DIAGN. LAB,, 1985, XXI, 3
TADEUSZ GADOMSKI, ELIZA KONDRACKA, MACIEJ SZMITKOWSKI
WPLYW ENDOTOKSYNY BAKTERYJNEJ Z ESCHERICHIA COLI
: NA HEMATOPOEZE U MYSZY
Z Zakładu Diagnostyki Biochemicznej, Instytutu Diagnostyki Laboratoryjnej, Akademii Medycznej w Białymstoku
Przebadano w oparciu o prześledzenie liczby granulocytów, erytrocytów i płytek krwi wpływ endotoksyny bakteryjnej na poszczególne linie komórkowe układu krwio- twórczego w warunkach „in vivo” w okresie 7 dni od iniekcji endotoksyny. Zaobserwowane zmiany w układzie granulopoetycznym miały charakter dwufazowego wzrostu liczby komórek. W układzie erytropoetycznym i trombopoetycznym działanie lipopolisacharydu prowadziło do spadku liczby erytrocytów i płytek z następującą potem tendencją do odbudowy, a nawet wzrostu ich ilości. Zachowanie się liczby badanych komórek i dane literaturowe sugerują fakt uwalniania pod wpływem endotoksyn naturalnych stymula- torów proliferacji poszczególnych linii komórkowych układu krwiotwórczego.
«Wzrost zainteresowania czynnymi lipopolisacharydami spowodowany jest odgrywaniem coraz większej roli pizez bakterie Gram ujemne w patogenezie chorób wywołanych przez drobnoustroje. Już w XIX wieku Klein wykazał, że mikroorganizmy, które nie wytwaizają egzotoksyn mogą mimo to wywierać działanie toksyczne na ustrój. Zawdzięczają to posiadaniu endotoksyn o budowie lipopolisacharydowej, które w warunkach „in vivo” mogą być uwalniane do środowiska jedynie po uszkodzeniu komórki.
Endotoksyny są więc substancjami, z którymi kontaktu nie można uniknąć, a ich stała obecność w przewodzie pokarmowym, a czasowo nawet we krwi może być czynnikiem modyfikującym czynność wielu narządów i procesów. Szczególny wpływ wywierają na układ hematopoetyczny, który jako jeden z pierwszych bierze udział w odpowiedzi na zakażenia, jak również może podlegać stałej stymulacji przez endotoksyny.
Z doniesień literaturowych wynika, że endotoksyny działają przede wszystkim na układ białokrwinkowy powodując w początkowym okresie granulocytopenię i limfopenię (9). Jednocześnie wykazano, iż w 2-3 h po iniekcji endotoksyny następuje uwalnianie z monocytów i makrofagów czynnika stymulującego wzrost kolonii granulocytów in vitro (CSF) „Colony Stimulating Factor”. Może to oczywiście powodować szereg dalszych zmian w proliferacji i dojrzewaniu granulocytów (1, 8).
Wydaje się więc interesujące w jaki sposób czynne lipopolisacharydy o wy- sokiej aktywności biologicznej oddziaływują na hematopoeze oraz czy istnieje zależność między wpływem endotoksyn na poszczególne linie komórkowe szpiku.
Dlatego też podjęto badania mające na celu określenie przebiegu procesu granu- lopoezy, erytropoezy i trombopoezy pod wpływem działania endotoksyn bak- teryjnych.
Nr 3 Wpływ endotoksyny na hematopoczę 149
MATERIAŁ I METODY
Badania przeprowadzono na 34 myszach rasy ,,Swiss” o wadze 20-29 5, którym podawano dootrzewnowo w warunkach jałowych 200 j. endotok bakteryjnej — Lipopolisaccharide B Escherichia coli 0127 :B8 (DIFCO). Do oceny wpływu endotoksyny na hematopoezę postanowiono zastosować pomiar liczby komórek krwi, jako jeden z najbardziej fizjologicznych mier- ników hematopoezy in vivo, nie naruszający środowiska układu krwiotwórczego, a jednocześnie oceniający najbardziej naturalne efekty zmian w przebiegu pro- cesu hematopoezy (14). W tym celu krew od myszy pobierano z żyły ogonowej co 24 h przez 7 dni po uprzednim wyznaczeniu liczby granulocytów, erytrocytów, płytek krwi i hemoglobiny przed podaniem endotoksyny.
