DIAGN. LAB, 1969, T. V, NR 3
IZABELA PUZIEWICZOWA
ZASTOSOWANIE METODY TANINOWEJ DO OZNACZANIA FIBRYNOGENU WYSOLONEGO CHLORKIEM SODOWYM
Z OSOCZA KRWI
Z Zakładu Biochemii Wydziału Nauk Przyrodniczych UBB we Wrocławiu
Kierownik: prof. dr W. Mejbaum-Katzenellenbogen
iz II Kliniki Pediatrycznej AM we Wrocławiu Kierownik: prof dr M. Wierzbowska
Autorka zastosowała mikrometodę taninowa Mejbaum-Katzenellen- bogen do oznaczania fibrynogenu wysolonego nasyconym roztworem chlorku sodowego. Został wykonany wzorzec fibrynogenu z osocza konia, który odpowiada wzorcowi żelatynowemu f-my Difco używanemu w metodzie taninowej. Wyniki oznaczeń fibrynogenu wykonane metodą taninową porównano z wynikami oznaczeń fibryny wykonane metodą Kjeldahla. Wyniki okazały się zgodne. Autorka stwierdziła, że metoda taninowa nadaje się do oznaczania fibrynogenu wysolonego nasyconym roztworem chlorku sodąwego.
Fibrynogen różni się od innych białek osocza krwi swoistą reakcją na działanie trombiny, pod wpływem której przechodzi z postaci rozpuszczo- nej w skrzepniętą. Jako euglobulina nie rozpuszcza się w wodzie, nato- miast łatwo rozpuszcza się w rozcieńczonych roztworach soli obojętnych i zasad. Już w XIX wieku Hammersten wydzielił fibrynogen z plazmy szczawianowej człowieka i konia przez wysolenie jej półnasyconym roz- tworem chlorku sodowego. Od tego czasu datuje się rozwój prac nad otrzymaniem czystych, trwałych, o wysokim procencie krzepnącego biał- ka preparatów fibrynogenu z osocza ludzkiego i zwierząt (1, 2).
Powszechnie stosowane metody oznaczania fibrynogenu w osoczu spro- wadzają się do wytwarzania skrzepu fibryny przy użyciu chlorku wap- niowego lub trombiny w pH około 6,5 w 37? i oznaczeniu jej metodą wa- gowa (7), Kjeldahla (3) lub kolorymetryczną (6). Są to metody pośrednie, zależne od układu krzepnięcia krwi.
Celem pracy było zastosowanie mikrometody taninowej Mejbaum-Kat- zenellenbogen (4) do bezpośredniego oznaczania fibrynogenu przez wyso- lenie osocza nasyconym roztworem chlorku sodowego, oraz otrzymanie czystego, homogennego preparatu fibrynogenu.
MATERIAŁ I METODY
Osocze ludzkie pochodziło z krwi osobników zdrowych w wieku od 15 do 50 lat.
Krew pobierano na czczo z żyły łokciowej w ilości 2 ml. Krzepnięcie krwi hamo-
wano szczawianem potasowym w ilości 1 mg/l ml krwi 3,8%o cytrynianem sodowym
w ilości 0,2 ml/1 ml krwi, lub heparyną 50 jedn. m./1 ml krwi. Osocze otrzymywanoprzez wirowanie krwi przez 10 minut przy 3000 obr./min.
Używano preparatów żelatyny firmy Difco, heparyny firmy LEO, trombiny Woj.
Stacji Krwiodawstwa w Białymstoku i Nowej Hucie, kwasu taninowego firmy
268 I. Puziewiczowa Nr 3
Mallinckrodt USP XI USA, oraz chlorku sodowego, który w stężeniu 20%o nie dawał zmętnienia z odczynnikiem taninowym bez względu na stopień czystości.
Białko oznaczano mikrometodą taninową Mejbaum-Katzenellenbogen (4) oraz me- todą Kjeldahla. Elektroforezę białek osocza i fibrynogenu wykonywano w buforze weronalowo-medinalowym wg Ditimara. Stosowano napięcie 400 V, natężenie 2 mA na cm szerokości paska bibuły Whatmana Nr 1 o wymiarach 4X38 cm. Czas elek- troforezy — 6 godzin. Próbki badanego materiału w ilości 0,02 ml nanoszono w od- ległości 2 cm od Środka paska w kierunku katody. Po ukończeniu elektroforezy paski suszono w 80” przez 5 minut, utrwałano i barwiono odczynnikiem taninowym z dodatkiem błękitu bromofenolowego (5). Oznaczanie fibryny metodą Kjeldahia wykonywano w sposób następujący: do 5 ml 0,9% chlorku sodowego dodawano 0,1 lub 0,2 ml osocza szczawianowego i 0,5 ml 2,5%/0 roztworu chlorku wapniowego.
