ciśnienie nie większe niż 10-4 Pa, zwykle 10-6 Pa lub mniejsze. Rozdzielczości analizatorów cyklotronowych mogą być bardzo duże, zwykle kilkaset tysięcy, mogą dochodzić nawet do miliona (przy m/z 500 Th). Rozdzielczości tych analizatorów szybko zmniejszają się wraz ze wzrostem m/z analizowanej cząsteczki.

1.5.3.8 Analizator cyklotronowego rezonansu jonów z fourierowską transformacją wyników (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance FT-ICR)

Analizator ten działa podobnie jak analizator cyklotronowego rezonansu jonowego. W analizatorze FT-ICR zastosowano bardziej wydajną metodę zbierania danych niż w ICR. W analizatorze FT-ICR przy pomocy złożonej fali elektromagnetycznej wzbudzane są jednocześnie wszystkie jony. Na płytach detektora rejestrowany jest sygnał zawierający wiele częstotliwości charakterystycznych dla jonów o różnym m/z. Sygnał ten jest przekształcany w widmo m/z przy pomocy Transformacji Fouriera. Analizatory FT-ICR są znacznie szybsze

(20)

niż analizatory ICR, inne parametry (rozdzielczość, czułość itp.) są podobne. Analizatory FT- ICR wyparły obecnie z rynku analizatory ICR.

1.5.3.9 Orbitrap

Zbudowany jest z dwóch elektrod zewnętrznych i jednej elektrody wewnętrznej pomiędzy którymi poruszają się jony. Tak więc analizator ten jest rodzajem pułapki jonowej.

Elektrody zewnętrzne mają kształt zwężających się na jednym z końców beczek. Elektrody te są ustawione szerszymi końcami do siebie. Wrzecionowata elektroda wewnętrzna umieszczona jest w środku urządzenia, jej oś symetrii pokrywa się z osiami symetrii elektrod zewnętrznych. Jony wprowadzone do analizatora poruszają się dookoła oraz wzdłuż jego osi.

Pomiar częstotliwości oscylacji jonów wzdłuż osi analizatora pozwala na obliczenie stosunku masy do ładunku jonu. Analizatory typu orbitrap charakteryzują się dużą rozdzielczością (do 200 000).

1.5.4 Detektor

Detektor jest częścią instrumentu odpowiadającą za pomiar natężenia strumienia jonów opuszczających analizator. Najprostszym rozwiązaniem jest skierowanie strumienia z analizatora wprost do detektora. Istotną jego wadą jest natomiast to, że na powierzchniach detektora zachodzić będzie neutralizacja ładunku cząstek, w związku z tym jony przekształcane będą w cząstki obojętne, które będą zanieczyszczały detektor.

Rozwiązaniem tego problemu jest wprowadzenie dodatkowej elektrody – dynody konwersyjnej, na powierzchni której naładowane cząstki przekształcane będą w strumień elektronów. W wyniku zderzeń jonów z powierzchnią dynody konwersyjnej wybijane będą z niej elektrony, które następnie trafiają do detektora. Takie rozwiązanie pozwala znacząco wydłużyć żywotność detektora. Podobnie jak w przypadku bezpośredniej konwersji, z czasem czułość układu wyposażonego w dynodę konwersyjną będzie maleć. Układ taki można jednak stosunkowo łatwo zregenerować oczyszczając dynodę konwersyjną (mechanicznie), co jest czynnością stosunkowo łatwą, ponieważ dynoda ta często wykonana jest w postaci metalowej blaszki.

Rysunek 18: Schemat detektora z dynodą konwersyjną

(21)

Rysunek 19: Detektor z dynodą konwersyjną. Z prawej strony wylot kwadrupola, dynoda to blaszka do której podłączony jest biały przewód, po lewej detektor. Detektor i kwadrupol nie znajdują się w jednej osi.