Liczbę krwinek białych oraz stężenie hemoglobiny oznaczono przy pomocy zestawu hematologicznego ZH-82-M-2. .
W celu oceny liczby granulocytów wykonywano jednocześnie rozmaz krwi barwiony metodą Papenhaima i obliczano odsetkową zawartość granułocytów. Obliczano, jaką część liczby leukocytów stanowi stwierdzony odsetek. Oznaczanie liczby krwinek czerwonych dokonano metodą komorową. Do oceny liczby krwinek płytkowych zastosowano metodę bezpośredniego liczenia w mikroskopie kontrastowo-fazowym (2).
Stymulowanie lub hamowanie układu erytropoetycznego, granulopoetycznego i trombopoetycznego przez endotoksyny wyrażono w procentach przyrostu lub spadku liczby badanych komórek we krwi myszy w okresie siedmiu dni od iniekcji endotoksyny. Obliczenia wykonywano posługując się wzorem:
m BxC
G — procent spadku lub przyrostu liczby badanych komórek, A — suma poszczególnych komórek z wszystkich pobrań,
B — liczba granulocytów, trombocytów lub erytrocytów przed iniekcją endotoksyny, , Ć — liczba pobrań krwi (7).
Uzyskane wyniki badań poddano analizie statystycznej w oparciu o test Studenta dla dużych prób (12). Porównania statystyczne przeprowadzono między największego wzrostu lub spadku liczby poszezególnych komórek krwi po po- daniu endotoksyny, Dla obliczonej wartości odczytywano prawdopodobieństwo z tablic rozkładu normalnego. Przyjęto iż różnica między wartościami prawidło- wymi, a obserwowanymi jest statystycznie istotna jeżeli P < 0,05. Stopień skorelowania pomiędzy badanymi parametrami oceniano na pod- stawie wartości współczynnika korelacji (r) (12).
WYNIKI
Wyniki badań zostały przedstawione na rycinach, gdzie strzałką zaznaczono dzień iniekcji endotoksyny, linią poziomą przerywaną wartości przed podaniem endotoksyny, a wartości uzyskane podczas trwania eksperymentu zaznaczono linią ciągłą. Spadek lub przyrost wartości przedstawiono graficznie poprzez zakreskowanie stwierdzonej różnicy.
Bezwzględne wartości liczby granulocytów w czasie 7 dni po iniekcji endo- toksyny przedstawia ryc. 1. Zaehowanie się wartości granułocytozy miało cha-
150 T. Gadomski i inni — Nr 3
|
na
Liczba granułocytów» ЮЗ O m Now A
ŚJ | 1 af Ą: 4 4 1 1 4 4
0 2 3 ри! 4 5 6 7 , 0 1 2 3 Ne 4 5 6 7
Ryc. 1. Liczba granulocytów krwi myszy w 7 Ryc. 2. Liczba erytrocytów krwi myszy w 7 dni po dootrzewnowej iniekcji endotoksyny. dni po dootrzewnowej iniekcji endotoksyny.
rakter dwufazowy. Wartość średnia liczby granulocytów z dwóch pomiarów wykonanych przed podaniem endotoksyny wynosiła 3750-1192 komórek/ul.
W pierwszej dobie po iniekcji lipopolisacharydu widoczna była wybitna granulo- cytoza, która posiadała maksymalną wartość 6830 granulocytów/ul. Obserwo- wany wzrost był statystycznie znamienny P < 0,001. Począwszy od 4 dnia miał miejsce ponowny przyrost liczby granulocytów z maksymalną wartością 5610 granulocytów/ul uzyskaną w 6 dniu trwania eksperymentu. Wzrost ten był statystycznie istotny P < 0,01. Całkowity przyrost liczby granulocytów po 7 dniach od podania endotoksyny wynosił 44% wartości oznaczonych i uznanych za prawidłowe.
