Produktie van penicilline in een continu proces

'0

'0

iO

....

!-.

10

,

0

,

U

,~O

·

'

..

'" ' ..

..

•

.

...

,I,., 1\;' ",

Laboratoriu~

voor Chemische Technologie

. ~

-

--~ ..

..---",.

Verslag behorende bij het processchema

van

..

.

,

WI

M

DE VRIES

en

PETER OERLEMA

N

S

onderwerp:

PRODUCTIE VAN PENICILLINE IN EEN

... __________

9_QN'r):;!DJ

..

fIN

~.~

.

.

_

..

______ . _

.. _____

.

__

.'

adres: Adelaarstraat 19 , Rotterdam

..

< '

l

J

L •

r .

L

_..

[

:

PRODUKTIE VM~ PENICILLINE IN EEN

I~

CONTINU PROCES

r~

Procesvooronhlerp van

C

P. Oerlemans en

W.

de Vries

L

[

:

[

~

[

.

r~

l.

[

~

r'

l

J aug/ sept

1973

n

n

n

n

n

r

~ --~ - - -

-,

,

, I

L

[

:

, .

l

,

[

~

n

n

n

n

n

n

INDELING bladzijde nummer samenvatting en conclusies inleiding markt en prijzen proces beschrijving I de fermentatie

biosynthese ,van penicilline - G

1 2 2

5

schatting van de te bereiken penicilline concentr.

5

berekening fermentorgrootte en aantal fermentoren

8

de voeding van de microorganismen

9

voedigsstromen 2e fermentor 10 voedingsstromen 1 e fermentor 13 beluchting 15 kinetiek 18 morfologie 19 rheologie 19

vermogensconsumptie van de roerders

warmteproduktie en afvoer

opstarten

sterilisatie van voeding en lucht

11 de opi'Jerking

:l.nleiding

koeling V2n de ferment or effluent de filtratie

de extractie

eerste zuivering van het penicilline-extract

het winnen van het Na-zout van penicilline

het terugwinnen van amylacetaat, aceton

en N-ethyl-piperidine 21 22

27

28

35

35

37

39

43

45

46

r 1

L

[-[

:

[J

n

n

n

n

111 de utilities

berekening van de freon massastromen berekening van de koehTater massastromen

berekening van de stoom m8.ssastromen elektriciteit

lucht

de afval prodllicten

IV

de kostprijs berekening

bepaling van de apparatuurkosten

bepaling van het totaal te investeren kapitaal

de totale fabrikagekosten

literatuur

bijlage 1 massa:-en warmtebalans

bijlage 2 apparatenlijst en investeringen bijlage

3

pompenlijst en investeringen bijlage

4

berekening van het werkkapitaal bijlage

5

berekening V8.n de produktievolume

kosten

bijlage 6 globale bepaling van de loonkosten bijlage

₇

fysische konstanten

bijlage

8

symbolenlij st bijlage

9

flol'lschema

.

49

51

52

54

54

55

57

58

58

60

afhankelijke

• 1 \ I ~ ,

[

:

[l

n

o

n

n

n

r

Samenvatting en konklusies

Teneinde te onderzoeken of het mogelijk is een penicilline

produktie-proces gebaseerd op 8en kontinue fErmentatie , op een ekonomisch verantwoord

manier te doen plaats vinden ,"erd dit ontwerp gemaakt

-o~ dit moment vindt nog geen teohnische produktie vannpenicilline

op kontinue wijze plaats ,

-literatuur betreffende de kontinue penicilline fermentatie bleek bijzonder schaars te zijn , mede in verband met sterke konkurrentie tussen penioilline producenten ,

-de produktie a2n Na-penicilline zout badraagt , in het voor u liggende

onth'erp , 500 ton/jaar,

-de fermentatie \'lordt uitgevoerd in een serie van twee fermentoren :

in de eerste fermentor treedt groei op van mikroorganisme met dàarnaast

vorming van eindprodukt , in de tweede ferment or is er alleen vorming

van eindprodukt ,

-de tot;üe dirckte en indirekte apparatuurkosten bedragen DF

67.000.000.-en het totale te invester67.000.000.-en kapitaal DF

71.000.000.--de direkte fabrikagekosten zijn pen jaar DF 30.000.000.-en per kg DF 60,00 •

-Daar de marktprijs op dit moment ongeveer DF 50,00 per kg is , lijkt

het omlaarschijnlijk met het door ons ontworpen proces te kunnen

konkurreren met reeds bestaande batchgewijze processen ,

-wa2rschijnlijk is het mogelijk de kosten die de op\'Terksektie met zioh

meebrengt terug te dringen , door het toepassen van modernere processen ,

'

_I

1

1

_I

( 1

L

r

r'

r'

I .

[l

n

n

n

n

r

---

..

_-_

.... --, -1-Inleiding

Penicillines zijn stoffen die behoren tot de antibiotica en die geproduceerd worden door bepaalde schimmels van het geslacht Penicillium.

De engelse arts Alexander Fleming was de eerste die in 1928 de

bacteriedodende werking van de afscheidingsprodukten van een Penicillium- schimmel waarnam.

Pas in 1938 slaagden Florey en Chain erin deze afscheidingspro-dukten te isoleren in een houdbare kristalvorm. Tijdens de tweede wereldoorlog werd bijzonder veel aandacht besteed aan de produktie van penicilline. Na aanvankelijk gebruik te hebben gemaakt van oppervla.ktecultures, ging men snel over op submerse cultures om

de produktii te kunnen vergroten. De 100-liter fermentors waarmee

men begon zijn inmiddels uitgegroeid tot fermentoren met een

inhoud van meer dan 200 m3 • Ondanks de duidelijke nadelen die

verbonden zijn aan batchgewijze produktie, maakt men nog steeds

geen penicilline in continue fermentaties. De voornaamste reden hiervoor is dat men het gevaar van besmetting van de culture tijdens een langdurig proces niet volledig kan uitbannen.

In dit procesvoorontwerp is gekozen voor continue produktie van penicilline. Ondanks de voorzichtige houding van bedrijven

ten opzichte van continue processen, zaleen overgang van batch naar continu tenslotte toch wel worden gerealiseerd.

( 1 L "

r

r,

II

n

n

n

n

n

r

-2-Markt en prijzen

Na 1945 heeft de produktie van penicilline een enorme vlucht genomen. Van een produktie van 1000 kg in 1945 ging het via 195000 kg in 1951 naar een huidige produktie van ongeveer 5000 ton per jaar. Ten gevolge van de uitbreiding van de fabrieken

-daalde de prijs van de penicilline sterk. In 1943 betaalde men

20 dollar voor 100.000 eenheden, in 1945 nog maar één dollar voor dezelfde hoeveelheid. In 1952 was de prijs-gezakt naar

2 dQllarcenj~ ~oor 100.000 eenheden, en momenteel is de prijs

on-Vl.jrtJ.g

geveer

~

gulden per kg.

(=

ongevee~

P

cent per 100.000 units). Aan de enorme groei van de eerste 25 jaar kwam in 1970

onver-wacht een eind. Vele biochemisch geörienteerde bedrijven hadden na 1965 grote bedragen geïnvesteerd in de enzymbereiding voor l'lasmiddelen (maxatase). Toen deze markt plotseling in elkaar

zakte, stapten vele enzymproducenten over op penicillineberei-ding. Verscheidene zachte "linters verminderden tevens de vraag naar penicilline, met als gevolg een reusachtige overproduktie.

Pas eind 1972 herstelde de penicillinemarkt zich enigszins.

De vorm waarin de penicillines op de markt kunnen "lOrden ge-bracht is zeer verschillend. Het bulkprodukt zoals het uit de

fermentatie tevoorschijn komt, is voornamelijk benzylpenicilline. In vele gevallen bereidt men alleBn 6-amino-penicillinezuur

(A.P.Z.). Door chemische reakties met deze stoffen uit te voeren

kan men de struktuur en daardoor de werking modificeren. Zo

ont-staan de semisynthetische penicillines, waarvan er tientallen

bekend zijn. Verwerkt in tabletten, poeders, zalven en als

oplossing wordt de penicilline tenslotte in de handel gebracht.