Zastosowanie dynody konwersyjnej wiąże się zazwyczaj z niewspółosiowym ułożeniem detektora i analizatora, dzięki czemu wysokoenergetyczne wzbudzone neutralne cząstki (zazwyczaj gazu nośnego) opuszczające analizator nie trafiają do detektora (przelatują dalej wzdłuż osi analizatora). W takim rozwiązaniu następuje jednak przecięcie toru lotu tych wysokoenergetycznych cząstek z elektronami emitowanymi przez dynodę, co w dość ogólnym ujęciu pogarsza osiągi analizy (strumień elektronów ulega rozproszeniu).

Problem ten rozwiązuje się za pomocą detektora trójosiowego, w którym strumień jonów opuszczających analizator odchylany jest elektrostatycznie za pomocą metalowego pręta do którego przyłożone jest odpowiednie napięcie. Odchylony strumień kierowany jest do dynody konwersyjnej i następnie do detektora. W tym układzie wyeliminowana zostaje możliwość interferencji wysokoenergetycznych wzbudzonych cząstek neutralnych ze strumieniem elektronów, ponieważ te dwa nie przecinają się. Dodatkowo jony wtórne powstałe w wyniku kolizji jonów z tymi cząstkami przed elektrodą odchylającą są blokowane przez osłonę z otworem znajdującą się przed dynodą. Tor lotu tych cząstek jest inny niż właściwych jonów, przez co nie trafiają w aperturę wyjściową układu odchylającego.

(22)

Rysunek 20: Detektor trójosiowy

1.5.4.1 Puszka Faradaya

Ten typ detektora zbudowany jest z wydłużonej, cylindrycznej komory. Jony wnikające do jej wnętrza przez niewielki otwór dochodzą do dna i przekazują tam swój ładunek. Powstający w ten sposób prąd rozładowania jest wzmacniany i mierzony za pomocą elektrometru. Czułość puszek jest dość ograniczona, jednak ponieważ ładunek puszek nie jest zależny od masy i prędkości jonów, stosowane są one między innymi do bardzo precyzyjnego pomiaru stosunku izotopowego.

1.5.4.2 Powielacz elektronów

Powielacze elektronów są zbudowane w formie rogu z rur wykonanych ze szkła ołowiowego, mającego dobre właściwości emisji elektronów wtórnych i jednakowy opór elektryczny. Napięcie przyłożone między dwoma końcami rury spada stopniowo wzdłuż całej jej długości. Każda cząstka, docierająca do wewnętrznej powierzchni detektora, powoduje emisję elektronów, które następnie przyspieszane są przez pole elektryczne do wnętrza rury, aby znów zderzyć się ze ścianką i spowodować emisję elektronów wtórnych. Sygnał wyjściowy podlega detekcji na płytce kolektora na końcu rury. Zasada działania powielacza elektronów podobna jest więc do zasady działania fotopowielacza. Jednak w tym przypadku nie stosuje się układu kilkunastu dynod, z których każda jest na wyższym potencjale w stosunku do poprzedniej tylko jedną elektrodę nazywaną dynodą ciągłą.

(23)

Rysunek 21: Schemat powielacza elektronów z dynodą ciągłą (channeltronu)

Rysunek 22: Rozwiązania konstrukcyjne channeltronów

Stopień powielania elektronów zależny jest od przyłożonego miedzy dynodami, lub na obu końcach dynody ciągłej napięcia. Zależność ta nie jest liniowa (Rysunek 23). Ponadto w trakcie użytkowania detektora jego czułość spada (dla tej samej ilości analitów uzyskuje się

(24)

mniejszą wartość sygnału), przez co konieczne jest zwiększanie napięcia w celu uzyskania wysokiej czułości.

