Adres do korespodencji: dr med. Mariola Pawlaczyk, Katedra i Klinika Dermatologii AM, ul. Przybyszewskiego 49, 60-355 Poznañ, e-mail: m_p@go2.pl
iim mm mu un no oh hiis stto oc ch he em miic cz zn ny yc ch h
ii tte ec ch hn niik k b biio ollo og giiii m mo olle ek ku ulla arrn ne ejj w
w d diia ag gn no os stty yc ce e z ziia arrn niin niia ak ka a g grrz zy yb biia as stte eg go o
T
Th he e u us se e o off iim mm mu un no oh hiis stto oc ch he em miis sttrry y a an nd d m mo olle ec cu ulla arr b
biio ollo og gy y tte ec ch hn niiq qu ue es s iin n tth he e d diia ag gn no os siis s o off m my yc co os siis s ffu un ng go oiid de es s
MARIOLA PAWLACZYK
1, ELŻBIETA PORĘBA
2, VIOLETTA FILAS
3, TAMARA BANASIAK
3, LUCYNA KRAMER
4, JAN BRĘBOROWICZ
3, ANNA GOŹDZICKA-JÓZEFIAK
21Katedra i Klinika Dermatologii AM im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu, kierownik Katedry i Kliniki prof. dr hab. med.
Wojciech Silny; 2Zakład Wirusologii Molekularnej Instytutu Biotechnologii UAM, kierownik Zakładu prof. dr hab. Anna Goździcka-Józefiak; 3Katedra Onkologii AM im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu, kierownik Katedry prof. dr hab. med.
Jan Bręborowicz; 4Katedra i Zakład Informatyki i Statystyki AM im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu, kierownik Katedry i Zakładu prof. dr hab. Jerzy Moczko
Abstract
Mycosis fungoides (MF) is the most common primary cutaneous T-cell lymphoma which may be difficult to dia- gnose at the early stage. The aim of the study was to evalu- ate the usefulness of immunohistochemical examinations and T-cell receptor γgene (TCRγ) rearrangement analysis in the diagnosis of MF. Immunohistochemical reactions were per- formed with antibodies to CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 and CD20 cell markers of skin infiltrates. TCRγrearrange- ments were detected using the method of polymerase chain reaction with the subsequent separation of products by tem- perature gradient gel electrophoresis. The studied group consisted of 49 patients with MF and 25 patients with in- flammatory dermatoses. In the majority of MF skin infiltra- tes cells expressed the immunophenotype: CD2+, CD3+, CD4+, CD5+, CD7-, CD8- and CD20- did not vary signi- ficantly from phenotypes observed in chronic inflammatory dermatoses. Dominant clones with TCRγrearrangement we- re detected in 85% of MF skin biopsies and in 63% of MF peripheral blood cells whereas in the control group in 11%
and 14% of cases, respectively. Statistically significant dif- ferences were found in the occurrence of clonal T-cells in skin infiltrates between patients with MF and the control group. A statistical analysis of TCRγrearrangement in pe-
Streszczenie
Ziarniniak grzybiasty (MF) jest najczêœciej wystêpuj¹cym pierwotnym ch³oniakiem skóry T-komórkowym, który w po- cz¹tkowym okresie choroby czêsto sprawia trudnoœci diagno- styczne. Celem pracy by³a ocena przydatnoœci badañ immu- nohistochemicznych oraz rearan¿acji genu γreceptora limfo- cytów T (TCRγ) w diagnostyce ziarniniaka grzybiastego (MF).
Reakcje immunohistochemiczne prowadzono z przeciwcia³a- mi przeciw markerom CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD20 komórek nacieków skórnych. Do analizy rearan¿acji TCRγzastosowano metodê PCR z elektroforetycznym rozdzia-
³em heterodupleksów w ¿elu, w gradiencie temperaturowym.
Badaniami objêto 49 chorych na MF w ró¿nych stadiach oraz 25 chorych z dermatozami zapalnymi. W wiêkszoœci nacieków skórnych MF na komórkach stwierdzano immunofenotyp CD2+, CD3+, CD4+, CD5+, CD7-, CD8-, CD20-, podobny do wystêpuj¹cego w przewlek³ych zapalnych chorobach skó- ry. Dominuj¹ce klony z rearan¿acj¹ TCRγwykryto w wycin- kach skórnych u 85%, a w komórkach krwi obwodowej u 63%
ogó³u chorych z MF, podczas gdy w grupie kontrolnej odpo- wiednio u 11 i 14% chorych. Stwierdzono statystycznie istot- ne ró¿nice w porównaniu wystêpowania klonów limfocytów T w naciekach skórnych u chorych z MF w stosunku do cho- rych z grupy kontrolnej. Analiza statystyczna wyników rearan-
Wstęp
W przebiegu klinicznym ziarniniaka grzybiastego (myco- sis fungoides, MF), najczêœciej wystêpuj¹cego nowotworu z grupy pierwotnych ch³oniaków skórnych T-komórkowych, wyró¿nia siê 3 nastêpuj¹ce kolejno po sobie stadia rozwojo- we: rumieniowe, naciekowe i guzowate [1, 2]. W ka¿dym okre- sie MF dojœæ mo¿e do erytrodermii, co pogarsza rokowanie [2, 3]. Prawid³owe rozpoznanie wczesnego stadium choroby sprawia trudnoœci diagnostyczne klinicystom i histopatologom ze wzglêdu na podobieñstwo obrazu klinicznego oraz histopa- tologicznego zmian skórnych do dermatoz zapalnych o prze- wlek³ym przebiegu, takich jak wyprysk, ³uszczyca, przy³usz- czyca plackowata [2, 4, 5]. Erytrodermiê w przebiegu MF trud- no jest zró¿nicowaæ z erytrodermi¹ innego pochodzenia [3, 6, 7], dlatego chorym podejrzanym o MF czêsto wielokrotnie po- biera siê wycinki skórne do badañ [2, 7].
