Ocena kondycji zbiorowisk mikrofitobentosu jako metoda monitoringu zanieczyszczeń w Morzu Bałtyckim
Zuzanna Sylwestrzak, Aleksandra Zgrundo, Justyna Jurowska, Sylwia Śliwińska, Filip Pniewski, Adam Latała
Instytut Oceanografii, Uniwersytet Gdański, Wydział Oceanografii i Geografii, Al. Marszałka Piłsudskiego 46, 81 - 378 Gdynia, z.sylwestrzak@ug.edu.pl
Wstęp
Do Morza Bałtyckiego w wyniku działalności człowieka trafia wiele substancji chemicznych, które w różnym stopniu mogą przyczyniać się do pogarszania stanu środowiska. Obecnie prowadzi się wiele badań poszerzających wiedzę o stanie i zagrożeniach środowiska Morza Bałtyckiego, a nowoczesne techniki stosowane w monitoringu pozwalają na wczesne wykrycie źródeł ryzyka dla tego specyficznego akwenu.
Do szacowania ryzyka jakie niesie wprowadzanie nowych substancji chemicznych do środowiska wodnego służą między innymi powszechnie prowadzone na świecie testy toksykologiczne na mikroorganizmach roślinnych wyizolowanych ze środowiska i przetrzymywanych jako monokultury. Hodowla całych zbiorowisk jest rzadko spotykana chociaż w łatwy sposób pozyskuje się je ze środowiska w celu wykorzystania w testach ekotoksykologicznych (Dahl i Blanck 1995, Blanck i in. 2009, Sylwestrzak i Zgrundo 2014, Sylwestrzak i Pniewski 2014). W ten sposób testowano wpływ na środowisko morskie różnego rodzaju substancji pochodzenia antropogenicznego, między innymi: substancje i farby antyporostowe (Blanck i in. 2009, Arrhenius i in. 2014) czy lekarstwa (Pérez i in. 2009).
Testy na zbiorowiskach pozwalają na uzyskanie informacji dotyczącej odpowiedzi organizmu na substancję toksyczną zbliżonej do tej, która może wystąpić w jego naturalnym środowisku w obecności czynników biotycznych nie uwzględnianych w klasycznych testach jednogatunkowych. Do rozwinięcia i zweryfikowania metody opierającej się na testach ekotoksykologicznych prowadzonych na całych zbiorowiskach mikrofitobentosu wykorzystano substancje toksyczne z trzech grup związków chemicznych: chlorek miedzi (II), herbicyd Roundup i ciecz jonową [BMIM]Cl, których działanie na jednogatunkowe kultury glonowe jest stosunkowo dobrze poznane. Miedź w reakcjach enzymatycznych bierze udział w przenoszeniu elektronów i dlatego w niewielkich ilościach jest pierwiastkiem niezbędnym do wzrostu roślin (Wells i in. 2005). W większych ilościach sole tego pierwiastka są jednym z najbardziej toksycznych metali ciężkich i mogą powodować niekorzystne, długo utrzymujące się zmiany w środowisku wodnym (Brown i Rattigan 1979, Stauber i Florence 1985). Herbicyd Roundup® z substancją aktywną w formie glifosatu (N-fosfonometyloglicyna) po przedostaniu się do rośliny hamuje enzym syntetazę EPSP (5-enolopirogroniano-szikimo-3-fosforanu). Zahamowanie aktywności tego enzymu zatrzymuje tworzenie przez rośliny aminokwasów aromatycznych, takich jak: fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan, które są bardzo ważne dla wzrostu roślin ponieważ wchodzą w skład wielu barwników (Franz i in. 1997). Ostatnia substancja, chlorek 1-butylo-3- metyloimidazoliowy ([BMIM]Cl), należy do grupy imidazoliowych cieczy jonowych, które
znajdują szerokie zastosowanie w tzw. „zielonej chemii”, czyli dziedzinie zajmującej się produktami uważanymi za przyjazne środowisku. Ciecze jonowe jak wykazano są toksyczne dla różnych grup organizmów, w tym mikroglonów (Latała i in. 2009, Samorì i in. 2011).
Celem przeprowadzonych badań było zweryfikowanie metody badawczej polegającej na ocenie kondycji całych zbiorowisk mikrofitobentosu poddanych działaniu wybranych substancji pochodzenia antropogenicznego. Metoda ta w przyszłości może posłużyć jako wiarygodne narzędzie stosowane w monitoringu stanu ekologicznego Morza Bałtyckiego.
