Meaning of dipeptidyl-peptidase IV on the haematopoietic cells in multiple myeloma patients undergoing haematopoietic stem cells mobilization

(1)

Praca oryginalna/Original research article

Ocena znaczenia ekspresji błonowej

dipeptydylo-peptydazy IV na komórkach

hematopoetycznych u chorych ze szpiczakiem plazmocytowym poddawanych mobilizacji komórek krwiotwórczych

Meaning of dipeptidyl-peptidase IV on the haematopoietic cells in multiple myeloma patients undergoing haematopoietic stem cells mobilization

Ma łgorzata Krawczyk-Kuli ś, Anna Kopi ńska *,

Joanna Dziaczkowska-Suszek, Katarzyna Bieszczad, Krystyna Jagoda, S ławomira Kyrcz-Krzemie ń

KatedraiKlinikaHematologiiiTransplantacjiSzpikuŚląskiegoUniwersytetuMedycznegowKatowicach, Kierownik:prof.drhab.n.med.SławomiraKyrcz-Krzemień,Katowice,Polska

informacje o artykule

Historiaartykułu:

Otrzymano:31.05.2013 Zaakceptowano:08.01.2014 Dostępneonline:16.01.2014

Słowakluczowe:

ekspresjadipeptydylo-peptydazaIV

CD26

mobilizacjakomórek hematopoetycznych

szpiczakplazmocytowy

Keywords:

Dipeptidyl-peptidaseIVexpression

CD26

Haematopoieticstemcell mobilization

Multiplemyeloma

abstract

Dipeptidyl peptidase IV is a membrane enzyme involved in intracellular interactions governing processes. Proven its effects on engraftment the transplanted allogeneic hematopoieticcells.TheaimofthisstudywastoanalyzetheexpressionofCD26inthe mobilization of hematopoietic cells for auto-transplantation in multiple myeloma patients.In30patients,who,duringthe2011–2012,underwentthemobilizationofhema- topoieticcells,CD26wasdeterminedonCD34 positivecellsaswellasonlymphocytes, monocytes and granulocytes, before mobilization procedures, as well as on the cells obtainedafterseparation oncellseparator.Wefound astatisticallysigniﬁcantincrease inthenumberofmononuclearcellsexpressingCD26,non-expressionofCD26ongranu- locytes, both before and during the mobilization procedures. Additionally we found aweekexpressionofCD26onCD34positivecells.Theobtainedresultsseemtoindicate animportantroleofbonematrixcellsexpressingCD26intheprocessofmobilizationof hematopoieticcellsinmyelomamultiplexpatients.

*Adresdokorespondencji:KatedraiKlinikaHematologiiiTransplantacjiSzpikuSUM,ul.Dąbrowskiego25, 40-032Katowice,Polska.

Tel.:+48507312967.

Adresemail:cauda.equina@wp.pl(A.Kopińska).

ContentslistsavailableatScienceDirect

Acta Haematologica Polonica

journal homepage:www.elsevier.com/locate/achaem

http://dx.doi.org/10.1016/j.achaem.2014.01.003

(2)

Wstęp

Wysokodawkowana chemioterapia wspomagana autoprze- szczepieniem krwiotwórczych komórek macierzystych (AHSCT),mimoistotnegopostępuwleczeniuchemioterapeu- tycznym, w ostatnich latach pozostaje nadal leczeniem zwyboruupacjentówzeszpiczakiemplazmocytowym(MM).

Aktualnie źródłem macierzystych komórek krwiotwórczych (PBSC) wykorzystywanychdoAHSCT w znacznej większości przypadkówjestkrewobwodowa[1].