W diagnostyce pierwotnych ch³oniaków skóry obok ba- dañ histopatologicznych zmian skórnych, wykorzystuje siê ba- dania immunohistochemiczne, wykrywaj¹ce markery po- wierzchniowe komórek nacieków [8, 9], a w ostatnich latach coraz szerzej stosuje siê techniki biologii molekularnej [10–12].
W procesie dojrzewania prawid³owe limfocyty T przecho- dz¹ rearan¿acje regionów zmiennych, ³¹cz¹cych i sta³ych w ob- rêbie genów receptora limfocytów T (T cell receptor, TCR), w wyniku czego ka¿d¹ komórkê charakteryzuj¹ okreœlone cz¹stki powierzchniowe, a wszystkie komórki siostrzane wy- wodz¹ce siê z dojrza³ych limfocytów T wykazuj¹ ekspresjê tych samych TCR. W procesach nowotworzenia zwi¹zanych z monoklonaln¹ proliferacj¹ limfocytów T, do których zalicza siê MF, liczba jednakowych komórek bêdzie wiêc wzrastaæ do poziomu daj¹cego siê wykryæ technikami molekularnymi [11–15].
Celem pracy by³a ocena przydatnoœci badañ immunohi- stochemicznych markerów powierzchniowych komórek na- cieków skórnych oraz analizy rearan¿acji genu γTCR w dia- gnostyce ziarniniaka grzybiastego.
Materiał i metody
Badaniami objêto materia³ pochodz¹cy od 49 chorych na MF, w wieku od 34 do 82 lat, leczonych w Klinice Dermatolo- gii AM w Poznaniu, b¹dŸ diagnozowanych w Katedrze Onko- ripheral blood cells did not reveal any differences only in
patients with the MF in the early stage (IA) when compared with inflammatory dermatoses. Detection of TCRγrearran- gement is a valid supplement to histopathologic and immu- nohistochemical examination in cases of suspected MF ho- wever the diagnosis should always be based on the analysis of examinations and clinical status of patients.
Key words: mycosis fungoides, immunonohistochemical diagnosis, monoclonality.
¿acji TCRγw komórkach krwi obwodowej nie wykaza³a istot- nych ró¿nic tylko w stadium pocz¹tkowym (IA) MF w porów- naniu z dermatozami ³agodnymi. W przypadkach podejrzenia MF, wykrycie rearan¿acji genu TCRγstanowi cenne uzupe³- nienie diagnostyki histopatologicznej i immunohistochemicz- nej, jednak rozpoznanie powinno byæ zawsze stawiane na pod- stawie ca³oœciowej oceny badañ i stanu klinicznego chorych.
S³owa kluczowe: ziarniniak grzybiasty, diagnostyka im- munohistochemiczna, monoklonalnoœæ.