1. Materiały i metody
Mikrofitobentos do badań laboratoryjnych, pozyskiwano ze szkiełek podstawowych eksponowanych w środowisku morskim przez okres 14 dni w sierpniu 2014 roku. Specjalnie skonstruowany panel ze szkiełkami umieszczano na głębokości około 2 metrów w odległości 300 m od brzegu na stacji zlokalizowanej w Sopocie. Porośnięte mikrofitobentosem szkiełka po przetransportowaniu do laboratorium umieszczano w płytkich pojemnikach wypełnionych ok. 100 ml wody morskiej pobranej in situ przefiltrowanej przez sączek GF/C firmy Whatman. Aklimatyzację zbiorowisk przeprowadzano w komorze termostatycznej przez okres 72 h. Testy laboratoryjne prowadzono w warunkach zbliżonych do aktualnie panujących w środowisku tj. w temperaturze 18˚C. Warunki świetlne o natężeniu napromieniowania PAR – 60 μmol fotonów m-2s-1 i fotoperiodzie L:D 16:8 uzyskano stosując sztuczne źródło światła – lampy halogenowe Phillips (OSRAM L 36W/640-1). Po okresie aklimatyzacji, szkiełka ze zbiorowiskami mikrofitobentosu umieszczano w 100 ml filtrowanej wody morskiej, jako roztworze kontrolnym i w roztworach badanych substancji. Do przetestowania wpływu chlorku miedzi (II) na zbiorowiska morskiego mikrofitobentosu zastosowano stężenie 0,001 g∙dm-3 i 0,01g∙dm-3. W testach na pozostałych substancjach zastosowano stężeniae 0,05 g∙dm-3 i 0,85 g∙dm-3 glifosatu w postaci preparatu Roundup® oraz 0,0175 g∙dm-3 i 0,175 g∙dm-3 cieczy jonowej [BMIM]Cl. Za główne wskaźniki zmian zachodzących w badanych zbiorowiskach mikrofitobentosu przyjęto zmiany w składzie taksonomicznym i strukturze zbiorowisk oraz zmiany koncentracji barwnika fotosyntetycznego chlorofilu a. Dodatkowo rejestrowano zmiany w kształcie chloroplastów komórek organizmów wchodzących w skład zbiorowisk, stosując podział na trzy kategorie:
komórki z chloroplastami o prawidłowym kształcie, komórki z chloroplastami o nieprawidłowym kształcie oraz komórki martwe (komórki, w których nie obserwowano chloroplastów). Za zmiany w kształcie chloroplastów uznawano wszelkie zmiany i deformacje będące odstępstwem od kształtów obserwowanych w naturalnych zbiorowiskach i przedstawianych w literaturze jako typowe dla poszczególnych gatunków. Analizę jakościową i ilościową zbiorowisk oraz zmian w wykształceniu chloroplastów i przeżywalności wykonywano w 50 polach widzenia pod powiększeniem 400x z wykorzystaniem mikroskopu Nikon Eclipse 80i wyposażonym w kamerę Nikon DS-U2. Do oznaczania mikroorganizmów roślinnych wykorzystano głównie prace Plińskiego i Witkowskiego (2009) oraz Witkowskiego i in. (2000). Oznaczenia koncentracji barwników fotosyntetycznych wykonano metodą spektrofotometryczną z zastosowaniem spektrofotometru firmy Beckman. Uzyskane wyniki przeliczono na powierzchnię szkiełka
badawczego (μg∙cm-2) na podstawie standardowych wzorów Jeffrey’a i Humphrey’a (Jeffrey i in. 1997).
2. Wyniki
Eksperymenty prowadzono na trzech różnych substancjach jednak w pracy przedstawione zostaną jedynie wyniki uzyskane w doświadczeniu testującym wpływ CuCl2
na zbiorowiska mikrofitobentosu, ponieważ w pozostałych doświadczeniach testowane zbiorowiska ulegały podobnym zmianom. Podczas tego doświadczenia zidentyfikowano łącznie 46 taksonów organizmów fotosyntetyzujących. 35 taksonów zaklasyfikowano do grupy okrzemek, 11 pozostałych stanowiły głównie sinice i pojedyncze gatunki bruzdnic i zielenic. W mikrofitobentosie do taksonów o wysokiej frekwencji i dominujących zaliczono m.in.: Amphora coffeaeformis (C.Agardh) Kützing, Amphora pediculus (Kützing) Grunow, Bacillaria paxillifer (O.F.Müller), Diatoma moniliformis (Kützing) D.M.Williams, Navicula perminuta Grunow, Navicula ramosissima (C.Agardh) Cleve. Natomiast jako taksony rzadkie i mało liczebne zidentyfikowano: Diploneis interrupta (Kützing) Cleve, Entomoneis paludosa (W.Smith) Reimer, Navicula palpebralis Brébisson ex W.Smith. Pod wpływem chlorku miedzi (II) zaobserwowano przebudowę zbiorowisk mikrofitobentosu i zastępowanie gatunków takich jak: Cocconeis placentula Ehrenberg, Melosira moniliformis (O.F.Müller) C.Agardh, Rhoicosphenia abbreviata (C.Agardh), przez prawdopodobnie bardziej odporne taksony tj. Bacillaria paxillifer, Diatoma moniliformis (Kützing) D.M.Williams i Navicula perminuta, które w ostatniej dobie eksperymenty zdominowały zbiorowiska. W zbiorowiskach kontrolnych również obserwowano zmiany, jednak ich zakres był niewielki.