Podczas mobilizacjiPBSC stosujesięrutynowo chemio- terapięmobilizującąiod+5.dobypochemioterapiimobili- zującej podaje się czynnik wzrostu granulocytów (G-CSF) w dawce 5–10mg/kg masy ciała. Leukaferezę komórek krwiotwórczychrozpoczynasię,gdyliczbaprogenitorowych komórek hematopoetycznych (HPC) wyniesie we krwi obwodowej powyżej 0,025G/l, a dzieje się tak zazwyczaj około 10.–14.dobyodrozpoczęciachemioterapiimobilizu- jącej.Wwiększościprzypadkówpodczasjednejmobilizacji komórek krwiotwórczych uzyskuje się >210⁶ komórek CD34+/kg masy ciała biorcy.Według wytycznych Europej- skiegoTowarzystwaTransplantacjiSzpiku(EBMT;European BoneMarrowTransplantation), za ilość komórek CD34+bez- pieczną dla zapewnienia odnowy hemopoezy po AHSCT uznaje się 2–310⁶/kg masy ciała [2]. Udowodniono, że procesmobilizacjimacierzystych komórekkrwiotwórczych zeszpiku kostnegojest oparty naskomplikowanych reakcjach immunologicznych, w które zaangażowanych jest wielechemokin[3].Jednymizlepiejpoznanychsąchemo- kiny z osi CXCL12 (SDF1; stroma direct factor 1) – CXCR4 (CD184). Jak wiadomo z dotychczas przeprowadzonych badań in vitro,jakrównież z badań na modelachzwierzę- cych, dipeptydylo-peptydaza IV (CD26, DPP IV) – enzym błonowyinaktywującychemokinęCXCL12powodujeprzer- wanie połączenia pomiędzy dojrzewającymi komórkami hematologicznymi a macierzą szpiku kostnego poprzez receptor CXCR4 [4]. Sytuacja taka ma miejsce podczas mobilizacji PBSC do krwi obwodowej. Wykazano również, żedodaniedohodowlikomórkowejinvitroG-CSFpowoduje znaczącywzrostliczbykomórekzekspresjąantygenuCD26 [4]. In vivo w wyniku wzrostu aktywności DPP IV przery- wane są połączenie pomiędzy mikrośrodowiskiem szpiku akomórkami CD34+uwalnianymi dokrwi obwodowej [4].

Wykazanonatomiast,żeuzdrowychdawcównazmobilizo- wanych komórkach CD34+ ekspresja antygenu CD26 jest niska[5].

Dotychczasnie badano, czy in vivo występuje zależność pomiędzy ilością skolekcjonowanych komórek CD34+

a liczbą komórek jednojądrzastych z ekspresją receptora CD26 podczas mobilizacji PBSC u chorych ze szpiczakiem plazmocytowym.

Celemniniejszegobadaniabyłaocenaliczbylimfocytów, monocytów,granulocytóworaz komórekCD34+ zekspresją enzymuDPPIVpobranych zkrwiobwodowejprzedmobili- zacją oraz z materiału uzyskanego podczas leukafarezy, a także ocena korelacji liczby komórek jednojądrzastych z ekspresją antygenu CD26 z liczbą skolekcjonowanych komórekCD34+upacjentówzMM.

Materiał i metody

Badanie zostało zaaprobowane przez Komisję Bioetyczna Śląskiego UniwersytetuMedycznegowKatowicach.Pacjenci wyraziliświadomą,pisemnązgodęnaudziałwbadaniu.

Do prospektywnego badania zakwaliﬁkowano w latach 2011–2012 w Klinice Hematologii i Transplantacji Szpiku w Katowicachkolejnych35pacjentówzeszpiczakiemplaz- mocytowym, zakwaliﬁkowanych do leczenia AHSCT, u których planowano rozpoczęcie leczenia mobilizującego.

Trzydziestu z nich (14 kobiet, 16 mężczyzn) z medianą wieku 53 lata (39–71), u których stwierdzono obecność komórek CD34+ we krwi obwodowej przed rozpoczęciem leczeniamobilizującego, włączonodobadania.Szczegółowa charakterystykapacjentówzostałaprzedstawionawtabeliI.

Wszyscypacjencijakochemioterapięmobilizującąotrzy- mali dożylnie cyklofosfamid w dawce 2–4g/m², a od +5.

doby aż do ostatniego dnia mobilizacji podawano impod- skórnie G-CSF w dawce 10mg/kg masy ciała/dobę. Aferezy rozpoczynano,gdyliczbakomórekHPCwekrwiobwodowej wyniosło co najmniej 0,025/ml przy leukocytozie >4G/l.