(PDiA 2003; XX, 2: 73–79)
Tab. 1. Stadium zaawansowania ziarniniaka grzybiastego wg klasyfikacji TNM*
Stadium T (tumor) N (lymph node) M (metastasis)
IA rumienie i nacieki <10% brak lymphadenopatii brak
powierzchni skóry (T1) lub zmiany odczynowe w wêz³ach
IB rumienie i nacieki >10% brak lymphadenopatii brak
powierzchni skóry (T 2) lub zmiany odczynowe w wêz³ach
IIA rumienie i nacieki lymphadenopatia ze zmianami brak
odczynowymi w wêz³ach ch³onnych
IIB guzy >1 (T3) brak lymphadenopatii lub zmiany brak
odczynowe w wêz³ach
III erytrodermia (T4) lymphadenopatia ze zmianami brak
odczynowymi w wêz³ach ch³onnych
IVA T1, T2, T3 lub T4 nacieki nowotworowe brak
w wêz³ach ch³onnych
IVB T1, T2, T3 lub T4 zmiany odczynowe zajêcie narz¹dów
lub nowotworowe w wêz³ach ch³onnych wewnêtrznych
*Podzia³ przyjêty przez Miêdzynarodow¹ Konferencjê okreœlaj¹c¹ zasady leczenia ch³oniaków skóry [16]
logii AM w Poznaniu, w latach 1994–2002. Stadium MF ocenia- no wg klasyfikacji TNM, przedstawionej w tab. 1. [16]. Do grup kontrolnych w³¹czono 15 chorych na przewlek³y, rozsiany wy- prysk kontaktowy niealergiczny, 10 chorych na ³uszczycê oraz 10 chorych na przy³uszczycê plackowat¹ drobnoogniskow¹. Ma- teria³ pobierany by³ przed wdro¿eniem leczenia i obejmowa³ wy- cinki skórne oraz u czêœci chorych krew obwodow¹. We wszyst- kich przypadkach rozpoznania potwierdzane by³y rutynowymi badaniami laboratoryjnymi z uwzglêdnieniem szczegó³owej oce- ny rozmazu krwi obwodowej, badaniem radiologicznym klatki piersiowej oraz ultrasonograficznym jamy brzusznej, ocen¹ hi- stopatologiczn¹ i immunohistochemiczn¹ wycinków skórnych oraz wêz³ów ch³onnych w przypadku ich powiêkszenia. Bada- nia immunohistochemiczne markerów powierzchniowych CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD20 na komórkach nacieków skórnych wykonywano w skrawkach parafinowych i kriostato- wych, z zastosowaniem przeciwcia³ monoklonalnych firmy Da- ko i Novocastra oraz metody immnuohistochemicznej z kom- pleksem EnVision + HPR. Reakcje immunohistochemiczne uzna- wano za dodatnie, je¿eli barwi³o siê co najmniej 50% komórek jednoj¹drzastych nacieku. Oceny histopatologicznej i immuno- histochemicznej dokonywa³y niezale¿nie, dwie ró¿ne osoby.
Analizê rearan¿acji genu γTCR przeprowadzono w wycin- kach skórnych i krwi obwodowej, stosuj¹c metodê PCR (poly- merase chain reaction, PCR), z elektroforetycznym rozdzia³em heterodupleksów w ¿elu, w gradiencie temperaturowym (HD-TGGE, heteroduplex temperature gradient gel electropho- resis). Do izolacji genomowego DNA z wycinków skórnych skrawano 10 skrawków po 10 µm ka¿dy. W celu odparafino- wania materia³ poddawano dzia³aniu ksylenu, a po odwirowaniu i przep³ukaniu etanolem trawiono proteinaz¹ K [17]. Do izolacji genomowego DNA z komórek nacieków skórnych i krwi obwo- dowej wykorzystano zestawy firmy QIAGEN; odpowiednio QIAamp DNA Mini Kit oraz QIAamp DNA Blood Kit. Jakoœæ DNA w próbkach sprawdzano technik¹ PCR z u¿yciem starte- rów specyficznych dla fragmentu genu ludzkiej β-globiny. Re- akcje amplifikacji fragmentów TCRγprowadzono ze starterami komplementarnymi do regionów V1-8 lub V9 oraz J1-2 TCRγ zestawionymi w tab. 2. [18]. Mieszaniny reakcyjne o objêtoœci koñcowej 20 µl zawiera³y: 50 ng DNA genomowego, 1 x stê¿o- ny bufor PCR, 200 µM ka¿dego dNTP, 1µM ka¿dego z dwóch oligonukleotydów, 1U/25 µl Taq DNA polimerazy. Reakcjê pro- wadzono, stosuj¹c nastêpuj¹ce profile termiczne: denaturacja
w 9 4oC przez min, przy³¹czanie starterów w 55oC przez 1,5 min, polimeryzacjê w 70oC przez 1,5 min. W pierwszej rundzie am- plifikacji stosowano pary starterów zewnêtrznych V1-8γi Jγ 1/2 albo Vγ9 i Jγ1/2. Nastêpnie otrzymane produkty u¿ywa- no jako matrycê w kolejnej rundzie amplifikacji, w której wy- korzystywano odpowiednio startery komplementarne do we- wnêtrznych sekwencji genów Vγ1-8 i Jγ1/2 albo Vγ9 i Jγ 1/2.
Po pierwszej rundzie amplifikacji rejonu Vγ 1-8 i Jγ1/2 otrzy- mywano produkty o wielkoœci ok. 480 par zasad, a po drugiej 420 par zasad. Amplifikowane fragmenty rejonu Vγ9 i Jγ 1/2 wynosi³y odpowiednio 400 i 380 par zasad. Do oceny rearan-
¿acji jako kontrolê negatywn¹ stosowano DNA wyizolowany z krwi osób zdrowych, a jako kontrole pozytywne DNA wyizo- lowany z komórek Jurkat (rearan¿acje w rejonie V1-8γ) oraz DNA wyizolowany z krwi obwodowej chorego na ostr¹ bia-
³aczkê limfatyczn¹ T-komórkow¹ γδ+ (rearan¿acje w rejonie Vγ9). Wszystkie reakcje PCR przeprowadzono w aparacie UNO II firmy Biometra. Otrzymane produkty rozdzielano w 2% ¿e- lu agarozowym, zawieraj¹cym bromek etydyny, w celu spraw- dzenia efektu amplifikacji. Produkty otrzymane w reakcji am- plifikacji denaturowano w 95oC przez 5 min, a nastêpnie rena- turowano w 55oC przez 20 min w celu uzyskania heterodupleksów. Rozdzia³ elektroforetyczny prób prowadzo- no w 8% ¿elu poliakryloamidowym zawieraj¹cym 7M mocz- nik, w gradiencie temperatury (35–55oC) przez 3 godz. przy na- piêciu 450 V, z u¿yciem aparatu TGGE Maxi firmy Biometra.