Procesbeschrijving (zie ook flow-schema)

Penicilline wordt gevormd tijdens de fermentatie door een

schim-mel. De schimmel bevindt zich in twee in serie staande geroerde

fermentoren. De eerste fermentor dient voornamelijk voor de groei

van de micro-organismen. In de tt .. eede fermentor treedt geen groei meer op , maar wordt nog wel penicilline gevormd. Beide

fermento-ren worden belucht. Om de vorming van nieuwe schimmel en produkt

'.,

rl I , l ,

r:

[

~

f '

[ J

[1

n

n

n

n

-3-in stand te houden, moet het micro-organisme gevoed worden. De voeding wordt eerst gesteriliseerd en vervolgens in de ferme

nto-ren gepompt.

Uit de tweede fermentor stroomt een oplossing van penicilline in

water, met daarin celmateriaal(mycelium). Om snelle degradatie

van de gevormde penicilline te voorkomen, wordt de temperatuur

van de uaterige oplossing teruggebracht tot 2

0

C. Bij deze

tem-peratuur gaat de degradatie veel langzamer. Het mycelium wordt

met een trommelfilter afgefiltreerd. Het filtraat wordt aangezuurd

met zwavelzuur en in een centrifugaal-extractor met amylacetaat

geëxtraheerd. De penicilline gaat daarbij over in de organische fase. In een kristallisator wordt een mengsel van N-ethylpiperi-dine en aceton toegevoegd. N- ethylpiperidine vormt een zout met

penicilline, dat uitkristalliseert. De slurrie uit de

kristalli-sator wordt in een centrifugaalfilter afgefiltreerd. Het afgefil-treerde zout wordt opgelost met een zwavelzuuroplossing en in

een centrifugaalextractor met amylacetaat geëxtraheerd. Door

toe-voegen van water en bicarbonaat gaat penicilline over van de

amylacetaatfase naar de waterfase. In een centrifugaalscheider

worden de vloeistoffasen van elkaar gescheiden. Door vriesdrogen

..

....

,.

.._m~._,_~~_.. ..~

_ ..

__ ...

___

.. _

..

,,~,

__ . __ . _ _ _ _ _ _ _ _ _

..

-.'- -

_.-. -

-

- - ,

r 1

1:

r '

r '

t:

[

.

[

.

[

:

[

~

['

]

rl

[l

n

n

.

'r~

r~

-4-DEEL I DE FERMENTATIE

,

i 'I I ._, ,

rl I ' I ..

['

r '

l

I

r

~ ~ , r , , I r l

rl

rl

n

-5-Biosynthese van penicilline G

De produktie van penicilline geschiedt met behulp van speciaal voor dit doel geselecteerde en gekweekte schimmels. Voor de opper-vlaktecultures die men tot vlak na de tweede wereldoorlog toepaste

l'las PenicilJ.ium notatum het meest geschikt. In de submerse

cul-tures blijkt Penicillium chrysogénum echter beter te voldoen. De biosynthese van penicilline is nog niet geheel opgehelderd,

maar algemeen \-1Ordt aangenomen dat de synthese als volgt verloopt:

de penicillinekern is afgeleid van L-cysteïne 1) en L-valine 1,2,3) Haarschijnlijk wordt eerst cystine gereduceerd tot cysteine. Dit

l'lordt dan met behoud van de stereochemie in de

(3 -

lactamring

in-gebouwd. De zwavelbron voor het molecuul kan ook zijn sulfaat, homocysteine of methionine. Van valine wordt het gehele

koolstof-skelet gebruikt en meestal ook het stikstofatoom, hoe\-lel dit ook van andere moleculen kan komen. Zijketens van het penicillinemo-lecuul komen van verschillende resten van carbonzuren.

Men veronderstelt dat het tripeptide 1 (zie figuur 1) wordt gevormd

door achtereenvolgens cysteine en valine aan molecuul

3

te

ver-binden. Over de oxydatiestappen die 1 omzetten in 2 is weinig bekend.

Schatting van de te bereiken penicillineconcentratie

De te bereiken penicillineconcentratie bij een fermentatie is erg afhankelijk van de gebruikte schimmel. De eerste oppervlakte-cultures in de tweede wereldoorlog hadden een opbrengst aan p@ni-cilline van rond de 100 eenheden per milliliter

fermentatievloei-stof. ( 1 Internationale Eenheid is gelijk aan 0,6~

natrium-benzylpenicilline ). Door bestralen met UV-licht en selectie van de goede mutanten, wist men al gauw beter producerende schimmels

te verkrijgen. (zie ~iguur 2).

Een enorme sprong voorui t was de ontdekking van de \-lerking van

precursors, die de produktie op enige duizenden eenheden per

milliliter fermentatievloeistof bracht. Men heeft inmiddels vele

verbindingen geprobeerd als side-chain precuEsor, maar alleen

monogesubstitueerde azijnzuren bleken succesvol.

I .,

i

r

I L _ r .

L

r1 I I l I

n

r

l J

n

n

r

-6-BIOSYNTHESE VJ..N PFJIJICILLINE-G

H 2N

,

H2

f

cysteine +

r

H - (CH₂)

3"

COOH ~ CH-( CH ) - CO -_{, 2}

₃

NH-CH -_I eH ₂ -SH Hooe COOH Hooe Ivaline

J

zijketenuitwisseling penicilline

G

figuur 1

l ~

l

.

L

[

:

[ 1

fl

n

n

n

n

.-, . ' .-- , ,-' . , ", f ' " ', '

I

-1-NRRL 1951

I

s NRRL 1951825 ,-~ X-1612 ' , "

"

.

.

.

...

'

'

.

..

'

,..

.

Wi'~; :i~~~~

1

.:,

i,~';'!'''':

::,;:::'

,:~

r'",::'

:;."; ,'

.

, ' ... 47!650 ' ' ; :' , s ' 47-1380 ,

r

49-133 L2230]

I

N-S

!

"

.;

r ":" " ' . ;,,' ,:, ,O'''i''.'· ;';,

~

s ,

i

,

f

'

':

':<~~

"

~:

'

:'

47-638 [980] , 47.762 '7-911,' , ':; , S ' ;:" , s :" , " '7-155~ Ü3S7] ,

"UV-I

'

47-1040 ',: "'"

'

r

I

.;;~

..

,

;,;'(

- ,',,",:. /

,

I

,

"1

,'. ! ' : ,',; N-S I 48-701 U36S] 48-786 : ' ,,, .• ~-f

s

,

~-uv-ir' 48 -1655 48-1372 [i30]

,S

I-uv-U

49-482 49-901

,S

'-UV.JI

49-2595 I 49-2429

,S

'-UV-U

50-529 ' 50-724 49;2166 '-N-S 50-25 '-N-S 50-935 s

~

51~70'

l

,

I

51-20 f?52[J 52-1087

I s

I

, s

'-UV-I

50-1247 [!506] 50-1583

,

'S

I-UV-I

SH15 , 51-825

S...J-....

s

I-UV-I

~ ~ 52-85 51-1113 53-m

I-UV-I

51-20A 61-208

J

s , S 51-20A2 , -51-20BJ 52-817

,-UV..,

53-174

I-UV-I

53-8~4 1!84S] 53-399 ~658] 53-'" [2580J

Abb.1>4. Umzllcbtung VOD Penicill,,,,,, cArv.og", .. m .. Wlsoonain-FamUIe"

<aua M, 1'. D.lOIUJ8 U. ~. F. ST.lurJ'JUl: Mycolollla, Ed. XLVII. 4. 420, 101>/»

figuur 2

rl

I

L..., I •

l.

l ,

I'

I l ,

[1

n

n

n

n

-8-Nog altijd probeert men door UV-bestraling en stamselectie betere resultaten te verkrijgen. De huidige stammen produceren ongeveer 20.000 eenheden per milliliter fermentatievloeistof en meer.

Om de resultaten van een continue fermentatie te kunnen vergelijken met de normale batchfermentaties, doet men bij alle continue proeven tevens proeven in batch met dezelfd~ stam • Het blijkt dan dat

de penicillineproduktie in een continue fermentatie niet lager hoeft te zijn, dan in een batchfermentatie

4).

Bij de berekeningen voor dit procesvoorontwerp zal een penicilline-opbrengst van 8000 eenheden per milliliter fermentatievloeistof worden aangenomen, bij een concentratie micro-organismen in de fermentor van 20 mg/ml in de eerste fermentor, en van 15 mg/ml in de tweede fermentor. Gebleken is namelijk dat de door Pirt genoemde hoge concentraties bij eeh continue fermentatie miet haalbaar·zijn.