Zabiegi przeprowadzononaseparatorzekomórkowymCobe Spectra.U5chorych1zabiegleukaferezybyłwystarczający douzyskaniabezpiecznejdlaprzeprowadzeniaAHSCTliczby komórekCD34+.W16przypadkachprzeprowadzonozabieg dwukrotnie, au pozostałychpacjentów aferezętrzeba było przeprowadzićconajmniejtrzykrotnie.

Materiałemdobadańfenotypowychbyłakrewobwodowa wilości3mlpobranadoprobówkizEDTA-K2orazmateriał z worka kolekcyjnego o objętości 2ml. Odsetek komórek CD34+ oznaczano wg metody ISHAGE na komórkach krwi obwodowej przed rozpoczęciem chemioterapii, jak również zworkakolekcyjnego[6].

Liczbę komórek z błonową ekspresją antygenu CD26 badano w tych samych punktach czasowych, czyli przed rozpoczęciemleczeniamobilizującego,nakomórkachpobra- nych z krwi obwodowej oraz na komórkach z materiału kolekcyjnego po leukaferezach. Do badania użyto przeciw- ciał monoklonalnych sprzężonych z odpowiednimi ﬂuoro- chromami: anty-CD26, anty-CD34 (ﬁrma Becton-Dickinson).

Jako kontroli izotypowych użyto przeciwciał mysich IgG1.

TabelaI–Charakterystykaogólnapacjentówwłączonych dobadania

TableI–Characteristicofpatientsincludingtothestudy

Parametrykliniczne Dane

płeć(k/m) 14/16

medianawieku(zakres) 53(39–71)

liczbapoprzednichliniileczenia1/2/3lubwięcej 18/9/3 podtypszpiczakaplazmocytowego

IgGk/IgGl/IgAl/IgAk/ch.ł.l./MMniewydzielający

12/6/2/5/4/1

odpowiedźnaleczenieprzedmobilizacją CR/VGPR/PR/NR

7/14/9/0

ch.ł.l.–chorobałańcuchówlekkich;MM–szpiczakplazmocytowy;

CR–całkowitaremisja;VGPR–bardzodobraczęściowaodpowiedź;

PR–częściowaodpowiedź;NR–brakremisji

(3)

Próbkikrwiobwodowejizworkówkolekcyjnychoobjętości 100ml i komórkowości do 110⁸ leukocytów inkubowano z przeciwciałami monoklonalnymi przez 15 minut w tem- peraturze pokojowejbez dostępuświatła, anastępnie pod- dano lizie w BD FACS Lyse Wash Assistant ﬁrmy Becton- -Dikinson.Pomiary wykonanometodąwielokolorowejcyto- metrii przepływowej z użyciem cytometru przepływowego FACS Canto II. Ekspresję antygenu CD26 analizowano na odpowiedniowyreparowanychhistogramachnapopulacjach limfocytów, monocytów, granulocytów oraz na komórkach CD34+.

Analizastatystycznazostałaprzeprowadzonaprzyużyciu kilku metod statystycznych. Do oceny ekspresji CD26 na komórkachCD34+,limfocytach,monocytachorazgranulocy- tachpobranychz worka kolekcyjnego orazz krwi obwodo- wejprzed mobilizacją orazliczby zgromadzonych komórek CD34+podczaskolekcjiokreślonomedianę.Dlaocenyróżnic pomiędzyekspresjąCD26napopulacjachleukocytówprzed i po separacji zastosowano test Wilcoxona. Za krytyczny poziom istotności uznano p=0,05. Celem określenia zależ- nościpomiędzyliczbąkomórekjednojądrzastychzekspresją CD26 aliczbązebranych komórekCD34+ (rozkładróżny od normalnego) obliczono współczynnik korelacji rang Spear- mana. Dla oznaczenia poziomu istotności stwierdzonych zależnościzastosowanonastępująceoznaczenians-p>0,05 wartość nieistotna statystycznie, p<0,05 wartość istotna statystycznie. Wszystkich obliczeń dokonano w programie statystycznymSTATISTICA9.1