Po zakoñczeniu elektroforezy ¿ele barwiono srebrem, stosuj¹c zestaw Silver Stain, firmy Kucharczyk i fotografowano.
Analizê statystyczn¹ wyników przeprowadzono przy po- mocy testu dok³adnego Fishera (p=0,05). Dla porównanina wy- ników monoklonalnoœci w poszczególnych grupach zastoso- wano test Manna-Whitthney’a, przyjmuj¹c dla wycinków skór- nych p=0,0027, a dla krwi obwodowej p=0,0216.
Wyniki
W badaniach przeanalizowano 53 wycinki skórne pocho- dz¹ce od chorych na MF w ró¿nych stadiach choroby i wycin- ki od wszystkich chorych z grupy kontrolnej oraz krew obwo- dow¹ od 40 chorych na MF i wszystkich z grupy kontrolnej.
Wiêkszoœæ limfocytów w naciekach skórnych MF wyka- zywa³a fenotyp CD2+ CD3+ CD4+ CD8- (fot. 1. i 2.), za wy- j¹tkiem 4 przypadków w stadium IIB i 2 w stadium IVA MF, Tab. 2. Startery stosowane do amplifikacji fragmentów receptora γγlimfocytów T
Runda PCR Starter Vγγ(5'-3') Starter Jγγ(5'-3')
I Vγ1-8 zewnêtrzny
GGAGCTTCTAGCTTTCCTGTCTC
lub Jγzewnêtrzny
Vγ9 zewnêtrzny CGTCGACAACAAGTGTTGTTCCAC
GGAATTCCAAATTCTTGGTTTA
II Vγ1-8 wewnêtrzny
CTCGAGTGCGCTGCCTACAGAGAGG
lub Jγwewnêtrzny
Vγ9 wewnêtrzny GGATCCACTGCCAAAGAGTTTCTT
CTCGAGTGCGCTGCCTACAGAGAG
z ekspresj¹ CD8+ CD4-. Os³abion¹ ekspresjê CD5 obserwo- wano u 7 chorych (stadia IIA, IIB, III, IVA), a CD3 u 4 cho- rych w stadium IIB, III, IVA. W nielicznych przypadkach (dwóch w stadium IA, dwóch w stadium IB i jednym w sta- dium IIA) w naciekach MF stwierdzono ekspresjê CD7+. Tyl- ko pojedyncze komórki nacieków nowotworowych MF wyka- zywa³y reakcjê z przeciwcia³em CD 20. W grupie kontrolnej w wiêkszoœci stwierdzano immunofenotyp komórek nacieków skórnych: CD2+ CD3+ CD4+ CD5+ CD7- CD8-, z wyj¹tkiem 3 przypadków przewlek³ego wyprysku i 3 przypadków przy-
³uszczycy plackowatej, w których wystêpowa³a ekspresja CD7+. Analiza statystyczna ekspresji CD7+ nie wykaza³a istot-
nych ró¿nic miêdzy grup¹ MF a grup¹ kontroln¹.
Wyniki analizy rearan¿acji genu γTCR zestawiono w tab. 3. Próby uznawano za monoklonalne, jeœli w smudze DNA na ¿e- lu widoczny by³ pojedynczy pr¹¿ek (fot.
3.). Dominuj¹ce klony z rearan¿acj¹ TCRγ stwierdzono w naciekach skórnych u 79%, a w komórkach krwi obwodowej u 63%
ogó³u chorych z MF. Monoklonalnoœæ wy- stêpowa³a we wszystkich próbkach cho- rych w stadium IVA. W stadium IIB re- aran¿acje wystêpowa³y u 90% chorych w limfocytach nacieków skórnych oraz u 78% we krwi obwodowej. Porównywal- ny odsetek rearan¿acji stwierdzono w sta- diach IIA i III, zarówno w wycinkach, jak i komórkach krwi obwodowej. W pocz¹t- kowym stadium IA MF rearan¿acje stwier- dzono u 75% chorych w wycinkach skór- nych, ale tylko w 37,5% w komórkach krwi obwodowej. W trzech przypadkach przewlek³ego wyprysku i u jednego cho- rego z przy³uszczyc¹ plackowat¹ wykryto dominuj¹ce klony w wycinkach skórnych.