5)

Berekening fermentorgrootte en eantal fermentoren

Aangenomen wordt dat de te onhlerpen fabriek een jaarproduktie van 500 ton natriumbenzylpenicilline moet kunnen halen. Als we verder aannemen dat het over-all rendement van de opwerking 90 ~

is, dan moet de penicillineproduktie v66r de opvlerking 500/0,9 ton/jaar bedragen. Al s in x fermentorcascades \vordt geproduceerd,

500

dan bedraagt de jaarproduktie per cascade 0

9

ton. Elke

cas-x. ,

cade bestaat buit een hoofdfermentor van 110 kubieke meter en een bijfermentor van 200 m3• Uit de literatuur is bekend dat de

fer-. 6)

mentatie gedurende ongeveer 1000 uur kan worden voortgezet •

Als we voor schoonmaken en steriliseren tussen de runs en opnieuw opstarten totaal 100 uur rekenen, dan kunnen per jaar 8760/1100 runs per cascade \-lOrden gedraaid. Per run wordt slechts 1000 uur geproduceerd, dus

500.1100.1000 x.0,9.1000.8760

=

de uurproduktie 69,75 kilogram.

x

per cascade is:

We hebben aangenomen dat de concentratie van de penicilline in de reactoruitlaat 8000 eenheden per mI is, zodat de produktie dan bedraagt: ~.c • ~ .8000.

) v p v

f 1

[

~

r:

[

:

[

~

~Î

I I

• J

n

n

n

r

-9-70 uur.De onbeluchte reactorinhoud is 154 m3 , zodat de volumestroom uit de tweede reactor is 154/70

=

2,2 m3/hr. De uurproduktie per cascade wordt daardoor:

8

000.10 .0,6.10

6

-9

.2,2 = 10,56 kg hr.

/

Het benodigde aantal cascades is 69,75/10,65 = 6,55

We installeren in de fabriek 7 fermentorcascades om de geplande produktie te kunnen realiseren.

De voeding van de micro-organismen

De voornaamste elementen waaruit elke cel is opg~bouwd zijn: koolstof, waterstof, zuurstof, stikstof, zwavel, fosfor, kalium, magnesium, calcium en ijzer. Daarnaast zijn kleine hoeveelheden van andere elementen vereist voor een goed functioneren van de cel.

(spore-elementen als koper, zink, mangaan, molybdeenen cObalt)22) Van al deze elementen worden de metalen in ionvorm in het fermen-tatiemedium gebracht, z ... ravel en fosfor inde vorm van sulfaat en fosfaat en stikstof in de vorm van het ammoniumion

lm;.

Kool stof, waterstof en zuurstof worden voornamelijk betrokken uit organische substraten. Waterstof en zuurstof ook uit H

20 en O2•

Voor de groei van Penicillium chrysogenum werd oorspronkelijk in batchfermentaties lactose gebruikt. Later ontdekte men echter dat glucose, mits continu toegevoerd, betere resultaten gaf 23) Het gebruik van cornsteep- liquor, een produkt dat ontstaat door indampen van het waterextract dat wordt verkregen van mais tijdens de industriele produktie van dextrose, stijfsel en andere graan-produkten, gaf nog betere resultaten. De samenstelling van corn-steep-liquor is: 50

%

vaste bestanddelen, \-1aarvan 0-10

%

suikers; 10-30

%

melkzuur en 3-4

%

stikstof, en verder anorganische zou-ten en precursors.

Voor de produktie van penicilline heeft het micro- organisme cysteine en valine nodig, "'lelke stoffen afkomstig zijn uit de citroenzuurcyclus van het organisme. Naast veel koolstof bevat-ten deze stoffen ook zwavel en stikstof. Extra toedienen van sul-faat en ammoniumionen is dus noodzakelijk. In 1947 ontdekten

Moyer en Coghill 24) dat de produktie van benzylpenicilline sterk toenam door toevoegen van fenylazijnzuur.

.

"-1

,

I

' j

I

!

I

r "

l

r '

I , J fI I I 1 )

[1

n

n

-10-In de literatuur komt men twee verschillende voedingssame nstel-lingen tegen (zie tabel 1). De ene bestaat uit een koolst~f bron (glucose of lactose ) en cornsteep-liquor, alsmede de zouten KH

2P04, Na2S04 en K-fenylacetaat. De andere soort bestaat uit een koolstofbron, KH

2P0

₄

,

sulfaatzouten van de benodigde sporen-elementen en(NH4)2S04 als stikstofbron. De laatste samenstelling is de zuiver synthetische voeding die meestal bij laboratorium-proeven wordt gebruikt. Na aanvankelijke successen met cornsteep-liquor kwam men er namelijk steeds meer achter dat de " magische kracht " van deze vloeistof voornamelijk zat in het con stamt houden van de pH tijdens de fermentatie (bufferlverking) en het bevatten van de nodige anorganische zouten. Pirt

6)

concludeert dan ook dat er niets magisch aan C$L is. Het enige voorde~l van CSL is de lage prijs, terwijl als nadeel kan worden aangemerkt dat de samenstelling niet voor 100

%

bekend is en bovendien niet constant is.

Voor de te ont",erpen penicillinefabriek wordt de volgende voeding gekozen: sucrose (gedenatureerde suiker), cornsteep-liquor en Na-fenylazijnzuur, aangevuld met de ammoniumzouten van zwavelzuur en fosforzuur.

e

Voedingsstromen ~ fcrmentor

De tweede fermentor van elke cascade heeftbeen lege inhoud van 200 m3 • De inhoud aan penicillinebeslag is 154 m3 in onbeluchte toestand. De verblijf tijd van het beslag in de fermentor is 70 uur, zodat de totale voedingsstroom naar de tweede fermentor bedra.agt 2,2 m3/hr. Om de benodigde roerenergie niet tot astro-nomische hoogte te laten stijgen, l'wrdt de micro-organismencon-centratie in de tweede fermentor bepaald op 15 gil. Geschat wordt dat in de tl'leede ferment or 30

%

van de totale penicillineproduktie plaats vindt.

Men beschikt over de volgende oplossingen: suikeroplossing (sucrose)

ammoniumsulfaatoplossing diammoniumfosfaatoplossing precursoroploGsing van 125 gil 100 gil 50 gil 100 gil

:

'1

1

~ ~ :--=J

:---J

===:J

..---. ---...I

=

J

..----, " ~ .----, _{r - - ' " r----" r - - - "} I '. -1·-.. _~ __ ,_ ~

c

10-tw

We

~ 2,

>)(

(01'\(

,., o.

N ....s;> N _co L/_

7

%

~

I

lt

0

~

Ie .

N -..J

~)'

~/t.

.

fA)

~/e.

CJ'. 2,! X CO,.(, M.o. N

G'-27,)

~ ~o ~

(11

!,;,<4) - b I ,

~/f

N j - - --···-·t - -

("~",d)

Js~!J

'

.

~o

c ..

~, I I

1-6

%.

1 I

7~()

1

711

,0

o,O't.o,o~~/~

l?Ol

~/.e.

II-'J°

0, Ot ~11.. 711,0 711,0 --.t'-~ --.t'-~Jt 71',0 t-) "'1 Sf

OJ/e.

)"

~/e.

t,s-

~/e

.

rtJl(.

I

O,O~-

~/e

I Cl ~

-ft:

O~,!ii C;:;:t ~ "'l -.j t7 <;; . ., I'T) ~ _

~~ ~

r

~

} :z,

,

i7 ... Lf'lCToSé ~LU'osE co~'" STEEP 50L/PS

Za..

so",

I - -

~

_1-0,0'2.

~/lJ

_

_

o,

I.f_~

__

.t<''l.

- - - I I - - - -·t-I - - - !

3,0-7,

f

~k

I

7,

~&

'1k

3, ()

~/e

~

~/<

I

₇

_,

_f]C

We

I

_0,

_r

_'}

'2, 0

~~

I

0,

r

We.

J<

1-/₂ PO '1

I1c.lO~t" ~/! 111~ I, ., ~/~l Vl4₁ Si Ol

_h\

~r~/e"

tlo~

_" 0

~/e

r"l

l) s-0;

It

I

~

0,;-

~/l

N. S

u

1

~o,o')~l~rn

...

O,O'l.~

_

a,Ot

~It ~ o,o1~1

r!'

O,O\OJfe

111..,

o,l.~/e

m.,

~C17"'~

(t"''t'

o.cui

I /,0

"ft

I "' ...

·At O,or XCOH J,f.)