Wyniki

U 28 na 30 (93%) pacjentów zgromadzono wystarczającą liczbękomórekCD34+doprzeprowadzeniaAHSCT.Udwóch pacjentów skolekcjonowano jedynie odpowiednio: 1,210⁶/ kgmc.oraz1,6310⁶/kgmc.komórekCD34+.Medianailości zgromadzonychkomórekCD34+podczasmobilizacjiwyniosła 6,510⁶/kg mc. (1,2–13,98). Mediana liczby komórek zekspresjąCD26najednojądrzastychleukocytachkrwiobwo- dowej przed mobilizacją wynosiła 49,65% (zakres 24,5–89), natomiastwmaterialeuzyskanymwtrakcieseparacji79,95%

(zakres 57,5–183) (Tab. II). Różnica ta była znamienna statystycznie (p=0,00002). Przykładowe cytogramy uzyskane wtrakcieocenyCD26nakomórkachjednojądrzastychzkrwi obwodowej oraz materiału separacyjnego przedstawiają ryciny1i2.

Komórki CD34+ wyizolowane z krwi obwodowej przed leczeniemmobilizującymwykazywałysłabąekspresjęanty- genu CD26, mediana liczbykomórekCD34+CD26+ wynosiła 4,5% (0–12,5%) (Tab. II). W materiale uzyskanym podczas mobilizacji liczba komórekCD34+ z ekspresjąenzymu DPP IVnieuległazwiększeniu–mediana2,7%(0–17,9%).

Nie wykazano znamienności statystycznej pomiędzy liczbą zmobilizowanych komórek CD34+ a liczbą komórek jednojądrzastychzekspresjąCD26zarównoprzedmobiliza- cją, jak i z materiału separacyjnego (R=0,12; p=0,53 oraz R=0,12;p=0,54).

TabelaII–EkspresjaantygenuCD26naposzczególnychsubpopulacjachleukocytówpobranychzkrwiobwodowejprzed mobilizacjąizworkakolekcyjnegoposeparacji

TableII–ExpressionofCD26antigenonthesubpopulationleukocytestakingfrombloodbeforemobilizationandthecollectionbag aftertheseparation

Populacjakomórek Komórkizekspresjąantygenu CD26w%mediana(zakres)

przedmobilizacją

Komórkizekspresjąantygenu CD26w%mediana(zakres)

pomobilizacji

Współczynnik korelacjiR

Wartośćp

KomórkiCD34+ 4,5(0–12,5) 2,7(0–17,9) 0,30 0,07

Komórkijednojądrzaste 49,65(24,5–89) 79,95(57,5–83) 0,38 0,000046

Limfocyty 50,7(24,1–84,6) 68,4(52,8–85,8) 0,56 0,000004

Monocyty 4,5(0,2–8,1) 13,5(0–92,1) 0,31 0,000013

Granulocyty 0,07(0–0,7) 1,8(0–3,8) 0,92 0,34

Ryc.1–PrzykładowywykresekspresjiCD26nalimfocytach przedchemioterapiąmobilizującą

Fig.1–CD26expressiononlymphocytesbeforemobilization chemotherapy

Ryc.2–PrzykładowywykresekspresjiCD26nalimfocytach pobranychzworkakolekcyjnego

Fig2–CD26expressiononlymphocytesfromthecollectingbag

(4)

Podsumowanie wyników

PochemioterapiimobilizującejcyklofosfamidemorazG-CSF u chorych ze szpiczakiem plazmocytowym wykazano zna- mienny statystyczniewzrost ekspresji CD26 na komórkach jednojądrzastych, głównie limfocytach. Nie wykazano ekspresji dipeptydylo-peptydazy IV na komórkach CD34+ za- równo na pobranych z krwi obwodowej przed leczeniem mobilizującym,jakinakomórkachCD34+zworkakolekcyjnego po leukafarezie. Nie wykazano zależności pomiędzy liczbąkomórek jednojądrzastych z ekspresją CD26 a liczbą komórekCD34+uzyskanychwczasieseparacji.