Analiza rearan¿acji TCRγwe krwi obwo- dowej u chorych z grupy kontrolnej da³a dodatnie wyniki u 2 chorych na wyprysk oraz u 3 z 10 chorych na przy³uszczycê plackowat¹.
Stwierdzono statystycznie istotne ró¿- nice w porównaniu wystêpowania klo- nów limfocytów T w naciekach skórnych u chorych z MF w stosunku do chorych z grup kontrolnych. Analiza statystyczna wyników rearan¿acji TCRγw komórkach krwi obwodowej nie wykaza³a istotnych ró¿nic tylko w stadium IA.
Omówienie
Poszukiwania nowych metod diagno- stycznych gwarantuj¹cych prawid³owe rozpoznanie pierwotnych ch³oniaków skó- ry w pocz¹tkowym okresie choroby, kon- centrowa³y siê przez wiele lat na bada- niach immunohistochemicznych i genetycznych. Oznaczanie immunofenotypów komórek nowotworowych nacieków skór- nych stanowi podstawy obowi¹zuj¹cych aktualnie klasyfikacji pierwotnych ch³oniaków skóry [7]. Przedstawione przez nas ba- dania immunohistochemiczne wykaza³y utratê niektórych mar- kerów powierzchniowych na limfocytach T w naciekach skór- nych w stadiach zaawansowanych MF, co przemawia za proce- sem z³oœliwym, jednak w pocz¹tkowym okresie choroby antygeny powierzchniowe wykazywa³y podobn¹ ekspresjê w MF i przewlek³ych, zapalnych chorobach skóry, co potwierdzaj¹ tak-
¿e liczne doniesienia innych autorów [5, 7–9, 20–22]. W wiêk- szoœci przypadków na komórkach nacieków MF nie stwierdza- Fot. 1. Dodatnia reakcja z przeciwcia³em anty-CD4 w nacieku skórnym u cho-
rego w stadium IIA ziarniniaka grzybiastego (pow. 400 razy)
Fot. 2. Ujemna reakcja z przeciwcia³em anty-CD8 w nacieku skórnym u chore- go w stadium IIA ziarniniaka grzybiastego (pow. 400 razy)
no dodatnich reakcji z przeciwcia³em an- ty-CD7, ale podobny immunofenotyp cha- rakteryzowa³ grupê kontroln¹. Zwiêksze- nie liczby pacjentów grupy kontrolnej mo- g³oby wp³yn¹æ na wykazanie istotnych ró¿nic dyskryminuj¹cych nacieki MF od dermatoz zapalnych, jak przedstawi³ to Bergman i wsp. [23]. W swojej pracy obejmuj¹cej wiêksz¹ liczbê chorych auto- rzy wykazali istotne ró¿nice w ekspresji CD7, pozwalaj¹ce na ró¿nicowanie przy- padków MF od zapalnych chorób skóry [23]. Obserwacji Bergmana i wsp. nie po- twierdzaj¹ jednak inne badania. Wydaje siê, ¿e ujemna reakcja z przeciwcia³em an- ty-CD7 w sytuacjach w¹tpliwych nie prze- s¹dza o nowotworowym charakterze na- cieku skórnego [5, 9, 12, 19, 20].
Od momentu wprowadzenia do dia- gnostyki pierwotnych ch³oniaków skóry technik biologii molekularnej, monoklo- nalnoœæ wykrywano pocz¹tkowo opiera- j¹c siê na technice Southern blot, jednak liczba komórek T w naciekach we wcze- snych okresach MF mo¿e okazaæ siê nie- wystarczaj¹ca do wykazania dominuj¹ce-
go klonu t¹ metod¹ [18]. Czu³oœæ badañ wzros³a po wprowa- dzeniu do analizy monoklonalnoœci techniki PCR. Limfocyty T mog¹ prezentowaæ 2 rodzaje ³añcuchów αβiγδ, co sprawia,
¿e w badaniach diagnostycznych wykorzystywaæ mo¿na rearan-
¿acje w obrêbie czterech genów. Wiêkszoœæ skórnych limfocy- tów T wykazuje ekspresjê αβTCR. Amplifikacja tych ³añcu- chów jest jednak doœæ trudna z uwagi na du¿¹ liczbê segmen- tów zmiennych, st¹d w celu wykrycia klonalnoœci wykorzystu- Fot 3. Produkty amplifikacji TCRγγ1-8 rozdzielone metod¹ elektroforezy w ¿e- lu w gradiencie temperatury. Linie 7, 14, 15, 16, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 – produkty poliklonalne; linie – 5, 6, 8, 10, 11 produkty monoklonalne; linie – 1, 9, 12, 13 produkty biklonalne; linia – 2, 3, 4 produkty oligoklonalne. 17 marker masy pUC19/MspI. Linia 18 – kontrola dodatnia (DNA izolowany z komórek Jurkat)
Tab. 3. Wyniki analizy rearan¿acji genu γγreceptora limfocytów T w wycinkach skórnych i krwi obwodowej u chorych na ziarniniaka grzybiastego i w grupach kontrolnych
Rozpoznanie Wycinki skórne Krew obwodowa
N/nPCR+ (%) N/nPCR+ (%)
stadium MF