'?Ji

~r

<?J/

_f

.

k.-~~)!-r>.C.e+~",1

1, 0

~

Cj tv{ 0

~

'l.

ft (J,'-o,fA~/( Ft

0,'

~/.f -

Fe...,

o,If'I'3A fe? o,tQ°4, f<. 7 0, (Q 'I/~

/1.

S

0; . )(. Hl 0 .

~

D, 'tÇ -

~1

~I~~~

0,

'I(

iff(,

-

1-~-

---

-J--

-

-

-~~

1

~ ~

If

~~

~

1

a,

!T~e

hip

0,

~ ~Ijt ~.,

'(_ c.. ~ __ .. _ ,-(J.,,/~j, .. _ _ _ _ _ _ _ _ _ c" o,oo~~'t .. .. _ _ _ _ _ _ CVi Ooo~L__ '" rIJ> _ - - ' - -0,055/. ._ _ _ (uS _ _

lJ.~O 0 H) 0 O,O~'I/~ ---~---"1 0)

O~ ~/e

0,'1 -: 1>,0 ~ IC 0/ ai

I>;/~.

'-1,7'-

~/e

(),of

CJle

,

q

0 r

~/f.

o,tTJf

0k

Cet

Cll.

.

6

Hl 0

·1 ~.---. - 4.- - - i

n

CSJe.

b

I

Ir

~/l

(NI-I~)

1

$°1

....-

- -

.

---+----

.

-..

-~---.----+---.--

.. -

.

.

-

..

-~

..

l_.-.

_

~d~;~

I

~

~/eJ

.

~~

_{----"·--1---·---1-·}

---:~T-

--~-*-:t

-'J

",

*

*

~1

I

..

_~

." 'if I ~ J4..t (ON,I N IJ 11-~A7CH jf- ~ t-3 Èij t:r;j t:-< ... ... ~ I

r ' L • [

l

,

[

.

1

r . I 1

f

1 l J n 1 l J

f1

n

n

n

n

-12-"cornsteep-liquor"

In de tweede fermentor treedt geen groei van micro-organismen meer op. Er wordt slechts zo veel voeding toegediend als nodig is om autolyse van de micro-organismen te voorkomen.De

hoeveel-heid suiker die hiervoor nodig)is bedraagt 0,022 kg suiker/kg D.S.hr 8)Het totale droge stof gehalte van de ferment or is 15.154=2310 kg Nodig aan suiker: 0,022.2310=50,82 kg suiker/hr, of 8 • 50,82

=

406,56 liter/hr suikeroplossing.

Voor de groei van micro-organismen is behalve suiker ook een aa n-tal zouten nodig. De meeste van deze zouten komen in voldoende mate in maisweek\<later (CSL) voor (sporenelementen Mn, Mg, Fe, Cu ) een aantal moet echter afzonderlijk worden toegevoegd aan het medium ~ (NH4)2S04 en (NH4~2HP04 ~. De hoeveelheid sulfaat die

minimaal nodig is voor de fermentatie kan als volgt worden berekend: sulfaat is nodig voor de opbouw van het penicillinemolecuul.

Per molecuul penicilline 1 molecuul sulfaat. De produktie in de tweede fermentor b~draagt:

-6 6 8 /

~ • 8000 • 0,6 • 10 • 2,2 • 10 = 316 g hr

80

=

3168 = 8,96 Mol/hr 354

Nodig aan sulfaat voor penicillineopbou\v: 8,96 Mol/hr =

= 8,96 • 132

=

1183 g (NH4)2s04/hr = 11,83 liter/hr sulfaatoplossing Aangezien in de tweede fermentor geen groei meer plaats vindt,

is geen sulfa::>.t nodig voor opbouw van nieuw celmateriaal. De hoeveelheid fosfaat die minstens moet worden toegevoerd is als volgt te berekenen. De groei van micro-organismen wordt sterk geremd als het P

20₅ gehalte van het beslag lager is dan 1,5

%

van de droge stof concentratie micro-organismen. Voor de tweede fermentor geldt dus dat het P

20₅ gehalte van het beslag laag moet zijn om de groei van de micro-organismen te remmen. Aangenomen wordt dat het voldoende is als het P

20₅ gehalte 0,15

%

bedraagt. In de tweede fermentor 154 • 15 = 2310 kg D.S.

Aanwezig fosfaat in fermentor 0,15 • 23,1 = 3,465 kg.

3465 /

Uitgewassen: 2,2. 154 = 49,5 g ~265 hr ~ 0,52 g d" l.ammon. /hr Te doseren aan .diammoniumfosfaat: 95,2 g/hr = 1,9 l/hr.

Voor de tweede fermentor wordt geen maisweekwater als voeding

. , . . '

r \ I l..J I .

l..

r

.

l

r .

I

r'

1

r

1 l J

n

r

n

-13-gebruikt. De stikstofbehoefte dient dus geheel door de toegevoegde zouten gedekt te worden.

Stikstof nodig voor OpbOUl'l penicilline:

8,96

r.lol/hr of

1 25 ,

4 g

N

/hr •

al gedoseerd via sulfaat:

0,27

via fosfaat:

0,21

totaal:

1183

=

319,41

g/hr

95,2

=

19,99

g!hr

339,4

g/hr N

Dit is fuim voldoende om de behoeften van de micro-organismen te dekken.

Om het micro-organisme te stimuleren één bepaalde soort penicilline te produceren l'10rdt een precurser toegevoegd. Voor het ma..lcen van benzylpenicilline komt als precursor het meest in aan merking

het nntriumzout van fenylazijnzuur. Hoewel dit zout door het micro-organisme wordt gebruikt, mag de concentratie niet te hoog zijn, omdat het in hoge concentraties giftig is voor het micro-organisme. Minimaal moet gedoseerd worden:

8,96

Mol precursor/hr =

=

8,96 • 146

=

1308,16

g precursor/hr

=

13,08

liter oplosstng/hr

De totale voedingsstroom naar de tweede fermentor bedraagt:

406,

5

6

+

11,83

+

1,90

+

13,08

=

433,37

l!hr

In de eerste fermentor '\vorden de micro-organismen gekweekt tot een droge stof concentratie van

20

gil. Er wordt ui tgel'laaSen uit de tweede fermentor

2,2 • 15

0

00

=

33000

g m.o./hr. Toe te voegen uit de eerste reactor

33000

g m.o./hr of

1650

liter cultuurvloei-stof. Het totale volume vloeistof dat de reactor binnenstroomt moet bedragen

2200

liter, zodat nog gedoseerd moet worden a2n gedestilleerd water:

2200 - 1650 - 433,37

=

116,63

liter/hr.

e

Voedingsstromen 1 fermentor

De eerste fermentor heeft als hoofddoel de produktie van micro-organismen. In de stationaire toestand moet de concentratie micro-organismen

20

gil bedragen. Per uur wordt

33000

g micro-organismen naar de tweede fermentor afgevoerd, zodat de produktie aan nieuw celmateriaal eveneens

33000

g/hr moet zijn. De

gemiddel-de verblijf tijd in gemiddel-de eerste fermentor bedraagt

-

~

50

hr

7).

Net

tv

=

1,65

m

3

/hr

l~vert

dit een onbelucht beslag volume van

82,5

m

3•

De totale hoeveelheid micro-organismen in de fermentor is:

I

r '

r:

r~

l,

rOl , I l )

~

1

r1

r~

-14-82,5 • 20 = 1650 kg

De fermentatie \olordt suikergelimiteerd uitgevoerd. Volgens f3irt,

Trinci en Righelato 6) 8)is de te doseren suikerhoeveelheid 2,3

maal de te bereiken concentratie micro-organismen.

Dus nodig aan suiker:

2,3 • 20

=

46 kg suiker/ m3 voeding =

46 • 1,65 = 75,9 kg suiker/ hr

=

607,2 liter oplossing/hr

De hoeveelheid maisweekwater die wordt toegevoegd is meestal 1,5

maal de gedoseerde hoeveelheid suiker = 69 kg CSL/m3 voeding=

= 113,85 kg CSL/hr (vaste stof). Maisweebrater bevat 50 gew% vaste

bestanddelen. Toe te voegen dus 227,7 kg /hr

=

100 liter.

Sulfaat is nu niet alleBn nodig voor de opbouw van penicilline,

ma.ar ook voor de OpbOU~1 van micro-organismen. Het zwavelgehalte van micro-organismen is 0,5 gew%.