Se wor 170" |
== >
a , Spo ;
= 5 50 8 7)
5/40 8 $ 130 Е
Ę 100 ‘
Я
1 > 1% 1 ł
чет 00———012,,8 4 5677
` Dni Dni
= "TT
Ryc. 3. Stężenie hemoglobiny we krwi myszy Ryc. 4. Liczba płytek krwi myszy w 7 dni w 7 dni po dootrzewnowej iniekcji endotoksyny. po dootrzewnowej iniekcji endotoksyny.
Ryc. 2 jest graficznym przedstawieniem zmian liczby erytrocytów w czasie 7 dni po podaniu endotoksyny. Wyznaczona wartość prawidłowa wynosiła 8 232 413 1 418 333 krwinek czerwonych/ul. W czasie pierwszych dni po poda- niu lipopolisacharydu obserwowany był spadek liczby erytrocytów z wartością minimalną 6 451 875 komórek/ul. Spadek ten był statystycznie znamienny P < 0,001. Sumaryczny spadek liczby erytrocytów obserwowany po 7 dniach
wynosił —— 16,83%, wartości prawidłowych. 5
Zmiany wartości hemoglobiny zachodzące pod wpływem endotoksyny przed- stawia ryc. 3. Wyznaćzona wartość prawidłowa hemoglobiny wynosiła 161 +-21 g/l. P6 podaniu endotoksyny nastąpił spadek stężenia hemoglobiny osiągając najmniejszą wartość w 5 dniu trwania eksperymentu 126 g/l. Różnica między wartością prawidłową hemoglobiny, a obserwowaną w 5 dniu była statystycznie
Nr 3 Wpływ endotoksyny na hematopoeze 151
znamienna P < 0,01. Sumaryczny spadek wartości hemoglobiny po 7 dniach wynosił — 17,1%, wartości prawidłowych.
Ryc. 4 przedstawia zmiany liczby płytek krwi zachodzące pod wpływem miejsce wybitna trombocytopenia, która osiągnęła wartość 248 071 krwinek płytkowych/ul. Obserwowany spadek liczby płytek był statystycznie znamienny dwóch dniach niewielka trombocytoza, która osiągnęła liczbę 750 275 komórek/ul. P < 0,01. W 4 dniu nastąpił powrót do wartości prawidłowych, a w następnych Różnica między wartością prawidłową, a obserwowaną wartością trombocytozy była statystycznie istotna P < 0,05. Całkowity spadek liczby płytek po 7 dniach wynosił-17,8%, wartości prawidłowych.
Analiza statystyczna uzyskanych wyników wskazuje na różny stopień skorelo- wania pomiędzy badanymi parametrami. Zachowanie się liczby granulocytów w ciągu 7 dni trwania eksperymentu było skorelowane ze zmianami wartości erytrocytów (r = —0,27)i trombocytów (r = —0,40). Najniższy stopień skorelo- wania stwierdzono w przypadku zmian zachodzących w układzie erytrocytów i trombocytów (r = +-0,1), natomiast obliczony współczynnik korelacji dla hemoglobiny i erytrocytów wynosił (r = +0,84) со świadczy o wysokiej korelacji | między tymi parametrami.
DYSKUSJA
Badania nasze wykazały, iż endotoksyny bakteryjne wywierają wpływ na wszystkie linie komórkowe hematopoezy. Zastosowany w eksperymencie pomiar liczby komórek co 24 h przez 7 dni pozwolił na uchwycenie zmian następujących u myszy zarówno pod bezpośrednim wpływem endotoksyny, jak i późniejszych efektów będących następstwem uwalniania z komórek krwi, substancji mogących regulowaé poszczególne linie hematopoetyczne (9, 14).