Rysunek 23: Zależność czułości powielacza elektronów od napięcia dla nowego i starego detektora

1.5.4.3 Detektor mikrokanalikowy

Detektor mikrokanalikowy zbudowany jest z płytki, w której przewiercono cylindryczne, równoległe otworki (kanaliki). Każdy z nich ma średnicę 0,4-2,5 mm. Na stronie wejściowej płytki utrzymywany jest potencjał rzędu 1 kV w stosunku do strony wyjściowej. Na powierzchnię każdego kanalika naniesiona jest cienka warstwa półprzewodnika. W wyniku uderzenia jonu w powierzchnię kanalika następuje emisja elektronów wtórnych, które są następnie powielane w kolejnych zderzeniach ze ściankami kanalików. Efekt lawinowy może zwiększyć liczbę elektronów 105 -krotnie. Można także stosować układ dwu lub więcej płytek co daje wzmocnienie nawet 108. Przy wyjściu z każdego kanalika metalowa anoda zbiera strumień elektronów wtórnych i przekazuje sygnał do elektrometru. Zasada działania jest analogiczna do channeltronu, inna jest natomiast geometria.

1.5.5 Rejestrator

Komputer, w który wyposażony spektrometr mas, rejestruje otrzymywane z niego dane i przekształca je najczęściej w wykres wartości m/z - intensywności pików lub chromatogram całkowitego prądu jonowego. Na ekranie monitora lub w postaci wydruku otrzymuje się widma w postaci wykresów lub tablic, normalizując je przez przyjęcie za 100% intensywność piku podstawowego. Komputer może zawierać bazę danych, gdzie są zamieszczone widma znanych związków. Porównanie zmierzonego widma z kompletnym widmem z bazy danych

(25)

zidentyfikowanym przez komputer może zasadniczo ułatwić interpretację otrzymanych wyników.

2 Metoda GC-MS

Metoda GC-MS polega na połączeniu chromatografu gazowego ze spektrometrem mas.

Jest stosowana zarówno do identyfikacji składników mieszanin związków organicznych i nieorganicznych jak i do oznaczania ilościowego poszczególnych związków. Za pomocą techniki GC-MS oznaczyć można wszystkie związki, które da się oznaczać za pomocą chromatografii gazowej, tj. związki, które można przeprowadzić w stan gazowy w wyniku odparowania. Nie jest przy tym konieczne przekroczenie temperatury wrzenia danego związku. Wystarczające jest, jeśli związek ten będzie wykazywał wystarczająco wysoką prężność pary nasyconej w danej temperaturze, a jego całkowite odparowanie nastąpi w wyniku rozcieńczenia par gazem nośnym. Możliwe jest zatem analizowanie zarówno związków organicznych, jak i nieorganicznych, przy czym w przypadku związków nieorganicznych zakres stosowalności tej metody jest bardzo ograniczony. Nie jest możliwe analizowanie większości (co nie znaczy „żadnych”, bo np. TiCl4 jest wystarczająco lotny) soli, kwasów czy wodorotlenków.

Oznaczanie ilościowe metodą GC-MS stosuje się w tych przypadkach, gdy badana mieszanina składa się z wielu składników, zaś stężenie oznaczanego składnika jest niewielkie.

W tym przypadku stosując tylko analizę chromatograficzną, często nie uzyskuje się wystarczającego rozdziału chromatograficznego, a także nie ma pewności czy dany sygnał odpowiada oznaczanemu związkowi.

Rozdział mieszaniny związków znajdujących się w badanej próbce zachodzi na kolumnie chromatograficznej (kapilarnej lub znacznie rzadziej pakowanej). Kolumna podłączona jest do źródła jonów spektrometru mas. Związki organiczne eluują kolejno z kolumny do źródła jonów, gdzie zachodzi jonizacja. Gazem nośnym w metodzie GC-MS jest hel. Jeżeli stosujemy kolumny kapilarne, w których przepływ gazu nośnego przez kolumny analityczne wynosi około 1 ml/min, możemy stosować połączenie bezpośrednie, gdyż system próżniowy spektrometru mas jest w stanie utrzymać wymaganą w aparacie próżnię około 10-6 mmHg, pomimo dopływu helu w wyżej podanej ilości. Jeżeli stosujemy kolumny pakowane, gdzie przepływ gazu nośnego wynosi do kilkudziesięciu ml/min, konieczne jest zastosowanie pomiędzy chromatografem gazowym a spektrometrem mas urządzenia oddzielającego

(26)

większość gazu nośnego (separatora), bądź wprowadzającego jedynie część eluatu do spektrometru mas (dzielnika przepływu).