Nodig aan sulfaat:

0,5 •

3?g

gï

.

1~~

=

680,6 g (NH4)2s04/hr = 6,8 liter opl./hr

~

• 8,96 • 132 = 2760 g (NH4)2s04/hr =27,6 liter öpl./hr

!J.'otaal sulfaat nodig: 3440,6 g/hr = 34,4 liter opl./hr

Fosfaat is nodig om voldoende groei van micro-organismen te ver-krijgen. Minimaal fosfaatgehalte van het beslag moet zijn 1,5

%

van de droge stof ( als P205 ).

Gewicht nieuw gevormde micro-organismenin de fermentor: 33 kg

Nodig aan fosfaat:

1000 ,.. ( ) / /

1,5 • 0,33 • 0,52 = 9)2 g NH₄ 2HP04 hr = 19,04 1 hr.

De stikstofbehoefte van de micro-organismen is weer tweeledig;

opbouw penicilline:

.2§.

24 • 8,96 • 14 = 293 g N

/

hr

opbouw micro-organismen (aangenomen stikstofgehalte m.o. 6,4

%

)

6 , 4 • 330

=

211 2 g N /hr totaal: 2405 g N/hr.

Het stikstofgehal te van maiS\veekwater is 3 tot 4

%

van de vaste bestanddelen.

Reeds gedoseerd via CSL: 3 •

1~8ó85

• 1000 = 3415,5 g N/hr. Dit is ruim voldoende om in het benodigde te voorzien.

Tenslotte is nodig een hoeveelheid preaursor:

.

.,.

, " "

r '

l.

L

[

,

r .

I

r

'

I

l'

"

l

l I

rl

I

_{

-15-~!

.

8,96

• 146

=

3050

g/hr =

3

0

,5

liter/hr

Totaal vloeistof in:

607,2

+

10

0

+

34,4

+

19,4

+

30,5

=

791,5

I/hr.

Nog toe te voegen gedestillerd water:

165ö - 791,5

=

858,5

I/hr.

Overzicht voedingsstromen

stof

1

e fermentor

2

e fermentor · totaal ton/jr

voor de

kg/hr ton/jr kg/hr ton/jr kg/hr ton/jr hele

fabriek sucrose

75,90

664

50,82

446

126,72 1110

7770

CSL

113,85

997

113,85

997

6979

(NH

₄₎₂

S0 4

3,44

30,1

1,18

10,3

4,62 40,4 282,8

(NH

_{4 )2}

HP

04

0,95

8,32

0,095

0,83

1,045 9,15 64,05

Na-fenylacetaat

3,05

26,7

1,31

11,5

4,36 38,2 267,4

water

858,5

7520 116,63

1020

975,13 8540 59780

wate8 _neer ~e~ombi!. ~20,7 _{e voe 1n}

6330 378,0

3518 1098,7

9848 68900

Beluchting

De fermentatie van Penicillium chrysogenum dient te worden

uit-gevoerd onder ruime zuurstofvoorziening, aangezien het gebruikte

micro-organisme verplicht aeroob is. De zuurstof wordt in de

fer-mentor gebracht door lucht in het beslag te pompen via

geperforeer-de pijpen die ongeperforeer-der geperforeer-de roergeperforeer-der zijn aangebracht (zie figuur

3).

De ingevoerde lucht dient eerst te "lorden gesteriliseerd.

Berekening van de hoeveelheid lucht die moet worden gedoseerd

is een moeilijke zaak. De hoge viscositeit van het beslag

veroor-zaakt een enorme coalescentie van luchtbellen. Zo blijkt in een

visceuze vloeistof met een viscositeit van

100

cP, "raarin bellen

van

3,5

mm met een stijgsnelheid van

20

cm/ s l'"lorden geproduceerd,

coalescentie reeds op een afstand van

120

cm van de

beluchtings-plaat een feit te zijn.

9).

Gezien de veel hogere viscositeit

bij de penicillinefermentatie is het niet onwaarschijnlijk dat

11 L~

-16-L

l

:

STANDAARDAFMETINGEN

FERMENTOREN

[

:

r'

_e 2 fermentor

[

:

0,1 DT

r~

l'

1/3 DT

l:

0,1 DT

[

.

.

2 Drp

[

.

r .

e

1

fermentor

l.

1

0,1 DT

I

r

-1/3 DT

'

.

~

0,1 DT

rl

1 _{2_Dtp-... _.}

.

n

n

figuur

3

n

l.

I

L-I r ~, I L • I

l .

I

l ,

[1

n

n

n·

r

r

-

-17-al na één meter stijgen de luchtbellen een diameter hebben van enige centimeters. Het voor stofoverdracht beschikbare beloppervlak wordt daardoor zeer sterk gereduceerd, waardoor de uitputting

van de bel vrij gering zal zijn. We nemen aan dat deze uitputting

5

%

bedraagt.

Uit de literatuur

8)

is bekend hoeveel zuurstof nodig is voor de produktie van 1 kg celmateriaal:

yo

=

0,05 g D.S./mmml 6₂,

2

De produktie aan nieml celmateriaal in de eerste fermentor bedraagt

33

kg/hr. Er is dan nodig aan zuurstof:

E

_{50 •}

₃₃

₌

2 _1,1 2 _kg

° /

_{2 hr = 0,288} 21,12 ₌

_73,3

NT _{m lucht r.} 3

/h

Uitputting

5

%,

dus totaal in te blazen lucht:

20 •

73,3

= 1466 Nm

3

lucht/hr.

1466 Nm 3 lucht/hr =

1@g6

Nm 3 lucht/min = 1466 = 0,3 VVM

60 • 82,5

Geschat wordt dat de verblijf tijd van de bellen in de fermentor ongeveer 30 seconden zal bedragen. De gas holdup van de fermentor wordt dan 15

%.

Het beslagvolume in de eerste fermentor tijdens beluchten is dan

97,2

m

3•

In een beperkt gebied rond de roerder Ylordt het beslag rijkelijk voorzien van zuurstof ( vrij\olel verzadigd ). Ditzuurstofrijke beslag \"ordt door de roerderwerking in de bak rondgepompt • Tijdens de circulatie van het beslag in de fermentor zal er nog maar y;einig

zuurstofoverdracht van de grote luchtbellen naar de vloeistof zijn. De micro-organismen zijn buiten het roerdergebied dus volledig afhankelijk van de zuurstof die in het roerdercompartiment is overgedragen. Om te voorkomen dat zuurstofdeficientie optreedt moet de mengtijd in de fermentor laag gehouden worden.

In de tweede fermentor is het zuurstofgebruik van de micro-orga-nismen tengevolge van het stoppen van de groei veel geringer. Righelato 8) vond hiervoor 0,24 mmol 02/g D.S.hr. De hoeveelheid zuurstof die in de tweede fermentor nodig is wordt dan:

/ 0,24 . 154000 15 /

0,24 • 154000 • 15 mmol 02 hr - 1000 • mol hr

=

0,24 • 154000 • 15 • 200 Nm3 O~/hr =

f-:

1

L, L .

r

fl

n

n

r

r

-18-0,24 • 154000 • 15 • 200 • 5 hl 3 1 ht/h = 1000. 1000 •

9

Hm uc r

61,6

Nm

3

lucht/hr

6~Ó6

Nm

3

lucht/min

Uitputting van de lucht is

5

%,

dus nodig: 20 60

61

,6

Nm 3 lucht/min

=

0,135 VVM.

De holdup van de reactor is , als de verblijf tijd van de bellen in de fermentor op 30 secondeh wordt gesteld:

1 ( )

~

30· 1 -

f

.

154

=

1 80

(1

-E)

=

0,07 Het beluchte bakvolume wordt dan

166

m

3•

Kinetiek

Voor de groei van micro-oreanismen geldt in het algemeen RJol

=

functie (

CM'

c s ) . R

M, het aantal kg biomassa geproduceerd per m

3

per seconde, is een functie van de concentratie micro-organis-men en de groeilimiterende substraatcomponent.

Voor de eerste ferment or luidt een massabalans voor de micro-organismen: pv. CM

=

RN • V •

Volgens Constantinides 31 )32) is een model voor de groei van

1-Penicillium chrysogenum

R}i

=

b

1cM - b2dM

De produktie van penicilline kan worden beschreven met Rp = b

3cM - b4cp •

De produktvorming blijkt vrijwel onafhankelijk te zijn van de groei of het substraatgebruik. De produktvorming is niet-groei-ge·Associeerd.