Wiele gatunków okrzemek jest eliminowana w trakcie trwania eksperymentu, pozostaje niewielka liczba gatunków charakteryzujących się największą odpornością, następstwem jest masowe pojawienie się sinic i bakterii.
Na podstawie analizy stanu zachowania chloroplastów w komórkach mikroorganizmów wykazano, iż w pierwszej dobie w badanych stężeniach liczebność komórek o prawidłowych chloroplastach zmalała o ok. 1% dla wyższego stężenia i o 28 % dla niższego stężenia chlorku miedzi w stosunku do roztworu kontrolnego (Rys. 1). W kolejnych dobach liczebność komórek martwych i o nieprawidłowych chloroplastach w badanych roztworach substancji znacząco wzrosła w stosunku do roztworu kontrolnego. W trzeciej dobie w stężeniu 0,001 g/l o 35%, a w 0,01 g/l o 50%, a w siódmej odpowiednio o 20% i 15%.
Rys. 1. Stan zachowania chloroplastów w komórkach badanych organizmów w kolejnych dniach
eksperymentu.
Stężenie chlorofilu a w badanych zbiorowiskach zmniejszało się w testowanych roztworach CuCl2 podczas trwania eksperymentu (Rys. 2). Zawartość chlorofilu a w stężeniu 0,001 g∙dm-3 zmalała w stosunku do kontroli od 25% do 50% w kolejnych dniach eksperymentu. Jednak największą zmianę tego parametru zaobserwowano w stężeniu 0,01 g∙dm-3 CuCl2w trzeciej dobie (ok. 40 % wartości uzyskanej dla roztworu kontrolnego).
Rys. 2. Stężenie chlorofilu a w badanych zbiorowiskach, wyrażone jako procent wartości uzyskanej w roztworze kontrolnym w kolejnych dniach eksperymentu.
3. Dyskusja i wnioski
Monitoring reakcji organizmów na substancje potencjalnie toksyczne wprowadzane do ekosystemu Morza Bałtyckiego to ważny element kontroli jakości środowiska. W przeprowadzonych eksperymentach za pomocą zastosowanych wskaźników zarejestrowano zmiany w zbiorowiskach mikrofitobentosu zachodzące pod wpływem substancji chemicznych pochodzenia antropogenicznego. Wykazano, iż wybrane substancje w testowanych stężeniach oddziaływały zarówno na poziomie komórkowym, jak i populacyjnym. Poza łatwym do zaobserwowania zahamowaniem wzrostu liczebności komórek, czy to za pomocą analizy mikroskopowej czy chlorofilu a, zarejestrowano również zmiany w składzie i strukturze zbiorowisk. Stąd wyniki badań pozwalają nie tylko na identyfikacje taksonów wrażliwych i odpornych na testowane substancje, ale również obrazują jakie następstwa może mieć ich wprowadzenie do środowiska morskiego. Ponadto jak wykazano, również rejestrowanie stopnia zmian zachodzących w chloroplastach mikroorganizmów może służyć jako wskaźnik kondycji zbiorowisk mikrofitobentosu. Okrzemki, które stanowią główną grupę dominującą w
mikrofitobentosie pobierają organiczne substancje szybciej, niż pozostałe morskie mikroglony i dlatego mogą być bardziej wrażliwe na różnorodne substancje obecne w środowisku, które hamują ich wzrost (Chan i in. 1980). Takie właściwości wyjaśniałyby dużą wrażliwość okrzemek na testowane związki pochodzenia antropogenicznego.