W metodzie GC-MS spektrometr mas może spełniać rolę detektora:

 nieselektywnego, czyli czułego na wszystkie składniki mieszaniny,

 selektywnego, czyli czułego jedynie na określony związek lub grupę związków.

Jako detektor nieselektywny, spektrometr mas rejestruje całkowity prąd jonowy w czasie.

Całkowity prąd jonowy jest proporcjonalny do ilości jonów, która jest z kolei proporcjonalna do zawartości eluującego składnika analizowanej mieszaniny. Tak więc zapis całkowitego prądu jonowego w czasie jest odpowiednikiem chromatogramu uzyskanego przy zastosowaniu nieselektywnego detektora chromatografu gazowego np. detektora płomieniowo-jonizacyjnego czyli FID. Rejestrację całkowitego prądu jonowego stosuje się przy identyfikacji składników mieszaniny.

Spektrometr mas działający jako detektor selektywny rejestruje jedynie wybrane jony, charakterystyczne dla danego związku lub grupy związków i w ten sposób wykrywa się jedynie określone związki.

W praktyce elektronika sterująca pracą analizatora mas jest na tyle szybka, że możliwe jest wykonywanie w czasie rzeczywistym przemiatania (skanowania) żądanego zakresu mas, nawet do kilkudziesięciu razy w ciągu sekundy. Efektem jednego takiego skanu jest widmo masowe o żądanym zakresie mas. Łącząc tę właściwość z techniką GC uzyskuje się narzędzie pozwalające na wyznaczanie widm masowych związków opuszczających kolumnę chromatografu gazowego. Wadą tej metody jest niska czułość, ponieważ jony o danym stosunku m/z trafiają do detektora jedynie przez bardzo krótką chwilę, by zaraz zostać zastąpione jonami o innym m/z. Jeżeli badana próbka zawiera związki o znanej budowie lub dających pewne znane jony w wyniku fragmentacji, możliwe jest znaczne zwiększenie czułości spektrometru w zakresie tych jonów przez zastosowanie techniki Scan+SIM (SIM – Single Ion Mode – tryb pojedynczego jonu). W tym trybie naprzemiennie zbierane są widma z całego zakresu i sygnały odpowiadające poszczególnym pożądanym jonom. Schemat pracy w tym trybie przedstawiono na rysunku 24. Na osi rzędnych naniesiono stosunek m/z jonów trafiających do detektora, na osi odciętych czas. W przedstawionym przykładowym przebiegu na zielono zaznaczono fazę Scan, czyli przemiatania całego zakresu widma (np. od 33 do 333 Da), na pomarańczowo zaznaczono fazę SIM, gdzie rejestrowane są osobno sygnały dla jonów o dwóch różnych stosunkach m/z (np. 136 i 204).

(27)

Zastosowanie takiego trybu pracy pozwala na zwiększenie czułości dla wybranych związków (lub grupy związków), oraz na szybką ocenę tego, które piki na chromatogramie pochodzą od związków z danej grupy. Ponadto prowadzenie analizy w trybie SIM daje możliwość dokładniejszego oznaczenia ilościowego wybranych związków. Tryb ten stosuje się np. w celu oznaczania zawartości związków alkiloaromatycznych, monitorując kation tropyliowy (m/z = 91). W analizie olejków eterycznych można w ten sposób łatwo odróżnić monoterpeny (134 Da) i seskwiterpeny (204 Da) o terpenoidów (pochodnych węglowodorów).

Rysunek 24: Tryb Scan+SIM – jony trafiające do detektora

2.1 Analiza olejków eterycznych

Olejki eteryczne obecne są w większości roślin i to one odpowiadają za charakterystyczny zapach. Ich synteza w przebiega na drodze oligomeryzacji (w uproszczeniu) odpowiedniej liczby cząstek izoprenu (2-metylobuta-1,3-dienu). Ze względu na obecność w niej dwóch wiązań podwójnych, a także możliwość zajścia szeregu różnych reakcji izomeryzacji i przebiegu oligomeryzacji według różnych mechanizmów, możliwe jest powstanie bardzo dużej liczby produktów o tym samym wzorze sumarycznym. Na poniższym rysunku przedstawiono najczęściej występujące monoterpeny.