W badanym układzie pomiarowym obserwowana granulocytoza wydaje się być zgodna z obserwacjami dokonanymi przez Morley i wsp. (8), którzy wykazali wzrost liczby granulocytów w 6 godz. po dootrzewnowym podaniu endotoksyny i powrót do wartości prawidłowych po 48 godz. W naszych bada- niach wzrost liczby granulocytów następował także w pierwszej dobie lecz po- wrót do wartości prawidłowych miał miejsce po 72 godz. Różnice w uzyskanych wynikach spowodowane mogą być stosowaniem różnych endotoksyn bakteryj- nych.
Granulocytoza obserwowana w pierwszym etapie jest przypuszczalnie wy- nikiem szybkiej mobliizacji granulocytów z puli rezerwowej szpiku do krwi obwodowej (1). Spowodowane może to być wpływem czynnika uwalniającego granulocyty (NRF) „Neutrophil Releasing Factor” na skutek spadku liczby tych komórek we krwi obwodowej (3). Wydaje się jednak, że na proces wczesnej granulocytozy składa się nie tylko uwalnianie granulocytów z puli rezerwowej nika to z analizy czasu dojrzewania granulocytów. Pierwsza odpowiedź może pochodzić ze szczebla mielocyta (czas dojrzewania trwa 2-3 dni), a następnie do odpowiedzi dołączają się komórki macierzyste (13). Jest dobrze udokumentowane, iż głównym źródłem ĆSF jest układ monocyto- wo-makrofagowy, a zasadniczy wpływ na granulopoezę wywiera CSF wytwa- rzany przez te komórki obecne właśnie w szpiku (6, 11). Okazało się również,
152 T. Gadomski ż inni Nr 3
iż granulocyty inkubowane z ludzkimi komórkami śródbłonka naczyń w obecno- ści endotoksyn mogą powodować wzrost produkcji CSF przez te komórki.
Wstrzyknięcie lipopolisacharydu prowadzi do szybkiej marginacji granulocytów, co może dawać w rezultacie ścisły kontakt z komórkami tego śródbłonka. Mecha- nizm ten może także być jednym ze sposobów szybkiego uwalniania CSF in vivo (4). Należy przy tym podkreślić, iż same granulocyty są źródłem nie tyle aktywno- ści stymulującej co hamującej granulopoezę, a ich rozpad pod wpływem endo- toksyny może przeciwdziałać wpływom CSF (1, 9).
Morley i wsp. badali osoczowy CSF i stwierdzili odwrotną zależność jego poziomu w stosunku do liczby granuloeytów obwodowych (8). Uważa się, iż dojrzałe granulocyty obwodowe muszą w pewien sposób kontrolować granulo- poezę. Wyniki prac Mahmod i Robinson wskazują na hamujący wpływ dojrzałych granulocytów na granulopoezę także poprzez usuwanie mikroorganizmów i ich produktów. W tym ujęciu czynna masa krążących i tkankowych granulocytów może determinować powstawanie CSF (6).
Gwałtowna trombocytopenia była pierwszą zmianą obserwowaną w układzie trombopoetycznym pod wpływem lipopolisacharydu. Jest ona prawdopodobnie następstwem endotoksycznych zakrzepów w krążeniu płucnym i śledzionowym (7, 9). Obserwowana trombocytopenia może być też wynikiem” zatrzymania krwi w małych naczyniach kapilarnych w efekcie bezpośredniej interakcji endo- toksyn z krwinkami płytkowymi (17). Gwałtowny i głęboki spadek liczby krwinek płytkowych w porównaniu z zachowaniem się erytrocytów i granulocytów świad- czyć może, iż płytki krwi są komórkami najbardziej wrażliwymi na działanie endotoksyn (15, 18).