Mieszaninę inkubowano przez 3—6 godz. w 37”. Po inkubacji skrzep fibryny nawi- jano na pręcik szklany, przemywano kilkakrotnie wodą destylowaną i ostatni raz 0,9976 NaCl. Dla sprawdzenia czy fibryna została całkowicie pozbawiona białek oso- cza używano odczynnika taninowego. Przemyty skrzep fibryny spalano w kolbce
Kjeldahla w obecności 1 ml stężonego kwasu siarkowego i około 20 mg dwutlenku
selenu, Spalanie prowadzono w ciągu 2 godz. Po ostudzeniu kolbki i przeniesieniu jej zawartości do aparatu Parnasa Wagnera, oddestylowywano amoniak. Do przeli-czenia N-NHz na fibrynę używano współczynnika 6,02 wg Schulza (8).
Preparatykę fibrynogenu z krwi konia przeprowadzano przez wysolenie osocza szczawianowego nasyconym roztworem chlorku sodowego. 300 ml szczawianowego
osocza konia zadawano 3 litrami nasyconego (30%) roztworu chlorku sodowego
i pozostawiono na i2 godz. w temperaturze pokojowej. Osad wysolonego białka odwirowano i przemywano 10-krotnie każdorazowo 1 1 15% chlorku sodowego.Fibrynogen wolny od białek osocza zadawano 200 ml 0,001 N wodorotlenku sodo- wego i pozostawiano do rozpuszczenia się na 24 godz. Po tym czasie roztwór fibryno- genu dializowano przez 3 dni w temperaturze pokojowej wobec wody podwójnie destylowanej trzykrotnie zmienianej aż do uwolnienia go od jonów chlorkowych a następnie liofilizowano i suszono w suszarce próżniowej nad P»O; do stałej wagi.
WYNIKI
liWysalanie fibrynogenu
Celem sprawdzenia, czy inne frakcje białek surowicy poza fibrynoge- nem wysalają się nasyconym roztworem chlorku sodowego, do 10 ml na- syconego roztworu chlorku sodowego dodano 1 ml surowicy i pozostawiono mieszaninę w temperaturze pokojowej na 12 godz. Pomimo braku osadu, próby wirowano, płyn odlewano i oznaczano w nim białko. Nie znalezio- no statystycznie istotnej różnicy w poziomie białka surowicy wysołonej i niewysolonej nasyconym roztworem chlorku sodowego. Do wysalania fibrynogenu pobierano 0,2 i 0,02 ml osocza szczawianowego tego samego osobnika. Stosując 10 i 100-krotną objętość nasyconego roztworu chlor- ku sodowego uzyskiwano w czasie od 3 do 6 godzin oddzielenie się osadu wysolonego białka od płynu, który stawał się przezroczysty. Próby wi- rowano i w płynach znad osadu oznaczano białko. Praktycznie po trzech piukaniach nie stwierdza się już w supernatancie obecności białka.
W dalszym postępowaniu stosowano 4-krotne przemywanie osadu białko- wego. Przemyty.osad rozpuszczano w 0,1 N roztworze wodorotlenku so-
dowego i oznaczano stężenie białka. Wyniki oznaczeń podano w tabeli 1.
Nr 3 Oznaczanie fibrynogenu 269
Tabela I
Stezenie biatka wysalajacego sie nasyconym roztworem chlorku sodowego w zależności od roz- cieńczenia
Nr osocza A B С
białko w mg/100 ml białko w mg/100 ml białko w mg/100 ml
1 230 220 200
2 230 230 190
3 220 220 230
4 230 220 200
5 230 220 220
A+o 22844,3
225-+5,3
205-+20
A — rozciericzenie 10x (0,2 ml osocza/2 ml NaCl).
B — rozcieńczenie 100x (0,2 ml osocza/20 ml NaCl).
C — rozcieńczenie 10x (0,02 ml osocza/2 ml NaCl).