IA 8/6 75% 8/3 37,5%
IB 12/8 67% 9/5 55,5%
IIA 10/8 89% 10/7 70%
IIB 10/9 90% 9/7 78%
III 10/8 80% 5/3 60%
IVA 3/3 100% 2/2 100%
razem 53/42 79% 43/27 63%
grupa kontrolna
wyprysk 15/3 20% 5/2 13%
³uszczyca 10/0 0% 110/0 0 %
przy³uszczyca 10/1 10% 10/3 30%
razem 35/4 11% 35 /5 14%
N: liczba chorych
N PCR+: liczba chorych ze stwierdzon¹ monoklonalnoœci¹
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
je siê czêœciej amplifikacjê ³añcucha γTCR. W prezentowanej pracy zastosowano technikê PCR opracowan¹ przez Wooda i wsp. [18], skojarzon¹ z czu³¹ metod¹ elektroforetycznego roz- dzia³u uzyskanych produktów amplifikacji w ¿elu w gradien- cie temperatury [24–26]. Uzyskane przez nas wyniki wykry- wania monoklonalnoœci w naciekach skórnych s¹ podobne do przedstawionych przez innych autorów [18, 27–29]. Bergman i wsp. wykazali rearan¿acje klonalne TCRγw naciekach skór- nych u 69% chorych z klasycznym MF [23], a Dadej w 88%
[30]. Nieznacznie ni¿szy odsetek rearan¿cji stwierdzono w sta- dium IA MF (37,5%) w komórkach krwi obwodowej w porów- naniu z doniesieniami Muche i wsp. [24], którzy w tym stadium MF wykryli rearan¿acje u 46,2% chorych. Z punktu widzenia klinicznego i patologicznego MF, zgodnie z definicj¹ pierwot- nych ch³oniaków skórnych T-komórkowych, rozwija siê w skó- rze i przez 6 mies. od pocz¹tku choroby nie powinien dawaæ przerzutów do wêz³ów ch³onnych czy narz¹dów wewnêtrznych [6, 7]. Badania z wykorzystaniem technik biologii molekular- nej wskazuj¹ na mo¿liwoœæ pozaskórnego rozsiewu nowotwo- rowych limfocytów T ju¿ we wczesnym okresie choroby, o czym œwiadczy wystêpowanie klonów komórek T we krwi obwodowej w stadiach IA i IB MF.
Ciekawe wydaje siê wykrycie rearan¿acji w komórkach krwi obwodowej chorych z przy³uszczyc¹ plackowat¹ drobno- ogniskow¹. Dermatoza ta od kilku lat stanowi przedmiot kon- trowersji wœród dermatologów; przez jednych uwa¿ana jest za prekursora MF, inni zaœ traktuj¹ przy³uszczycê plackowat¹ w odmianie wieloogniskowej jako stadium rumieniowe MF [31]. Muche i wsp. wykazali wysoki odsetek klonów limfocy- tów T we krwi obwodowej chorych na przy³uszczycê placko- wat¹ drobnoogniskow¹, przy braku tych klonów w naciekach skórnych. Autorzy t³umacz¹ ten fakt mo¿liwoœci¹ wystêpowa- nia miejscowej odpowiedzi immunologicznej skutecznie redu- kuj¹cej nacieki klonalne w skórze [25].
Czêstoœæ wykrywania klonów komórkowych w badanym materiale zale¿y od kilku czynników: warunków technicznych, w tym sposobu ekstrakcji DNA, rodzaju zastosowanych star- terów i techniki rozdzia³u produktów amplifikacji, badanego materia³u oraz interpretacja wyników [11, 15, 18, 24, 26, 27, 30]. Rearan¿acje wykrywa siê czêœciej w œwie¿ych mro¿onych wycinkach ni¿ w skrawkach parafinowych [18, 22, 30]. Z dru- giej strony stosowanie materia³u zatopionego w parafinie upraszcza procedury diagnostyczne i pozwala na retrospektyw- n¹ ocenê materia³u. Zwiêkszanie czu³oœci stosowanych tech- nik mo¿e jednak doprowadziæ do wykrywania pojedynczych klonów reaktywnych limfocytów w zmianach skórnych w prze- biegu zmian zapalnych skóry [11, 30, 32]. Potwierdzaj¹ to wy- kryte przez nas rearan¿acje w komórkach nacieków u chorych na wyprysk.
Monoklonalnoœæ nie zawsze musi byæ jednoznaczna z roz- rostem z³oœliwym. Z drugiej strony, badania prowadzone przez Asthony-Key’a i wsp. [22] i Bergmana i wsp. [23] udowodni-
³y, ¿e dermatozy z pogranicza MF, w których wystêpowa³y klo- nalne rearan¿acje komórek T mimo braku w momencie usta- lania rozpoznania kryteriów klinicznych i histopatologicznych odpowiadaj¹cych MF, po pewnym czasie uleg³y transformacji w MF. Chorzy z tzw. klonalnym zapaleniem skóry (clonal der- matitis) powinni wiêc byæ objêci obserwacjami klinicznymi
i histopatologicznym z uwagi na mo¿liwoœæ rozwoju CTCL [22, 23, 30, 33].