Het model van Constantinides is opgezet voor batchgewijze pen i-cillinefermentatics. De toepasbaarheid voor continue processen is niet duidelijk.

Pirt en Righelato

6)

onderzochten de kinetiek van de produktvor-ming in een continue reactor. Zi j kl.;amen tot de formule

b

c

=

-2 .

CM

P

.fA

R voor een fermentor l-laariu. de micro-organismen _{p .} nog groeien, en tot Rp

=

Rp(O) - kt voor een fermentor waarin alleen nog de "maintaina.ncc ratio" aan voeding l>lerd gedoseerd

, 1 l~ r • l _ r

L

f .

l

n

n

n

I'

l J

r

-19-micro-organismen beschreven zij met het Monod-model.

Hoe bruikbaar deze vergelijkingen ook zijn, in de praktijk blijkt er toch iets niet volgens het model te verlopen

5),

zodat voor dit procesvooront\':erp is afgezien van een produktberekening via

een model. De produktconcentratie in de reactoruitlaten is geheel arbitrair vastgesteld.

Morfologie

Schimmels groeien in industriele submerse cultures meestal onder zodanige condities dat ze een uitelijk krijgen van lange draden met vertakkingen, zgn. mycelium. Onder specifieke conditeis, die momenteel nog niet volledig bekend zijn, kan een schimmel echter ook bolletjes celmateriaal gaan vormen, zgn pellets. Pirt en

Callow 10) vonden in 1959 dat beven een pH van 8,0 de pelletvorm overheerste. De omstandigheden bij de incubatie blijken van belang te zijn, evenals de voeding tijdens de fermentatie.

Het belangrijkste technologische verschil in de beide

groeivor-men van de schimmels v!ordt veroorzaakt door de invloed van de morfologie op de viscosi tei t. Bij een fermentatie \olaarbij de my-celiumvorm optreedt,loopt de viscositeit op tot 2000 cP en hoger; de viscositeit bij pelletgroei is veel lager, en wel circa 20 cP. Ondanks dit enorme verschil in viscositeit moet voor een continue fermentatie toch gekozen worden voor de myceliumvorm. Een constante concentratie micro-organismen is met pelletgroei niet te realiseren.

10) Bovendie is de penicillineproduktie lager wanneer pellets optreden •

Aangezien de optimale pH voor groei van mycelium niet samenvalt met die voor de penicillineproduktie, wordt in de eerste fermentor

een andere PH ingesteld (pH

=

7 )

dan in de tweede (pH

=

7,4).

Rheologie

Een direct gevolg van de keuze van een myceliumcultuur is een cultuurmedium met zeer hoge viscositeit. Behalve hoog-visceus is het medium echter ook nog niet-newtons. Deind"órfer en Gaden 11) concludeerden uit metingen dat het penicillinebeslag zich gedraagt

7 . ! 1 I L_ L •

L

n

i

j

1

_l l

n

r

r

-20-dan eerst een bepaalde waarde hebben bereikt voordat stroming

optreedt:

dV}!

T xy.!.

-r

0 =

-?

dJ

Ook met de empirische vergelijking van Ost~"ald-de Waele (de power-law vergelijking) kan het gedrag van het beslag worden beschreven, zoals Bongenaar, Kossen, Metz en Meyboom

34)

vonden:

dv

r

= K (

--Y..)

xy dx

n-1 dv

( - dl)

De constanten K en n hebben waarden die afhankelijk zijn van de concentratie micro-organismen en de ouderdom van het beslag. Voor di t procesontwerp ~Torden de volgende waarden gebruikt:

n/

2

K

=

13,3 Ns m en n

=

0,23.

Het Reynoldsgetal voor een po\.,erla\'l vloeistof in een geroerde

tank kan Horden geschreven als:

n 2-n

Re

=

Dli N

î·

8(_n_)n

g K 6n+2

Verschillende andere Reynoldsgetallen zijn in gebruik voor niet-ne\'ltonse vloeistoffen. Zo gebruiken Gluz en Pavlushenko

35)3

6

):

D

~ .2-n

Re = R N K

~.

(4TT) 1-n

De viscositeit van het beslag is zeer belangrijk in verband met de menging iIl de fermentor. De micro-organismen zijn verplicht

aeroob. Als ze te lang zonder zuurstof moeten leven gaat zuurstof-deficientie optreden. De mengtijd in de reactor mag daarom niet veel langer zijn dan 1 à 2 minuten. Om een goede meneing te

garanderen wordt gemoerd met een turbineroerder. De afmetingen

van de roerder t.o.v. de ferment or zijn volgens standaard (zie figuur

3 ).

Bij niet-newtonse vloeistoffen is de schijnbare viscositeit (7a) bij lage snelheidsgradienten het grootst, zodat de

vloeistofbewe-ging van de roerder af veel sneller afneemt dan bij newtonse vl

oei-stoffen. Het Re-getal moet daarom greter zijn dan een bepaalde minimumvaarde, voordat alle vloeistof in het vat in beweging is12). Voor 2 standaardturbineroerders op één as op een afstand DT van

elkaar bedraagt dit minimum ReTgetal

85.

Aangenomen dat7a = 2000 cP ( in de praktijk blijkt de viscositeit

I 1 L , l.

[

~

r .

l.

11

t

1

II

n

n

r

I

I

-21-niet veel verder op te lopen dan deze waarde) moet het minimale toerental van de roerder zijn:

N 85 • ?a

~

• D2 R

=

85 • 2 • 9 _{1@ • 25}

=

°

_' 058 s -1

=

3,5 min -1 ( voor de 2 e ferm. )

N

=

~,r~~~

=

0,082 s-1

=

4,9 min-1 (voor de 1e ferm.)

Behalve een goede cirkulatie van het beslag in de fermentor is ook een goede dispergering van de ingeblazen lucht een vereiste. Zwietering 13) geeft voor berekening van het minimale dispergerings-toerente.l de formule:

=

16 ( N2 :IJ R g D ) (_R ) 3,3

DT

, of

Voorde eerste fermentor : D

R = 4,2 m

3

=

En voor 9,81 • 36,2 • 1466 16 3,85 3600 de tweede fermentor:D R=

22

81

.

3622

.

61

2

6

.

20

N .

m1n 5/3 m 1,4 m = 1,33 en

ai

-v -1 s ;,; _ 1466 N 3 1 uCht/s l'v - 3600 m 61₂6

.

20 m3/s 3600 -1

n

3 . ₁₆ N

₌

0,99 7,73 3600 min s m1n

.

.

Voor de eerste fermentor nemen vle een l-.'erktoerental aan van 90 per minuut, en voor de tweede fermentor een werktoerental van 70 per minuut.

VermO,9:'E'nsconsumptie van de roerders

Bij de gebruikte roerdertoerentallen is het Reynoldsgetal altijd groter dan 100. Uit figuur 9.6 van Skelland 14) volgt dat het vermogenskental van de roerder dan gelijk is aan 6,5. Het door de roerder opgenomen vermogen in onbeluchte toestand is dan te berekenen met:

p

=

PO'

~

• N 3 •

D~

Voor de eerste ferment or levert dat: P 6,5 • 10~ • 3,375 • 5,37 = 125 kVl.

I 1 I L .J I l ,

I

r

~

fl

I l J

n

n

n

-22-, En voor de tHeede fermentor

P = 6,5 • 10$Ó • 1,59 • 12,9 = 141,5 kW

Voor twee roerders op één as wordt het onbeluchte vermogen

v:2

maal zo groot.

1e ferm. 177 kW 2e ferm. 200 kW

Wanneer beluchting van het beslag gebeurt door inblazen van lucht omder de roerder heeft dit een aanzienlijke reduktie tot gevolg van het benodigde roerdervermogen. De invloed van beluchten op het roerdervermogen is alleen bestudeerd voor newtonse systemen. Herberichs 15) geeft voor de invloed van beluchting de volgende formule: p ~=e P ( 1- (

~v

_G

-i-+ N D

_{3 )}

R

Als benadering kunnen we deze formule ook gebruiken voor een belucht penicillinebeslag.