Omówienie

Autoprzeszczepieniemacierzystychkomórekkrwiotwórczych jest optymalnym sposobem leczenia chorych na szpiczaka plazmocytowego dającym zarówno wydłużenie czasu wol- nego od progresji choroby, jak i wydłużenie całkowitego przeżycia [2]. PBSC niezbędne do wykonania AHSCT są pobierane z krwi obwodowej po poprzedzającym leczeniu mobilizującym i następczym kolekcjonowaniu na separato- rach komórkowych. Problemem pozostaje brak możliwości zebrania wystarczającej liczby komórekCD34+ pozwalającej na bezpieczne przeprowadzenie zabiegu autotransplantacji u części chorych. Dipeptydylo-peptydaza IV jest enzymem, którymożemiećwpływnamobilizacjękomórekkrwiotwór- czychzeszpikukostnegodokrwiobwodowej.Przeprowadzo- ne badania na myszach potwierdzają, że całkowity brak ekspresji DDP IV na komórkach po zastosowaniu G-CSF wpływa niekorzystnienaskutecznośćmobilizacji[4,7]. Udo- wodniono,żeG-CSF zwiększa ekspresjęCD26nakomórkach jednojądrzastych pozyskiwanych z krwi pępowinowej [8].

W naszym badaniu również potwierdzono wzrost liczby komórekjednojądrzastych,szczególnielimfocytówzekspresją enzymuDPPIVpopodaniuleczeniamobilizującego. Przepro- wadzoneprzeznasbadanianiewykazałygranulocytówzeks- presjąCD26zarównoprzed,jakipoleczeniumobilizującym.

Jak wiadomo, DDP IV bierze udział w wielu reakcjach regulatorowych.Udowodnionoznaczenietegoenzymuwpa- togeneziew cukrzycytypu2[9]orazwprzewlekłych choro- bach zapalnych z szczególnym uwzględnieniem chorób autoimmunologicznych [10]. W transplantologii oddziaływa- niebłonowegoenzymuDDPIVwiążesięzimmunoregulują- cym wpływem bezpośrednio na oś SDF-1 – CXCR4 [5].

Zwiększona jego ekspresja na komórkach hematopoetycznych w szpiku kostnym ułatwia ich uwalnianie do krwi obwodowej na zasadzie reakcji enzymatycznej. Większość dotychczasowychbadańzostałaprzeprowadzonanazwierzę- tach[4,7]lubdotyczyławszczepianiasiękomórekCD34+oraz regeneracji układu krwiotwórczego po allotransplantacji macierzystych komórek krwiotwórczych [5, 11]. Prabhash i wsp. w badaniu dotyczącym wpływu ekspresji CD26 na wszczepianie się komórek krwiotwórczych przebadali nie- liczną, niejednorodną pod względem rozpoznania grupę 17 chorychpoddanychAHSCT[5].Wykazali oniujemnąkorela- cjępomiędzyekspresjąCD26apoczątkiemregeneracjiukładu białokrwinkowego. Wykazali oni również wysoką ekspresję

CD26 na komórkach CD34+ [5]. W naszym badaniu nie wykazaliśmyekspresjienzymuDDPIVnakomórkachCD34+

pobranych z krwi obwodowej przed leczeniem mobilizują- cym,jakrównież wzrostuliczbykomórekCD34+zekspresją DDP IV po leukaferezie. Podobną obserwację na myszach opisaliBonigiwsp.[12].

Według naszej wiedzy, przeprowadzone przeznas pros- pektywne badanie jest jednym z pierwszych dotyczącym ocenywpływuzależnościpomiędzyekspresjąCD26ailością pozyskiwanychkomórekkrwiotwórczychuchorychzeszpi- czakiemplazmocytowym.Wykazanieprzeznasznaczącego wzrostuliczbykomórekjednojądrzastych,aszczególnielim- focytów z ekspresją CD26 podczas mobilizacji, przy braku statystycznieznamiennejkorelacjizilościąkomórekCD34+

skolekcjonowanych po leczeniu mobilizującym wymaga potwierdzenia w kolejnych badaniach na większej grupie chorych. Wydaje się, że interesujące może być również zbadaniezależnościekspresji DDPIVnakomórkachkrwio- twórczych względem ekspresjiinnychchemokin zaangażo- wanych w mechanizmyinterakcji międzykomórkowychjak CXCR4czyCXCL12.

Podsumowanie

Przeprowadzone przez nas obserwacje ekspresji dipeptydylo-peptydazy IVna komórkachjednojądrzastych podczas mobilizacjikomórekkrwiotwórczychwszpiczakuplazmocy- towym są badaniami pilotowymi, ale uzyskane wstępne wyniki potwierdzające zwiększenie ich liczby w materiale pozyskiwanymdoprzeszczepieniakomórekkrwiotwórczych uzasadniająichkontynuację.