Najwiekszy rozrzut otrzymano przy wysalaniu 0,02 ml osocza 100- -krotną objętością soli. Przy zbyt małej ilości osocza osad białkowy ła- two się gubił w trakcie przemywania. Najbardziej przydatne okazało się 10-krotne rozcieńczenie przy ilościach 0,1—0,2 ml osocza. Przebadano wpływ antykoagulantów na wysalanie się białka z osocza szczawiano- wego, cytrynianowego i heparynowego. Wysolone nasyconym roztworem chlorku sodowego białko po 4-krotnym przemyciu, rozpuszczano i ozna-
czano jego stężenie. Otrzymane wyniki wykazują dużą Zgodność.
s Pp o o6 A
| FT т i
Osocze
Czysty - fibrynogen
HF ibn Ino. jen Start Snog
Ryc. 1. Elektroforeza bibułowa białek osocza i wysolonego fibrynogenu ludzkiego.
Wysolone z osocza białko dobrze rozpuszcza się w 0,1 N wodorotlenku sodowym, w buforze weronalowym o pH 8,6 i w buforze boranowym O pH 7,4. W niższych pH jest słabo rozpuszczalne. Roztwory weronalowe i boranowe wysolonego białka zadane trombiną krzepną w ciągu kilku sekund tworząc lity skrzep, który rozpuszcza się w 30/6 moczniku.
Wysolone z osocza i rozpuszczone w buforze weronalowym białko pod- dane elektroforezie bibułowej w pH 8,6 okazało się frakcją jednorodną, wędrującą w polu elektrycznym tak jak frakcja osocza świeżego (ryc. 1).
8 — Diagn. Lab.
270 I. Puziewiczowa Nr 3 Z przedstawionych badań wynika, że frakcja białkowa wysalająca się nasyconym roztworem chlorku sodowego z osocza posiada własności fi- brynogenu.
Z wysuszonego do stałej wagi preparatu uzyskanego z osocza konia przez wysolenie go 30% roztworem chlorku sodowego odwazono 10 i 15 mg próbki i oznaczano w nich białko metodą taninową i N-białkowy me- todą Kjeldahla. Wyniki oznaczeń podano w tabeli II.
Tabela I
Zawartość białka w preparacie fibrynogenu konia oznaczona metodą laninową i metodą /jel- dahla
Odzyskano
metodą taninową* | metody Ajeldahla Odwazono
mg mg % białka N-białkowy Nx 6,02 % białka
mg
10 9,96 99,6 1,627 | 9,80 98,0
15 14,94 99,4 2,435 14,67 97,8
A 25 24,90 99.5 4,062 24,47 | 97,9
* Białko w metodzie taninowej odczytywano z krzywej dła żelatyny.
Preparat fibrynogenu uzyskany przez wysalanie osocza nasyconym roztworem chlorku sodowego posiada 989%/0 czystości. Krzywe standardo- we sporządzone z badanego preparatu fibrynogenu i żelatyny pokrywają
się z sobą (ryc. 2). `
Ekstynkej
1 I т. 1 1
0 40 60 80 1049 Бава
Ryc. 2. Krzywe wzorcowe: żelatyny i fibrynogenu wypreparowanego z osocza koń- skiego. Objaśnienie: krzywa żelatyny, —-—-——-— krzywa fibrynog.
2. Postępowanie przy oznaczaniu fibrynogenu przez wysalanie osocza szczawianowego nasyconym
roztworem chlorku sodowego
Do probówki wirówkowej zawierającej 1 lub 2 ml 30% chlorku sodo- wego dodać 0,1 lub 0,2 ml osocza szczawianowego, pozostawić w tempe-’
raturze pokojowej do wytrącenia się osadu (12 godz.). Po tym czasie
próbkę wirować, płyn z nad osadu odlać, obsuszyć probówkę pozostawia-
jac ja dnem do góry na bibule przez kilka minut. Następnie przemyć osad 4-krotnie każdorazowo 5 ml 20% roztworu chlorku sodowego. Tak przygotowany fibrynogen rozpuścić w 10 ml 0,1 N wodorotlenku sodo- wego. Po 30 minutach pobierać 1 ml roztworu białka do oznaczenia me- todą taninową.
U 30 zdrowych osób w wieku od 15 do 50 lat oznaczano fibrynogen przez wysalanie osocza nasyconym roztworem chlorku sodowego i fibry- nę metodą Kjeldahla. Otrzymane wyniki oznaczeń zestawiono w ta-' beli III.