J)v

1e ferm.: 1-E +

~

N

n

3

R m.b.v. figuur 5-7 uit P ~ _P

_=,

03 _{4 •} 1466 • 1 = 0,15 + _{3600.1,5. 2 ,74} = 0,25

collegediktaat Biochem. techn.:

Het te installeren roervermogen moet dus minimaal bedragen:

0,34 • 177 = 61 kW e 2 ferm.: 1-( P gas 0 65 P

=,

Iv

_G +

-N

n

3 R

O

,07' + 61,6 • 6 • 9 60 • 3 • 7 • 125

=

0,09

Het te installeren roervermogen moet dan minimaal bedragen:

0,65 • 200 = 1 30 kH

Warmteproduktie en afvoer

Bij technisch uitgevoerde biochemische processen is de afvoer

van tijdens de fermentatie geproduceerde warmte bijna altijd een

probleem. De reaktortemperatuur is meestal niet hoger dan 40 oe

(bij penicillinefermentatie slechts 25 oe ) Koelen met water is

", i -~ 1 i , I' 1 '1

'

;

I

LJ r .

l

.

r'

I

f'

l .

~l

n

n

"':23-economisch het meest aantrekkelijk. Tengevolge van de lage reac-tortemperatuur is de drijvende kracht voor warmteoverdracht vrij klein, zodat grote hoeveelheden koelwater zijn vereist. De warmte-overdrachtscoëfficie·nt voor geroerde tanks is bovendien betrekkelijk laag als de reactorinhoud erg visceus wordt.

In dewarmtebalans voor de reactoren komen de volgende termen voor: 1) produktie van warmte door biochemische reacties, roeren,

con-troleren van de pH m. b.v. loog en verdamping van .. Tater ( nega-tieve produktie )

2) ingaand warmtetransport door toegevoerde lucht en substraat

3)

uitgaand warmtetransport door afvoer lucht en produkt en door geforceerde koeling aan de \'Tand en/of via een koelspiraal Beide reactoren worden tijdens de gehele fermentatie op een

tem-o

peratuur van

25

C gehouden. Voor de eerste ferment or:

1)

Bij de produktie van

100

gram celmateriaal (D.S.) komt ongeveer

383

kcal warmte vrij

9).

In de gehele fermentor is dat per uur:

330 • 383

=

126390

kcal

=

35,11

kcal/s

=

147,6

kW

Het totale ingebrachte roervermogen wordt verondersteld als warmte in de fermentor weer vrij te komen.

roervermogen =

61

kW

De hoeveelheid warmte die \'lordt ontwikkeld met flH correcties met loog \"I1ordt als v8n"marloosbaar beschouVid.

Beluchting van de fermentor gebeurt met droge lucht. Tijdens de tocht door de fermentor neemt de lucht echter water op en komt er verzadigd weer uit. De hoeveelheid warmte die nodig is voor de verdamping van dit

~ ~

3/

îv

=

3600

m s

G

Hater bedraagt:

; flucht=

1,27

kg/m

3

verdarnpirp"'T8.rmte =

585

kcal/kg

,c

=

1,18

Jjkg

oe

p

te verdampen

0,024

kg H

2

0/m

3

lucht

16)

1466

Nodig aan \'larmte:

3600 • 0,024 • 585 • 4,2

=

24

kH

De totale warmteproduktie in de eerste ferment or wordt hierdoor:

147,6

+

61 - 24

=

184,6

kW. . . ,,"

2) De voeding \'lordt op reactortemperatuur aangevoerd, zodat hierdoor geen extra warmte wordt ingebracht. De vrarmte die nodig is om de ingeblazen lucht te ver",mrmen is ver\'laarloosbaar.

:'

_.

~"1

I 1 L .

!

_{l .}

f'

r'

r;

r '

I l

[ 1

[1

[1

r

-24-3) De uitgaande stromen lucht en produkt verlaten de reactor met

dezelfde temperatuur als ze waren binnengekomen. Het netto

ver-warmings- of koelingseffect is hierdoor nul.

Koeling van de fermentor met water wordt het liefst uitgevoerd

via wandltocling. Aan de bui tem ... and van de fermentor is een

koelmantel aangebracht, wa.ardoor koehlater stroomt. De

hoeveel-heid warmte die door het koelwater kan worden afgevoerd is:

LlT

gem

A

=

TT. DT • ~

=

TT. 4,2 • 8,4

We gebruiken koelwater van 10 oe ( oppervlaktewater). Gedurende het grootste deel van het jaar is de temperatuur van

oppervlakte-water hoger dan 10 oe. Als dit het geval is wordt gebruik gemaakt

o

van een voorkoeling van het koehrater tot 10 C.

o

Als het koelwater in de koelmantel wordt opgewarmd tot 22 C,

dan is LlT

.

.

gem ÓT 22 - 10 22 + 22 7,45 oe 2;2 - 10 = gem In 25 22

De minima.le overall warmteovc:rdrachtsco'èfficïênt moet dan zijn:

Dw

U =

---.;.;.--A • óT _gem

=

184,6 • 10 3 111 • 7,45

De \'larmteoverdrachtsco'êfficïEmt aan de beslagzijde kan met de

volgende formulê 35)36) worden berekend: 37 )

o<.DT

~-f-.

n2-n,D2 (47T)

1-n~

0,67

~

e K n-1 (

~

Á 0,215 K

n

l' N 4 TT)n-1

~

K "1

~

0,18 K . 2 n

=

0,23 K ::: 13,3 Nsn/m 0,67

0<

=

~,6

T. -1 N = 1,5 s ; DT = 4,2 m 4,2/3 m 0,33

I

( 1 L.~ ( ,

l.

r

1..

,

r ..

[

[

.

r'

[

:

n

n

n

I'

-25-_~ _ 0,6 • 0,215 • 177 • 25,4 • 0,98 ~ - 4,2

De \'larmteoverdrachtsco'ëfficïènt aan de bui tenzi jde van de

fermen-tor is 638 tot 1173 w/m2

°c

voor koelwaterstromen van 1,199 lis

~ot

7,685 lis 38).

De dikte van de roestvrijstalen fermentor~!and wordt ,gesteld op

1 cm •

À

_{s aa} t 1

=

50 H/m

°c.

Hierme~ wordt de overall \·!armteoverdrachtsco·èfficïént

1 1 10-2 1

U = 136 + 50 + 750 = 0,008858

o

Reeds berekend Ras dat U minimaal 223 Td/m2 {) moest zijn.

Een koelmantel is dus nfet in staat voldoende koeling te geven.

Een andere (duurdere) mogelijkheid is koelen met een koelspiraal.

De \'larmteoverdrachtsco'ëfficïënt aan de bui tenzi jde van de spiraal

is te berekenen met de formule:

33)

2 À ,

f·

N • DH } rÁ

=

Cl .

0, 0675

~

I? , 0,607 _{,Cp '\}

_na

_{~ 0,345.} ~ 0 11 (i , (Vi)0,20 c (a

Hierui t volgt een

0<

voor de koel spiraal:

=

0,27 • 87,5 • 27 • 0,98 • = 625 W/m

2

°c

4' ~

De overall warmteoverdrachtsco~ffici~nt wordt nu

-2

1 1 0,5 • 10 1 2 0

U = 625 + 50 + 1000

= 0,002700

U

=

370

vJ/m

C

Een koelspiranl blijkt \'1el voldoende te kunnen koelen. Het koelend

oppervlak v,m de spiraal is namelijk ongeveer even groot als het

wandoppervlak van de fermentor~ spiraal met 20 ~Tentelingen met

een spiraaldiameter van 0,15 meter en een 'r1entelingsdiameter van

3,7 meter. Oppervlak A = _{• 0,15 • • 3,7 .20 = 109 m •} 2

Maximaal af te voeren ~'Jarmte via Jtoelspiraal:

~w

=

370 • 109 • 7,45

=

300 kW.

Dit is ruim voldoende.

De hoeveelheid koelwater die nodig ia om de eerste fermentor te

koelen bedraagt: 2J84,6 = 2 lis •

• 4,2 Voor de tweede fermentor:

1) In de tweede ferment or vindt geen opboU\'T van nieuw celmateriaál

plaats. Alle suiker die wordt toegevoerd wordt door de

micro-organismen gebriukt voo~ het in stand houden van het eigen

weef-i

,

! 1 I L .1 (

.

!