Wkład autorów/Authors' contributions

MKK – koncepcja i przygotowanie pracy. SKK – koncepcja pracy, pozyskanie środków (ﬁnansowania). AK – zebranie danych, analiza statystyczna,przygotowanie pracy, przygotowanie literatury. KB, KJ – interpretacja danych. JDS – przygotowaniepracy,przygotowanieliteratury.

Konﬂikt interesu/Conﬂict of interest

Niewystępuje.

Finansowanie/Financial support

Praca powstaław ramachbadania statutowegoNr KNW-1- 068/P/1/0, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego, Wydział LekarskiwKatowicach.

Etyka/Ethics

Treści przedstawione w artykule są zgodne z zasadami DeklaracjiHelsińskiej,dyrektywamiEUorazujednoliconymi wymaganiamidlaczasopismbiomedycznych.

(5)

pi smiennictwo/references

[1] DemirizIŞ,BozdağSC,TekgündüzE,etal.Predictingthe successfulperipheralbloodstemcellharvesting.Transfus ApherSci2013;48(3):411–414.

[2] San-MiguelJ,Perez-SimonJ,MateosMV.Multiplemyeloma, TheEBMTHandbook6thEdition,HaematopoieticStemCell Transplantation,Red.APPerleyJ,ESH.EBMTEdParis 2012;386–401.

[3] BroxmeyerHE.Chemokinesinhematopoiesis.CurrOpin Hematol2008;15:49–58.

[4] PaganessiL,WalkerLA,TanLL,etal.Effectivemobilization ofhematopoieticprogenitorcellsinG-SCFmobilization defectiveCD26+/-micethroughAMD3100-induced disruptionofCXCL12-CXCR4axis.ExpHematol 2011;39:384–390.

[5] PrabhashK,KhattryN,BakshiA,etal.CD26expressionin donorstemcellharvestanditscorrelationwith

engraftmentinhumanhaemopoieticstemcell

transplantation:potentialpredictorofearlyengraftment.

AnnOncol2010;21:582–588.

[6] BarnettD,JanossyG,LubenkoA,etal.Guidelinefortheﬂow cytometricenumerationofCD34+haematopoieticstem cells.PreparedbytheCD34+haematopoieticstemcell workingparty.GeneralHaematologyTaskForceofthe

BritishCommitteeforStandardsinHaematology.ClinLab Haematol1999;21(5):301–308.

[7] BroxmeyerHE,HangocG,CooperS,etal.AMD3100andCD26 modulatemobilizationEngraftmentandsurvivalof hematopoieticstemandprogenitorcellmediatedbythe SDF-1/CXCL12-CXCR4axis.AnnNYAcadSCi2007;1106:1–19.

[8] ChristophersonKW,UralilSE,PorechaNK,etal.G-CSF-and GM-CSF-inducedupregulationofCD26peptidase

downregulatesthefunctionalhemopoieticresponseof CD34+CD38-humancordbloodhaemopoieticcells.Exp Hematol2006;34:1060–1068.

[9] LeeSA,KimYR,YangEJ,etal.CD26/DPPIVlevelsin peripheralbloodandTcellsinpatientswithtype2diabetes mellitus.JClinEndocrinolMetab2013[epubaheadofprint].

[10] HatanoR,OhnumaK,YamamotoJ,DangNH,MorimotoC.

CD26-mediatedco-stimulationinhumanCD8+Tcells provokeseffectorfunctionviaproinﬂammatorycytokine production.Immunology2013;138:165–172.

[11] JiangL,MalikS,LitzowM,etal. Hematopoieticstemcells frompoorandgoodmobilizersarequalitativelyequivalent Transfusion2012;52:542–548.

[12] BonigH,PriestleyGV,OehlerV,PapayannopoulouT.

Hematopoieticprogenitorcells(HPC)frommobilized peripheralblooddisplayenhancedmigrationandmarrow homingcomparedtosteady-statebonemarrowHPC.Exp Haematol2007;35:326–334.