HPLC–DAD HPLC–DAD analiza ekstraktu

(1)

OKREŚLANIE STRUKTURY RÓŻNYCH OKREŚLANIE STRUKTURY RÓŻNYCH

TOKSYN PRZY ZASTOSOWANIU TECHNIKI TOKSYN PRZY ZASTOSOWANIU TECHNIKI

CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ SPRZĘŻONEJ ZE SPEKTROMETREM SPRZĘŻONEJ ZE SPEKTROMETREM

MASOWYM (HPLC-MS) MASOWYM (HPLC-MS)

Dr inż.Agata Kot-Wasik

Katedra Chemii Analitycznej, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska ul. G.Narutowicza11/12, 80-952 Gdańsk, Poland agata@chem.pg.gda.pl

Dr Hanna Mazur-Marzec

Instytut Oceanografii, Uniwersytet Gdański,

Al. Marszałka Piłsudskiego 46, 81-378 Gdynia, Poland

biohm@univ.gda.pl

(2)

TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE

ANALIZĘ TOKSYN:

TESTY IMMUNOLOGICZNE I ENZYMATYCZNE TESTY IMMUNOLOGICZNE I ENZYMATYCZNE

–ELISA (–ELISA (angang. . EEnzymenzyme--LLinked Iinked Immunommunossorbentorbent

AAssayssay) pozwala na oszacowanie obecności toksyn,) np. wydzielanych przez glony z rodzaju Microcystis, na poziomie kilku µgL^-1 bez przygotowania próbki, lecz nie pozwala na ich identyfikację.

–PPI–PPI ((angang. P. Proteinrotein PPhospatase hospatase IInhibition assaynhibition assay)) metody wysoce selektywne, czułe i szybkie

J. Rapala, K. Erkomaaa, J. Kukkonen, K. Sivonen, K. Lahti, Analytica Chimica Acta 466 (2002) 213-231

(3)

ANALIZĘ TOKSYN:

METODY CHROMATOGRAFICZNE METODY CHROMATOGRAFICZNE

– GC–MS - zapewnia wysoką selektywnośćGC–MS (specyficzność) oznaczenia, lecz wymaga

derywatyzacji analitów, a poza tym nie może być zastosowana do analizy nielotnych toksyn wysokocząsteczkowych.

(4)

ANALIZĘ TOKSYN:

–– HPLC-UVHPLC-UV lub HPLC-DAD - jedna z HPLC-DAD najczęściejnajczęściej stosowanych technik, jednakże nie zapewnia ona wystarczającej jakości uzyskiwanych

wyników bez zastosowania żmudnych i

długotrwałych procedur przygotowania próbki.

––HPLC-fluorescencja - rzadziej stosowanaHPLC-fluorescencja

technika, gdyż wymaga derywatyzacji analitów;

ale znacznie czulsza niż HPLC-UV.

(5)

HPLC–DAD HPLC–DAD analiza ekstraktu

analiza ekstraktu Nodularii Nodularii

HPLC-DAD

238 nm 254 nm

(6)

HPLC–DAD HPLC–DAD analiza ekstraktu

analiza ekstraktu Nodularii Nodularii

Analiza widma DAD

Wniosek: niezbędny jest wzorzec celem potwierdzenia czasu retencji i porównania widma UV

238 nm 254 nm

(7)

ANALIZĘ TOKSYN:

––HPLC-UV lub HPLC-DADHPLC-UV HPLC-DAD

Pozwala na uzyskanie informacji o masie cząsteczkowej oznaczanych toksyn, a nawet ich identyfikację.

HPLC–DAD-MS HPLC–DAD-MS

(8)

HPLC-MS HPLC-MS

TAK, ALE ...

problem połączenia LC i MS !

Przepływ fazy ruchomej w LC wymusza problemy związane z uzyskaniem wysokiej próżni. Podczas analizy GC (faza ruchoma:

gaz) przepływ gazu u wlotu do MS wynosi około 0.5-2ml/min.

Podczas kiedy w HPLC faza ruchoma w postaci ciekłej daje przepływ gazu u wlotu MS rzędu 350ml/min w przypadku metanolu i aż

1000 ml/min w przypadku wody!