W œwietle prezentowanych wyników w³asnych oraz licz- nych doniesieñ innych autorów okazuje siê, i¿ analiza klonalno- œci dostarcza cennych dodatkowych informacji potwierdzaj¹- cych rozrost nowotworowy [10, 12, 18, 23, 24, 27, 30]. Nie mo¿- na jednak wyników tego badania traktowaæ jako odrêbnego kryterium diagnostycznego, a jedynie jako badanie uzupe³nia- j¹ce diagnostykê histopatologiczn¹, immunohistochemiczn¹ i ca-
³oœciow¹ analizê stanu klinicznego pacjenta [6, 7, 30, 32–34).
Wnioski
1. Badania immunohistochemiczne z u¿yciem przeciwcia³ przeciw antygenom powierzchniowym: CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD20 komórek nacieków skórnych nie pozwalaj¹ na ró¿nicowanie pocz¹tkowego okresu ziarni- niaka grzybiastego z przewlek³ymi, zapalnymi choroba- mi skóry.
2. Analiza monoklonalnoœci na podstawie badania rearan¿a- cji genu γTCR dostarcza istotnych danych potwierdzaj¹- cych nowotworowy charakter dermatoz.
3. Rozpoznanie ziarniniaka grzybiastego powinno byæ zawsze stawiane na podstawie ca³oœciowej oceny badañ histopa- tologicznych, immnunohistochemicznych, analizy mono- klonalnoœci oraz stanu klinicznego chorych.
Piœmiennictwo
1. Diamandidou E, Cohen PR, Kurzrock M: Mycosis fungoides and Sezary syndrome. Blood, 1996, 88, 2385-409.
2. Fung MA, Murphy MJ, Hoss DM, et al.: Practical evaluation and management of cutaneous lymphoma. J Am Acad Derma- tol, 2002, 46, 325-57.
3. Bernengo MG, Burg G, Duvic M, et al.: Update on erythroder- mic cutaneous T-cell lymphoma: report of the international so- ciety for cutaneous lymphomas. J Am Acad Dermatol, 2002, 46, 95-106.
4. Yeh A, Hudson A, Prieto V, et al.: Reassessment of lympho- cytic atypia in the diagnosis of mycosis fungoides. Mod Pa- thol, 2001,14, 285-88.
5. Kempf W, Dummer R, Burg G: Approach to lymphoprolifera- tive infiltrates of the skin. The difficult lesions. Am J Clin Pa- thol, 1999, 111 (suppl. 1), S84-S93.
6. Willemze R: Primary cutaneous lymphomas. Curr Opin On- col, 2000,12, 419-25.
7. Willemze R, Kerl H, Sterry W, et al.: EORTC classification for primary cutaneous lymphomas. A proposal from the Cu- taneous Lymphoma Study Group of the European Organiza- tion for Research and Treatment of Cancer (EORTC). Blo- od, 1997, 90, 354-71.
8. Ralfkiaer E, Wollf-Sneedorff A, Thomsen K, et al.: Immuno- phenotypic studies in cutaneous T-cell lymphomas: clinical im- plications. Br J Dermatol, 1993, 129, 655-59.
9. Preesman AH, Toonstra J, van der Putte SCJ, et al.: Immuno- phenotyping on simultaneously occuring plaques and tumours in mycosis fungoides and Sezary syndrome. Br J Dermatol, 1993, 129, 660-66.
10. Kohler S, Zehnder JL: Use of the polymerase chain reaction in the evaluation of the cutaneous T-cell infiltrates. Dermatol Clin, 1999, 17: 657-66.
11. Wood GS: T-cell receptor and immunoglobulin gene rearran- gements in diagnosing skin disease. Arch Dermatol, 2001, 137:
1503-506.
12. Bakels V, Oostveen J, Preesman A, et al.: Differentiation be- tween actinic reticuloid and cutaneous T cell lymphoma by T cell receptor γgene rearrangements analysis and immunophe- notyping. J Clin Pathol 1998,51,154-158.
13. Terhune MH, Cooper KD: Gene rearrangements and T-cell lymphomas. Arch Dermatol, 1993, 129, 1484-490.
14. Li N, Bhawan J: New insight into the applicability of T-cell re- ceptor γgene rearrangement analysis in cutaneous T-cell lym- phoma. J Clin Pathol, 2001, 28, 412-8.
15. Mieleke V, Staib G, Boehncke WH, et al.: Clonal disease in ear- ly cutaneous T-cell lymphoma. Dermatol Clin, 1994, 12, 351-60.
16. Proceeding of the International Concensus Conference on CTCL Treatment and Recommendations Boston. J Am Acad Dermatol, 1997, 36, 949-54.