Pod wpływem endotoksyn początkowo obserwuje się spadek liczby krwinek czerwonych podobnie jak w układzie trombocytarnym. Jest to prawdopodobnie wynikiem niszczenia tych komórek przez endotoksynę (7). Spadek liczby ery- trocytów prowadzi do spadku ciśnienia parcjalnego tlenu na poziomie tkanek, a to stanowi bezpośrednią przyczynę wyzwalającą produkcję erytropoetyny (5).
Z prac Reissmann; Udupa i wsp. (10, 16) wynika, że endotoksyny mają zdolność indukcji erytroidalnych komórek macierzystych. Indukcja ta nie wymaga obecności erytropoetyny. Różnice czasowe w indukowaniu komórek macie- rzystych przez endotoksyny w porównaniu do erytropoetyny sugerują różny mechanizm działania. Maksymalny efekt stymulujący endotoksyn występuje w granicach 72—76 h, natomiast erytropoetyny po 16 godzinach. Wydaje się więc, że endotoksyny działają na proliferację niezróżnicowanych komórek ma- cierzystych. Wynika z tego, iż obserwowany wzrost liczby erytrocytów w bada- nym układzie jest wynikiem działania zarówno erytropoetyny jak i bezpośred- niego działania endotoksyn. Wysoki stopień skorelowania jak i podobne procento- we spadki hemoglobiny i erytrocytów sugerują, że zmiany stężenia hemoglobiny są wynikiem zmian w liczbie erytrocytów. .
Obserwacje zachowania się liczby poszczególnych komórek krwi w pierwszych dniach po podaniu endotoksyn jak i doniesienia literaturowe sugerują, że w pierw- szym etapie działania lipopolisacharydów dochodzi do niszczenia komórek krwi.
Rozpad komórek staje się bodźcem do uwalniania wielu czynników regulatoro- wych, które w sposób wtórny mogą oddziaływać na stymulację procesu hema- tepoezy. Zbyt krótki czas pomiaru (7 dni) umożliwił jedynie uchwycenie ten- dencji wzrostowej w przypadku płytek i erytrocytów. Natomiast zachowanie się liczby granulocytów w pełni potwierdziło wysuniętą koncepcję.
NT 5 Wpływ endotoksyny na hematopoezę | 153 Т. Гадомски, Э. Кондрацка, М. Шмитковски
ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ SHEOTOKCHHOB КИШЕЧНЫМИ ПАЛОЧКАМИ НА КРОВЕТВОРЕНИЕ ОСВОБОЖДАЕМЫХ У МЫШЕЙ
Содержание
Влияние эндотоксина освобождаемого кищечными палочками на поведение отдельных клеточных линий кроветворной системы исследовалось in vivo B течение 7 дней после то инъекции у мышей, исходя из количества гранулоцитов, эритроцитов и тромбоцитов.
эритро- и тромбоцитопоэтической системах липополисахарид вызывал понижение коли- чества эритроцитов и тромбоцитов с последующей тенденцией к восстановлению, а даже приросту этого количества. Полученные данные и данные из литературы указывают на факт воздействия SHNOTOKCHHOB Ha €CTECTBEHHBIE стимуляторы пролиферации отдельных клеточных линий кроветворной системы.
T. Gadomski, E, Kondracka, M. Szmitkowski
THE EFFECT OF ENDOTOXIN FROM ESCHERICHIA HAEMATOPOIESIS COLI ON MOUSE Summary
Counts of granulocytes, erythrocytes and platelets were determined in the peripheral blood of mice during 7 days after intraperitoneal injection of the endotoxin, A two-peaked rise was observed in the granulocyte count. Erythropoiesis and thrombocytopoiesis were depressed after the injection but increased after 2-3 days. In the light of these results and a literature survey it may be concluded that the endotoxin release a natural specific stimulator of every cell line growth in haematopoiesis,
PISMIENNICTWO
1. Craddock C., Perry J., Ventzke L., Lawrence J.: Evaluation in normal and disease states, Blood, 1960, 15, 840—854. of marrow granulocytie reserves 2. Dacie I., Lewis S.: Practical Heamatology, Churchill, London, 1963.