Przedstawione rozwiązanie wykorzystujące zbiorowiska mikrofitobentosu w badaniach ekotoksykologicznych ma ogromny potencjał badawczy. Zaprezentowana metodyka jest uniwersalna i pozwala ocenić kondycję mikroorganizmów roślinnych poddanych działaniu substancji o szerokim spektrum działania. Procedura badań jest prosta i pozwala na stosunkowo szybkie otrzymanie satysfakcjonujących wyników dla dużej ilości organizmów roślinnych pochodzących z różnych grup taksonomicznych. Dzięki wykorzystaniu naturalnych zbiorowisk oszacowanie ekotoksyczności testowanych substancji chemicznych jest dużo bardziej wiarygodne w porównaniu z klasycznymi testami przeprowadzanymi na monokulturach glonów. Zaproponowana metodyka może być powszechnie wykorzystywana w monitoringu kondycji mikrofitobentosu stanowiącego niezwykle ważny element ekosystemów wodnych.
Literatura
Arrhenius A., Backhaus T., Hilvarsson A., Wendt I., Zgrundo A., Blanck H., 2014, A novel rapid assay for evaluating the efficacy of biocides to inhibit the development of marine photoautotrophic biofilms. Biofouling 25.
Blanck H., Eriksson K.M., Grönvall F., Dahl B., Guijarro K.M., Birgersson G., Kylin H., 2009, A retrospective analysis of contamination and periphyton PICT patterns for the antifoulantirgarol 1051, around a small marina on the Swedish west coast, Marine pollution bulletin 58:230‐237.
Brown B. T., Rattigan B. M., 1979, Toxicity of soluble copper and other metal ions to Elodea canadensis. Environmental Pollution (1970) 20.4 (1979): 303-314.
Chan A.T., Andersen R.J., Le Blanc M.J., Harrison P.J., 1980, Algal Plating as a Tool for Investigating Allelopathy Among Marine Microalgae. Marine Biology. 59:7-13.
Dahl B., Blanck H., 1995, Pollution-induced community tolerance (PICT) in periphyton communities established under tri-n-butyltin (TBT) stress in marine microcosms. Aquatic toxicology 62: 35–44.
Franz JE, Mao M.K., Sikorski J.A.,1997). Glyphosate A Unique Global Herbicyde. ACS Monograph 189. American Chemical Society, Washington CD.
Jeffrey S.W., Mantoura R.F.C., Wright S.W., 1997, Phytoplankton pigments in oceanography: guidelines to modern methods, UNESCO Publishing:661.
Latała A., Nędzia M., Stepnowski P., 2009, Toxicity of imidazolium and pyridinium based ionic liquids towards algae. Chlorella vulgaris, Oocystis submarina (green algae) and Cyclotella meneghiniana, Skeletonema marinoi (diatoms), Green Chemistry.11:580-588.
Pérez P., Fernández E., Beiras R., 2009, Toxicity of benzalkonium chloride on monoalgal cultures and natural assemblages of marine phytoplankton. Water, Air, and Soil Pollution 201/1-4: 319-330.
Pliński, M., Witkowski, A., 2009, Diatoms–Bacillariophyta. Part one: centric diatoms,[in:]
Pliński M. Flora of the Gulf of Gdańsk and adjacent waters (southern Baltic)4,1, 223.
Samorì C, Sciutto G, Pezzolesi L, Galletti P, Guerrini F, Mazzeo R, Tagliavini E., 2011, Effects of imidazolium ionic liquids on growth, photosynthetic efficiency, and cellular components of the diatoms Skeletonemamarinoi and Phaeodactylumtricornutum. Chemical research in toxicology. 24: 392-401.
Stauber J.L, Florence T.M., 1985, The influence of iron on copper toxicity to the marine diatom, Nitzschia closterium (ehrenberg) W. Smith Aquatic Toxicology. 6:297–305
Sylwestrzak Z., Zgrundo A., 2014, Wstępne wyniki badań laboratoryjnych wykorzystujących zbiorowiska mikrofitobentosu Zatoki Gdańskiej do testowania toksyczności cieczy jonowych[W:] Kuczera M. (red.) Wpływ młodych naukowców na osiągnięcia polskiej nauki – V Edycja. Materiały Konferencji Młodych Naukowców, Wrocław 14-15.12.2013, ISBN: 978-83-63058-38-8:275-283.
Sylwestrzak Z., Pniewski F., 2014, Wpływ medium hodowlanego na wyniki eksperymentów testujących oddziaływanie substancji toksycznej na zbiorowiska mikrofitobentosu.
Dokonania Młodych Naukowców, ISSN: 2300-4436:452-457.
Wells M. L.,. Trick C.G, Cochlan W. P., Hughes M.P., Trainer V.L., 2005, Domoic acid: The synergy of iron, copper, and the toxicity of diatoms. Vol. 50: 1908–1917.
Witkowski A., Lange-Bertalot H., Metzeltin D., 2000, Diatom Flora of Marine Coasts I.
IconographiaDiatomologica 7: Koeltz Sci. Königstein: 925.