L •

r

'

I

[ I r ' I I.

r'

I ,

r'

_I l I n

II

1

1 I r I i

-26-sel. Volgens Righelato 8) \'Tordt hierbij slechts de' helft van de toegevoerde suiker verbrand tot CO

2 en H20. De warmte die daardoor vrijkomt

0,5 • 50,82 • 1350 ; 4,2 • 10 3 352 • 3600

is:

= 114 kIL

De Narmte ingebracht door roeren i s : 130 kW

De hoeveelheid lucht die in de tweede fermentor wordt gebruikt

is 0,85 maal de hoeveelheid lucht voor de eerste fermentor. De hoeveelheid warmte die nodig is om deze lucht met waterdamp

te verzadigen is: 0,85 • 24

=

20,2 kH.

Totale vlarmteproduktie in de tvJeede fermentor: 114 + 130 +

° -

20,2 = 123,8 kW.

2) Voeding '\-lOrdt op rea.ctortemperatuur aangevoerd.

3)

Ook voor de tweede fermentor blijkt wandkoeling niet te voldoen. Het koelend oppervlak van de fermentor is

2

A := Ti. DT • HT

=

TT.

5 • 10

=

157 m •

~T _gem

=

7,45

oe

De overall l-larmteoverdrachtsco"ëffici'ént moet minimaal bedragen:

}w

= 223,8 • 1000 _ 191 5

wl

2

°c

A. 11 T 157 • 7 45 - , m •

~ gem '

u

De warmteoverdrachtscoêffici~nt aan de beslagzijde is : / 20

=0,12 .0,215 • 165 • 32,01 • 0,98 = 133,6 \rl m C.

De vereiste overa.ll '\'larmteoverdrachtsco"éfficïént kan hiermee nooit

worden bereikt.

De \olarmteoverdracht sco"éfficïënt aan de bui tenzi jde van een spiraa.l

is: fÁ

=

0,27 • 91 • 27 • 0,98 = 650 H/m2

°c.

De overall warmteoverdrachtsco~ffici~nt 1 1 0,5.10

Ü

= 650 + 50 -2 1 + 1000 Dit is ruim voldoende.

=

0,002638

De hoeveelheid koelwater die nodig is 223800 22. 4,2 2,42 lis l-lordt nu:

·

1

1:.· 'i :

r •

[-[

~

[

:

n

II

n

n

n

-27-Opstarten

Iedere keer als een cascade uit produktie moet ( omdat een fer-mentor is besmet geraakt, of omdat door andere oorzaken de peni-cillineproduktie afneemt of helemaal stopt), moeteh beide fermen-toren van de cascade ",orden leeggepompt, schoongemaakt en gesteri-liseerd. Hierna moet het proses weer opgestart worden. Opstarten vindt op de volgende manier plaats.

Vanaf het moment dat een cascade uit produktie gaat, wordt in een entfermentor van 1 m3 een nieuwe fermentatie op gang gebracht. In deze entfermentor wordt batchgewijze mycelium gekweekt. Als de micro-organismenconcentratie 30 mg/ml is, wordt de inhoud

over-gepompt naar een tweede entfermentor van 10 m

3.

Als in deze tweede

entferrnentor de micro-organismenconcentratie wederom 30 mg/ml

is gm'lOrden, dan wordt de inhoud overgebracht in de eerste

fermen-tor van de cascade. In de tijd die nodig is om in de entfermento-ren voldoende celmateriaal te kweken, kunnen de produktiefermen-toren "lorden leeggepompt, schoongemaakt en gesteriliseerd. Hier-voor heeft men on{;eveer 10 uur nodig. De eerste fermentor wordt vervolgens gevuld met voldoende voeding, om, na enting, in een

bél.tch-gewijze fermentatie binnen 20 uur een micro-organismenconcentratie

van 20 mg/ml te verkrijgen.

Als een concentratie van 20 mg/ml is bereikt, wordt de continue voedingstoevoer gestart. Tevens wordt nu

1,65

m

3

/hr uit de groei-fermentor afgetapt in de produktiefermentor. Ook de voedingsstro-men van deze tweede fervoedingsstro-ment or worden nu gestart.

Gedurende 70 uur \vordt deze situatie voortgezet. Na 70 uur is de hlpcde fermentor vol. Vanaf dit moment ",ordt 2,2 m

3

effluent ui t de hleede fermentor afgetapt. In principe is hiermee de

op-startperiode afgelopen. Het kan dan nog enige tijd duren voordat de fermentoren stabiel·zijn.

De totale opstartperiode duurt dus 10 + 20 + 70

=

100 uur.

i

L

[ . ( .

n

n

n

-28-Sterilisatie voeding en lucht

1) voeding

Gezien het continue karakter van de hele penicillinefabriek is

het vanzelfsprekend dat de Bterilisatie ook continu gebeurt.

Daarvoor wordt de volgende apparatuur gebruikt (zie figuur

4).

De niet-sterile suikeroplossing ~lordt met behulp van stoominjectie

veflmrmd en in een ~1armte~Iisselaar op de vereiste temperatuur

gebracht. Voor het afsterven van schadelijke micro-organismen in

de voeding is een bepaalde verblijf tijd nodig in de sterilisator.

Die tijd wordt bereikt door de voeding door een lange buis te

sturen. Daa.rna vindt afkoeling plaats door warmte\'lisseling met

koude voeding. Een koeler zorgt dan nog voor terugbrengen van de

temperatuur tot

25

°C.

Continue sterilisatie heeft het voordeel dat volgens het

"kort-hoog" principe kan worden gewerk~, waarbij het voedingsmedium

korte tijd op hoge temperatuur kan vlOrden verhit. Opl.;arm en

af-koelperioden zijn zeer kort. De voedingswaarde van het medium

gaat door deze behandeling minder achteruit dan door batchsteri-lisatie.

Een probleem va,n continue sterilisatie is dat het medium niet

als een propstroom door de buizen stroomt, maar een verblijf

tijd-spreiding vertoont. Hierdoor wordt een gedeelte van de voeding

oververhit. Hoe meer de ideale propstroom wordt benaderd, des te

minder oververhitting er optreedt.

Voor het onschadelijk maken van micro-organismen geldt de volgende formule:

dn

dt

=

-kno (hierin is k=kO • exp(-E~RT) )

De materiaalbalans van de micro-organismen in een sterilisator

(rechte pijp)is dan: 11)

2

ID dn_"V' dn kn=O

1 dx2 dx

( .

I

l .

L

l

~

L

r

L

l"

I

.

1:

r

j"

I:

[~

(

~

n

n

~

n

r

r

-29-STERILISATIE APPARATUUR

koeler water stoom niet steriele oplossing warmte-wisselaar figuur 4 holding coil

11

( . I l _

r

n

n

n

n

30

-hierin is

~eV+~'

vBo en Bo'

_{ID .}

v 1 I / k L In figuur

5

is de sterilisatiegraad n n

O uitgezet tegen

-=-

met

als parameter Bo. v

Voor zeven fermentorcascades moet een hoeveelheid sucroseoplossing worden gesteriliseerd van 7,1 m3/hr.

?

=

1050 kg/m3

?

=

5 kg/m.hr Cp

=

1 kcal/kg oe

He gebruiken een sterilisatietemperatuur van 130 oe en een pijp

met Db = 3" = 7,62 cm binnendiameter. He injecteren stoom direct

in de pijp, zodat de temperatuur vrijwel direct op 130 oe is.

Voor de berekening gebruiken \'le als standaard micro-organisme

Bacillus stearothermophilus. Voor dit micro-organisme geldt:

en E = 67,7 kcal/mol

a

Bij 130 oe ;s dus k _ 10 36 ,2 _{• - • exp} ( _ 67,7 • 10_{403 • 1,98} 3 )

k = 0,538 s -1

Doorsnede van de pijp is: S

= ;-.

(0,0762)2 4,56 • 10

-3

~v

v

=""8

7,1 • 10

3

3600.4,56

=

0,433

mis.

Dan is Re = 1050 • 0,433 • 0,0762

-3

1,4 • 10 Volgens Levenspiel 18) is dan:

IDI

0,27

V

L

V

D L

4

= 2,47 . 10 . Bo =

ID

=~. 1 1 1 0,27 • 0,0762 2 m •

Als eis stellen we

=

10 -16 • We nemen een waarde aan voor L

van ;;30 meter.

k L

-

_v

Bo = 1000

0,538 • 30

0,433

=

37,2 • Uit figuur

5

volgt dan:

L = 0,27 • 0,0762 • 1000 = 20,6 meter.

Na enig trial and error rekenwerk blijkt de lengte van de pijp

ongeveer 25 meter te moeten zijn. De sterilisatietijd bedraagt

dan: L v

=

25 0,433

=

57,7 seconden. I

1