Wszystkie te związki charakteryzują się tą samą masą cząsteczkową. Dodatkowo każdy z tych monoterpenów może ulegać dalszym reakcjom, w wyniku których powstają ich pochodne – terpenoidy. W szczególności są to reakcje utleniania do alkoholi, ketonów, kwasów (a z tych z kolei powstawać mogą estry itd.). Produkty tych reakcji będą oczywiście miały inną masę cząsteczkową niż macierzysty monoterpen.

(28)

Rysunek 25: Struktury przykładowych monoterpenów

Jednoczesna rejestracja całkowitego prądu jonowego (TIC – Total Ion Current) i jonów 136 w trybie SIM pozwala na szybkie odróżnienie na chromatogramach pików pochodzących od terpenów i pików pochodzących od terpenoidów. Podobnie jest w przypadku seskwiterpenów (204 Da). Na rysunku 26 przedstawiono graficznie dane rejestrowane przez spektrometr masowy w trakcie elucji poszczególnych składników olejku eterycznego ze skórki limonki.

Rysunek 26: Spektrochromatogram olejku eterycznego limonki

Na osi odciętych zaznaczono czas retencji, czyli czas liczony od momentu wprowadzenia próbki do chromatografu. Na lewej osi rzędnych zaznaczono stosunek m/z jonów powstających w wyniku

(29)

jonizacji opuszczających kolumnę składników. Ciemniejszy kolor oznacza więcej jonów o danym stosunku m/z. W przypadku terpenów widoczne są powtarzające się przy każdym piku te same jony, różnią się one nieznacznie intensywnością. Widoczny jest także obecny przez cały czas analizy jon o m/z = 44 Da (CO2) i pojawiąjący się około 15 min jon 207 – tzw. column bleed.

W dolnej części wykresu przedstawiono chromatogram całkowitego prądu jonowego TIC i nałożony na niego sygnał SIM. W przypadku niektórych związków pikom TIC nie towarzyszą piki SIM – oznacza to, że w tym czasie kolumnę opuszcza związek nie będący terpenem (brak sygnałów o m/z = 136 i 204). Możliwa jest także odwrotna sytuacja – pik na chromatogramie SIM przy braku piku na chromatogramie TIC – oznacza to, że w próbce obecny jest terpen, ale ze względu na niską czułość w trybie scan nie jest on widoczny (ukryty w szumie). W przedstawionym na rysunku przypadku nie jest to widoczne, ponieważ sygnał SIM został nieprawidłowo zarejestrowany (zbyt wysoki próg odcięcia).

2.2 Indeks retencji Kovátsa

Posługując się jedynie widmami masowymi składników tych olejków ich identyfikacja byłaby bardzo trudna, ze względu na to, że po jonizacji ulegają one rozpadowi w niemal jednakowy sposób.

Rysunek 27: Widma masowe przykładowych seskwiterpenów

Na powyższym rysunku przedstawiono trzy przykładowe seskwiterpeny i ich widma masowe.

Widoczne są powtarzające się dla każdego z tych związków charakterystyczne piki. Tak niewielkie różnice w widmach masowych nie pozwalają na jednoznaczną identyfikację. Związki te charakteryzują się jednak różnym czasem retencji w kolumnie chromatograficznej, przez co można je odróżnić od siebie właśnie na tej podstawie.

Czas retencji danego związku związany jest z wieloma czynnikami. Są to między innymi: temperatura, rodzaj fazy stacjonarnej, długość kolumny, natężenie przepływu gazu, grubość fazy stacjonarnej, średnica kolumny.

(30)

Nawet stosując tę samą kolumnę nie zawsze możliwe jest idealne odwzorowanie czasów retencji między różnymi aparatami. Podobnie w przypadku zmiany detektora z MS na FID (w celu wykonania analizy ilościowej) czasy te będą się różnić, ze względu na inną różnicę ciśnień między wlotem a wylotem kolumny, nawet w przypadku zachowania tego samego natężenia przepływu gazu.