( J.Abian "The coupling of Gas and Liquid Chromatography with Mass Spectrometry ")

HPLC, 1 ml/min, 100-250 bar MS, próżnia

(9)

HPLC-MS HPLC-MS

Kwadrupol Kwadrupol Kolumna

Kolumna HPLC HPLC

Ciśnienie Ciśnienie atmosferyczne

atmosferyczne PróżniaPróżnia

Wysokie ciśnienie Wysokie ciśnienie

+HV+HV

Elektrorozpylanie Elektrorozpylanie

(electrospray(electrospray))

ODPAROWANIE ROZPUSZCZALNIKA

ROZPYLENIE

ROZSZCZEPIENIE I POWSTANIE JONÓW

[M+nH[M+nH]]ⁿ⁺ⁿ⁺

+ +

+ + +

+

+ + + +

+

+ +

+++ ++ + +++

+++

+ +++ ++ + +++

+++

+ +++ ++ + +++

+++

+ + ++ + + ++ + +

++ + +

(10)

HPLC–MS HPLC–MS analiza ekstraktu

analiza ekstraktu Nodularii Nodularii

HPLC-MS

SCAN

SIM

(11)

HPLC–MS HPLC–MS analiza ekstraktu

analiza ekstraktu Nodularii Nodularii

Widmo MS

SCAN

(12)

HPLC–MS HPLC–MS analiza ekstraktu

analiza ekstraktu Nodularii Nodularii

Analiza widma MS

Wniosek: wzorzec może potwierdzić hipotezę o obecności nodularyny w

ekstrakcie, ale nie jest niezbędny.

[M+H]

[M+H]⁺⁺ = 825.4 = 825.4 M=824.4 M=824.4

NH H

H

H H

H OMe

H NH O H

N H COOH

O

CH₃ H NH

O

NH

NH NH₂ N

H

O

CH₃ H

H COOH H

CH₃

(13)

HPLC–MS HPLC–MS analiza ekstraktu

analiza ekstraktu Nodularii Nodularii

Widmo MS

SCAN

(14)

HPLC–MS HPLC–MS analiza ekstraktu

analiza ekstraktu Nodularii Nodularii

HPLC-MS

NH H

H

H H

H OMe

H NH O H

N H COOH

O

CH₃ H NH

O

NH

NH NH₂ N

H

O

CH₃ H

H COOH H

CH₃

[M+H]

[M+H]⁺⁺ = 811.3 = 811.3 M=810.3 M=810.3 dm-Nod

(15)

HPLC–DAD-MS

analiza ekstraktu:analiza ekstraktu:

jezioro Karczemne jezioro Karczemne

HPLC-DAD

HPLC-MS

MS-SCAN

MS-SIM DAD

(16)

MS-SCAN

analiza ekstraktu: jezioro Karczemneanaliza ekstraktu: jezioro Karczemne

[M+H]

[M+H]⁺⁺

NH₂+ O

Anatoksyna A

NH CH3

H H C H₃

H

CH3 H

H H O

N H C O H₃

H

N O OH H

NH CH₂

O CH3

A H C H₃

O NH

H

NH O

NH OH R1 H H

NH2 N

H MC RR

[M+2H]

[M+2H]²⁺²⁺

(17)

MS-SIM

analiza ekstraktu: jezioro Karczemneanaliza ekstraktu: jezioro Karczemne

Jon monitorowany:

166 (Anatoksyna-a)

Jon monitorowany:

995 (MC-LR) Jon monitorowany:

520 (MC-RR)

Jon monitorowany:

825 (Nod) 1046 (MC-YR)

(18)

ANALIZĘ TOKSYN:

– HPLC–MS - technika ta pozwala naHPLC–MS

uzyskiwanie informacji o masie cząsteczkowej oznaczanych toksyn.

Widmo masowe - “odcisk palca” substancji

pozwala na jej identyfikację. Technika HPLC-DAD-MS zaczyna być coraz powszechniej stosowana do analizy

toksyn ze względu na jej zalety oraz fakt, iż dzisiaj systemy HPLC-MS stają się niezawodne, oferuje je coraz

większa liczba producentów, a ich ceny zbliżają się do poziomu akceptowalnego przez większość laboratoriów.

(19)

ANALIZĘ TOKSYN:

– HPLC–MSHPLC–MS

(20)

ANALIZĘ TOKSYN:

niezwykle użytecznym rozwinięciem techniki HPLC-MS jest LC-MS-MSLC-MS-MS

–HPLC-MS-MS–HPLC-MS-MS - dzięki zastosowaniu

dodatkowego detektora masowego możliwa jest identyfikacja nieznanych substancji jedynie na podstawie ich widma masowego (nawet bez konieczności posiadania wzorców).

(21)

WNIOSKI KOŃCOWE:

Technika HPLC–MSHPLC–MS zaczyna być coraz powszechniej stosowana w laboratoriach

analitycznych ze względu na jej zalety.

Wkrótce technika LC-MS stanie się techniką rutynowych analiz.