Tabela III
Poziom fibrynogenu i fibryny w osoczu ludzi zdrowych od 15-—50 lat
Lp. Poziom fibrynogenu Poziom fibryny w mg/100 mł osocza w mg/100 ml osocza
1 180 200
2 190 202
3 230 205
4 240 228
5 250 210
6 260 250
7 270 280
8 270 260
9 280 260
10 280 262
11 260 250
12 290 272
13 310 300
14 320 305
15 300 280
16 320 300
17 340 330
18 360 350
19 340 320
20 320 308
21 370 370
22 360 350
23 390 372
24 420 400
25 430 415
26 480 460
27 480 452
28 500 520
29 500 450
30 500 480
Ас 335-86 321484
DYSKUSJA
Otrzymano czysty preparat fibrynogenu przez wysolenie osocza szcza-
wianowego nasyconym roztworem chlorku sodowego. Porównano wyniki
oznaczeń poziomu fibrynogenu oznaczonego metodą taninową z fibryną
279 I. Puziewiczowa Nr 3 oznaczoną metodą Kjeldahla. Różnica w wynikach otrzymanych pomię- dzy poziomem fibrynogenu i fibryny wynosiła średnio 4,20/0. Wartość ta odpowiada masie fibrynopeptydów odszczepiających się podczas konwer- sji fibrynogenu w fibrynę. Wykazano, że fibrynogen oznacza się metodą taninową proporcjonalnie do wagi preparatu tak jak i inne białka.
Wprowadzanie metody bezpośredniego oznaczania fibrynogenu poprzez wysalanie nasyconym roztworem chlorku sodowego osocza pozwala od- dzielić badania nad fibrynogenem jako określonej frakcji białkowej od całości procesu krzepnięcia krwi i jego zaburzeń w patologii.
И. Пузевич
ПРИМЕНЕНИЕ ТАНИНОВОГО МЕТОДА В ОПРЕДЕЛЕНИИ ФИБРИНОГЕНА, ВЫСОЛЕННОГО ИЗ КРОВЯНОЙ ПЛАЗМЫ ХЛОРИСТЫМ НАТРИЕМ
Содержание
Автор применяла в определении фибриногена, высоленного раствором хло-
риетого натрия, таниновый микрометод по Mejbaum-Katzenellenbogen. Paspa6o-тала стандарт для фибриногена лошадиной плазмы, адекватный желатиновому
стандарту фирмы ПЁсо, употребляемый в таниновом методе. Результаты опре-деления фибриногена, полученные таниновым методом, сравнила с результа-
тами определения фибрина по методу К)е!9а Ша. Результаты были согласными.Автор утверждает, что таниновый метод может быть нригоден в определении Фибриногена, высоленного насыщенным раствором хлористого натрия.
I Puziewiczowa
APPLICATION OF TANNIC ACID FOR ASSAYS OF FIBRINOGEN PRECIPITATED FROM THE BLOOD PLASMA BY MEANS OF SODIUM
CHLORIDE
Summary
Tannic acid micromethod, developed by Mejbaum-Katzenellenbogen, was applied for the determination of fibrinogen precipitated with a saturated solution of sodium chloride. A standard fibrinogen preparation has been prepared from the horse plasma, corresponding to the gelatine standard (Difco), used in the tannic acid method. Results of fibrinogen assays, conducted by means of tannic acid, were compared with those obtained by the Kjeldahl method. The results, provided by both methods, have proved consonant. Applicability of tannic acid for assaying
fibrinogen, precipitated by means of a saturated solution of sodium chloride, has
been ascertained by the author.PISMIENNICTWO
1. Blomback B.: Studies on Figrinogen. Stokholm 1958, 18. — 2. Kekwick A., Margaret A.: Bioch. J., 1955, 60, 671, — 3. King E.: Micro-Analysis in Medical Bio-
chemistry, London 1959, 31. — 4. Mejbaum-Katzenellenbogen W.: Acta Bioch. Polon.,
1955, 2, 279. — 5. Mejbaum-Katzenellenbogen W., Dobryszycka W.: Clin, Chim. Acta, 1959, 4, 515. — 6. Saifer A., Newhouse A.: J. Biol. Chem., 1954, 208, 159. — 7. SchmidJ.: Die Blutgerinnung in Theorie und Praxis. Wieden, 1951, 89. — 8. Schulz F.: Das
Fibrinogen. Lipsk, 1953, 14.Wpłynęło dnia 27. XIL 1967.
Adres autorki: Wrocław, ul. Curie-Skłodowskiej 50/52.