Rysunek 28: Wartość ciśnienia wzdłuż kolumny w chromatografie z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym i spektrometrem MS przy stałym natężeniu przepływu gazu nośnego

Te różnice w ciśnieniu mogą powodować znaczne przesuwanie się czasów retencji tego samego związku.

W celu unormowania czasów retencji stosuje się pojęcie indeksu retencji, opracowane przez Kovátsa, w którym czas retencji danego związku odnosi się do czasów retencji wzorców alkanów o rosnącej liczbie atomów węgla w łańcuchu. W takim przypadku dla tej samej fazy stacjonarnej na kolumnie uzyskuje się mniej więcej jednakowe wartości indeksu retencji danego związku, niezależnie od warunków (temperatury, przepływów) w jakich prowadzony jest eksperyment.

Rysunek 29: Zmiany czasów retencji alkanów (Cn) i analitu (x) w układzie GC-MS i GC-FID

Na powyższym rysunku zjawisko przesuwania się czasów retencji przedstawione zostało w formie graficznej. Zauważyć należy, że mimo zmiany bezwzględnej wartości czasu retencji poszczególnych składników, badany związek eluuje w takiej samej ułamkowej odległości między dwoma wzorcami.

(31)

Matematycznie wartość indeksu retencji w analizie izotermicznej zdefiniowana jest w następujący sposób:

𝑅𝐼 = 100 × [𝑛 + log 𝑡𝑟(𝑥) − log 𝑡𝑟(𝑛) log 𝑡𝑟(𝑁) − log 𝑡𝑟(𝑛)]

gdzie t’r oznacza zredukowany czas retencji (pomniejszony o czas martwy) dla odpowiednio:

x – analizowanej substancji, n – węglowodoru o liczbie atomów węgla n eluującego bezpośrednio przed analitem, N – węglowodoru o liczbie atomów węgla n+1, eluującego bezpośrednio za analitem. Na powyższym przykładowym rysunku n = 11, N = 12. Czasy retencji są zlogarytmowane, ze względu na to, iż w warunkach izotermicznych czasy retencji poszczególnych węglowodorów rosną mniej więcej wykładniczo wraz z liczbą atomów węgla w łańcuchu.

W przypadku analizy z programowaną (tj. zmienną w czasie) temperaturą stosuje się uproszczoną formę:

𝑅𝐼 = 100 × [𝑛 +𝑡𝑟(𝑥) − 𝑡𝑟(𝑛) 𝑡𝑟(𝑁) − 𝑡𝑟(𝑛)]

gdzie czasy retencji wstawiane są bezpośrednio (niezredukowane i nielogarytmowane).

Wartości indeksu retencji dla wzorców są z definicji stałe i wynoszą 100 × n, gdzie n jest liczbą atomów węgla (np. RI = 800 dla n-oktanu, 1200 dla n-dodekanu, itd.). Związek, który eluuje między pikami heksanu i heptanu będzie charakteryzował się zatem indeksem retencji zawierającym się między 600 a 700.

Dla wielu grup związków wartości indeksów retencji dla różnych faz stacjonarnych zostały wyznaczone i dostępne są w odpowiednich bazach. Wartości te nie stanową podstawy do identyfikacji związku, ponieważ kilka związków może charakteryzować się taką samą wartością RI. Ponadto uzyskane eksperymentalnie wartości RI nie zawsze (czyt. „prawie nigdy”) będą pokrywały się idealnie z wartościami dostępnymi w bazach (w niektórych przypadkach błąd względny RI może przekraczać kilka %). Zazwyczaj jednak zachowana jest kolejność elucji poszczególnych substancji, zatem jeśli otrzyma się dwa piki, których identyfikacja za pomocą MS jest niejednoznaczna (w wyniku wyszukiwania dla obu pików uzyskuje się dobre dopasowanie dla dwóch różnych związków, np. jak na rys. 27), to posługując się indeksem retencji można określić, w jakiej kolejności opuściły kolumnę, a zatem przypisać im odpowiednie struktury. Tak jak w przypadku terpenów, tak i w przypadku innych, prostszych, izomerów (np. ksylenu) identyfikacja za pomocą MS może być niejednoznaczna, natomiast za pomocą RI można określić, który pik odpowiada któremu izomerowi.