17. Wright DK, Manos MM: Sample preparation from paraffin embedded tissues. W: PCR protocols: a guide to methods and applications. Academic Press, New York, 1990, 153-58.
18. Wood G, Tung R, Haeffner A, et al.: Detection of clonal T-cell receptor γgene rearrangements in early mycosis fungoides/Se- zary syndrome by polymerase chaine reaction and denaturing gradient gel electrophoresis (PCR/DGGE). J Invest Dermatol, 1994, 103, 34-41.
19. Ralfkiaer E.: Controversies and discussion on early diagnosis of cutaneous T-cell lymphoma. Phenotyping. Dermatol Clin, 1994, 12, 329-34.
20. Smoller BR, Bishop K, Glusac EJ, et al.: Lymphocyt antigen abnormalities in inflammatory dermatoses. Appl Immunohi- stochem, 1995, 3, 127-31.
21. Pawlaczyk M, Filas V, Brêborowicz J, Silny W: Badania im- munohistochemiczne nacieków skórnych u chorych z ziarni- niakiem grzybiastym. Doniesienie wstêpne. Przegl Dermatol, 1997, 84, 19-26.
22. Asthon-Key M, Diss TC, Du MQ, et al.: The value of polyme- rase chain reaction in the diagnosis of cutaneous T-cell infil- trates. Am J Surg Pathol, 1997, 21, 743-47.
23. Bergman R, Faclieru D, Sahar D, et al.: Immunophenotyping and T-cell receptor γgene rearrangement analysis as an adjunct to the histopathologic diagnosis of mycosis fungoides. J Am Acad Dermatol, 1998, 39, 554-59.
24. Muche M, Lukowsky A, Asadullah K, et al.: Demonstration of frequent occurrence of clonal T cells in peripheral blood of patients with primary cutaneous T-cell lymphoma. Blood, 1997, 4, 1636-42.
25. Muche M, Lukowsky A, Heim J, et al.: Demonstration of fre- quent occurrence of clonal T cells in peripheral blood but not in the skin of patients with small plaque parapsoriasis. Blood, 1999, 94, 1409-1417.
26. Scheller U, Muche M, Sterry W, et al.: Detection of clonal T cells in cytaneous T cell lymphoma by polymerase chaine reaction: comparison of mutation detection enhancement-po- lyacrylamide gel electrophoresis, temperature gradient gel elec- trophoresis and fragment analysis of sequencing gels. Electro- phoresis, 1998, 19, 653-58.
27. Bachelez H, Bioul L, Flageul B, et al.: Detection of clonal T-cell receptor γgene rearrangements with the use of polyme- rase chain reaction in cutaneous lesions of mycosis fungoides and Sezary syndrome. Arch Dermatol, 1995, 131, 1027-31.
28. Bottaro M, Berti E, Biondi A, et al.: Heteroduplex analysis of T- cell receptor γgene rearrangements for diagnosis and monitoring of cutaneous T-cell lymphomas. Blood, 1994, 83, 3271-78.
29. Theodorou I, Bigorgane C, Delfau MH, et al.: VJ rearange- ments of the TCRγlocus in peripheral T-cell lymphomas: ana- lysis by polymerase chain reaction and denaturating gradient gel electrophoresis. J Pathol, 1996, 178, 303-10.
30. Dadej K, Gaboury L, Lamare L, et al.: The value of clonality in the diagnosis and follow-up of patients with cutaneous T-cell infiltrates. Diagn Mol Pathol, 2001, 10, 78-88.
31. Burg G, Dummer R: Small plaque (digitate) parapsoriasis is an abortive cutaneous T-cell lymphoma and is not mycosis fun- goides. Arch Dermatol, 1995, 131, 336-8.
32. Wood G: Analysis of clonality in cutaneous T cell lymphoma and associated diseases. Ann New York Acad Sciences, 2001, 941, 26-30.
33. Delfau-Larue MH, Laroche L, Wechsler J, et al.: Diagnostic value of dominant T-cell clones in peripheral blood in 363 pa- tients presenting consecutively with a clinical suspicion of cu- taneous, lymphoma. Blood, 2000, 96, 2987-92.
34. Dippel E, Assaf C, Hummel M, et al.: Clonal T-cell receptor g-chain gene rearrangement by PCR-based genescan analysis in advanced cutaneous T-cell lymphoma: a critical evaluation.
J Pathol, 1999, 188, 146-54.
Praca wykonana zosta³a dziêki programowi badañ w³a- snych nr 501-2-12-03 AM im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu.
Podziêkowania:Autorzy pragn¹ podziêkowaæ Panu doc.
Ansgarowi Lukowsky z Kliniki Dermatologii Uniwersyteckie- go Szpitala Charite, Uniwersytetu Humboldta w Berlinie, za nieocenion¹ pomoc w opracowaniu metody analizy rearan¿a- cji genu γreceptora TCR i interpretacji uzyskanych wyników.