3. Hammond W., Price T., Dole D.: Canine cyclie hematopoiesis administration, Blood, 1978, 52, 1170-1177, effects of chronic endotoxin induced release of colony stimulating factors by adherent leukocytes in the presence of fresh and heat — inactivated autologus serum, Scand J. Haematol., 1980, 25, 221-295, 5. Ławkowicz W., Krzemińska J.: Kliniczna diagnostyka Warszawa 1982, różnicowa w hematologii, PZWL 6. Mahmood T., Robinson W: Granulocyte modulation of endotoxin stimulated ting activity (CSA) production, Blood, 1978, 51, 879-887. . colony stimula- 7% Mc D., Shapiro S.: Alterations in the blood coagulation system induced by bacterial I. In vitro generalized Shwartzman reaction, J. Exp. Med., 1958, 107, 353-367. endotoxin 8. Morley A., Richard K., Howard D., Stohlman F.: Studies on the regulation IV Possible humoral regulation, Blood, 1971, 37, 14-20. . of granulopoiesis, 9. Quesenberry P., Morley A., Stohlman F., Rickard K., Howard D., Smith toxin on granulopoisis and colony stimulating factor, New, Engl. J. Med., 1972, M.: Effect of endo- 286, 227-231, 10. Reissmann K., Udupa K., Labedzki L.: Induction of erythoid colony forming murine spleen by endotoxin, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1976, 153, 98-101. cells (CF U-e) in 11. Shimizu M., Onoda M., Shinoda M., Shikita M.: Effect of various immunomodulators the production of Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating spleen cell cultures, J. Pharm, Dyn., 1983, 6, 415-422, Factor (GM-CSF). in mouse on 12. Sobotka A.: Elementy matematyki wyższej, 1972.
13. Szmigielski S.: Współczesne testy kliniczne granulopoezy w rozpoznawaniu zakazen bakteryjnych, Diagn. Lab., 1974, 10, 289—297 i réznicowaniu 14, Szmitkowski М. Metody badania aktywności granulopoetycznej, 231-239, Diagn. Lab., 1980, 16,
154 T. Gadomskż i inni " Nr3
15. Thomas L.: The physiological disturbances produced by endotoxin, Ann. Rev. Physiol., 1954, 16, 467—478.
16. Udupa K., Reissmann K.: In vivo and in vitro effect of bacterial endotoxin on erythroid precursors (CFU-E and ERC) in the bone marrow of mice, J. Lab. Clin. Med., 1977, 89, 278-283.
Washida S.: Endotoxin receptor site. I Binding of endotoxin to platelets, Acta Med. Okayama, 1978, 32, 159-167.
Well M., Mac Lean D., Visscher M., Spink W.: Studies on the circulator changes in the dog produced by endotoxin from gram-negative microorganisms, J. Clin. Invest, 1956, 35, 1191-1197.
17.
18.
Adres autora: Zakład Diagnostyki Biochemicznej Instytut Diagnostyki Laboratoryjnej, Akademia Medyczna, ul. M. Skłodowskiej-Curie 24 A 15-276 BIAŁYSTOK.
KOMUNIKAT
Sympozjum Polskiego Towarzystwa Reumatologicznego Sopot 14—15 czerwca 1986
na temat: „WSKAŹNIKI STANU ZAPALNEGO W CHOROBACH TKANKI
. ŁĄCZNEJ”
Zgłaszanie referatów i uczestnictwa do 31 grudnia 1985 r.
Streszczenia referatów prosimy nadsyłać do końca lutego 1986 r. na adres Komitetu Organizacyjnego.
Adres Komitetu Organizacyjnego:
Wojewódzki Zespół Reumatologiczny 81-967 Sopot, ul. Grunwaldzka 1/3
telefon centrali: 51-12-01 wewn. 30 lub wewn. 10
Komitet Organizacyjny