(32)

2.3 Problemy z analizą GC-MS

Jak już wspomniano wyżej, aparatura GC-MS ma pewne ograniczenia co do tego, co i jak można analizować. To nie „magiczna czarna skrzynka”, przedstawiana czasem w filmach jako narzędzie pozwalające na określenie długości zarostu właściciela samochodu na podstawie próbki lakieru pozostawionego po stłuczce. Często nie jest nawet możliwe ustalenie pełnego składu mieszaniny prostych substancji. Podstawowym ograniczeniem jest możliwość analizy jedynie lotnych substancji, czyli takich, które da się przeprowadzić do fazy gazowej.

Szczególnym przypadkiem jest tu analiza polimerów, które mimo tego, że zazwyczaj lotne nie są, to możliwe jest przeprowadzenie ich termicznego rozkładu i analiza powstałych produktów depolimeryzacji. Takie analizy wykonuje się często w celu określenia szybkości i sposobu starzenia się tworzyw w wyniku działania czynników środowiskowych.

2.3.1 Składniki nielotne

Do chromatografu można również wprowadzać próbki zawierające składniki nielotne, ale składników tych nie da się analizować. Dotyczy to ogólnie techniki GC, nie tylko GC-MS. Pozostaną one nieodparowane w dozowniku. Z tym może wiązać się szereg problemów. Jeśli są to substancje organiczne, to z czasem mogą one ulegać rozkładowi z wydzieleniem małocząsteczkowych (lotnych) produktów, które widoczne będą w kolejnych analizach. Związki trwałe termicznie (np. sole metali) pozostając w dozowniku mogą mieć działanie katalityczne i powodować np. rozkład wprowadzanych do chromatografu substancji. W wyniku nagromadzenia substancji stałych w dozowniku może zachodzić na nich adsorpcja analitu, co powodować będzie pojawianie się charakterystycznych

„ogonów” w pikach analizowanych substancji.

2.3.2 Analiza ilościowa

Analiza wykonana za pomocą GC-MS bardzo rzadko ma charakter ilościowy. Istotną przeszkodą jest tutaj duża zależność czułości od parametrów procesu jonizacji, pracy analizatora i starzenia się detektora. Analizy ilościowe wykonywane są zasadniczo dwiema metodami:

 Oznaczanie w trybie SIM na podstawie krzywej kalibracyjnej (kalibrację trzeba często powtarzać)

 Oznaczanie za pomocą dodatku wzorca izotopowego – do próbki dodaje się znaną ilość oznaczanej substancji znakowaną wzorcem, w przypadku związków zawierających atomy tlenu często używa się wzorców zawierających atomy 18O. Tego typu oznaczenia często wykorzystywane są w badaniach przyswajania, metabolizmu i wydalania substancji biologicznie czynnych. Ze względu na obecność analitu i wzorca w jednej próbce znacząco zmniejsza się wrażliwość na warunki eksperymentu, a zawartość analitu oblicza się na podstawie stosunku intensywności jednego z jego pików do intensywności piku wzorca.

Ze względu na różną zdolność do jonizacji niektórych substancji próby identyfikacji pików w chromatogramach uzyskanych za pomocą innego detektora (np. FID) na podstawie chromatogramów uzyskanych z GC-MS mogą zakończyć się niepowodzeniem. Np. w sytuacji, gdy na chromatogramie MS obserwuje się kolejno 3 małe piki a potem czwarty duży pik analitu, może zdarzyć się tak, że na chromatogramie z FID obecne będą dwa duże piki i jeden mały, a dodatkowo piki te będą miały znacznie różniące się czasy retencji. Dziać się tak może, ponieważ FID jest nieczuły na jeden z

(33)

analizowanych związków, a na pozostałe charakteryzuje się inną czułością niż MS. Niemożliwe jest w takim wypadku stwierdzenie, który pik z FID pochodzi od analitu. Zdolność do jonizacji można stosunkowo łatwo mierzyć i obserwować. Jeśli przykładowo sporządzi się mieszaninę składającą się z równych ilości dwóch różnych związków, to może zdarzyć się tak, że stosunek pól powierzchni pików z GC-MS będzie w przybliżeniu wynosił nie 1:1, jak często ma to miejsce w przypadku FID, a na przykład 20:1.

2.3.3 Szczelność połączeń

Ważne jest ponadto zachowanie szczelności wszystkich połączeń w układzie. Zwłaszcza od strony spektrometru masowego, gdzie panuje podciśnienie, które może prowadzić do zasysania do wnętrza spektrometru powietrza, a wraz z nim innych zanieczyszczeń.

Konieczne jest także stosowanie odpowiednich do spektrometrii mas kolumn chromatograficznych.

Kolumny te różnią się od standardowych kolumn tym, że faza stacjonarna jest zwykle mocniej związana, przez co ogranicza się jej przenikanie do spektrometru (tzw. column bleed). Kolumny te mogą zazwyczaj pracować w niższej maksymalnej temperaturze niż zwykłe kolumny GC.

Rysunek 30: Spektrochromatogram uzyskany za pomocą nieszczelnego spektrometru

Na powyższym rysunku przedstawiono spektrochromatogram uzyskany za pomocą nieszczelnego spektrometru. Na osi odciętych numer skanu (czas retencji), na osi rzędnych stosunek m/z poszczególnych jonów. Ciemniejszy kolor odpowiada większemu natężeniu sygnału o danym m/z.

Widoczne są tutaj charakterystyczne jony o m/z = 18, 28, 32 i 44, czyli odpowiednio: woda, azot, tlen i dwutlenek węgla. Występowanie piku o m/z = 18 świadczy o obecności wody w układzie spektrometru, jednakże zazwyczaj nie jest to para wodna z powietrza, która przedostaje się do wnętrza przez nieszczelności, lecz woda zaadsorbowana na ściankach wewnątrz komory spektrometru, która w trakcie pracy ulega powolnej desorpcji. Pik ten obserwuje się często tuż po uruchomieniu (odpompowaniu) spektrometru, który nie był długo używany.

m/z

numer skanu

Cytaty

Powiązane dokumenty

puszka Faradaya, stanowiąca długą cylindryczną komorę (puszkę) – Rys. Jony, które wnikają do jej wnętrza przez niewielki otwór, przechodzą do dna i

2. Na zasadzie odstępstwa od art. 2, właściwe organy Państw Członkowskich, wymienione w załączniku II, mogą zezwolić na uwolnienie lub udostępnienie niektórych

Profesor Krzysztof Simon, kierownik Kliniki Chorób Zakaźnych i Hepatologii Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu, przyznaje, że młodzi ludzie w stolicy województwa

Podać wynik w postaci konkretnej liczby, zapisanej za pomocą kolejnych cyfr, nie zaś iloczynu,..

Twierdzenie, że wiersz Friedricha Schillera Do radości jest hymnem Unii Europejskiej lub że Schiller jest autorem tekstu koja- rzonego z hymnem Europy, jest nieporozumieniem. Hymn

zmieniające rozporządzenie (WE) nr 27/2005 w zakresie możliwości połowowych na wodach Grenlandii, Wysp Owczych i Islandii oraz połowów dorsza w Morzu Północnym, a także

(30) Mając na uwadze ograniczony wpływ cła na koszt wytwarzania stopów aluminium w UE-10 oraz istnienie innych źródeł podaży w odniesieniu do UE-10, stwierdzono, iż

Tolerancja jest logicznym następstwem przyjętego stanowiska normatywnego, jeśli to stanowisko obejmuje jedno z poniższych przekonań: (1) co najmniej dwa systemy wartości