Rak jasnokomórkowy jest najczêst- szym nowotworem nerki u ludzi doro- s³ych. W patogenezie tego nowotworu istotn¹ rolê przypisuje siê IL-6. Do g³ównych funkcji tej cytokiny nale¿¹ udzia³y w regulacji odpowiedzi immu- nologicznej, wzmacnianiu reakcji za- palnej oraz w krwiotworzeniu. IL-6 jest wydzielana przez monocyty, makrofa- gi, fibroblasty, komórki œródb³onka, lim- focyty T i B, a tak¿e komórki nowotwo- rowe ró¿nego pochodzenia, w tym i ra- ka nerki. Uwa¿a siê równie¿, ¿e IL-6 stymuluje proliferacjê komórek raka nerki. IL-6 oddzia³uje na komórki po- przez swoisty receptor, który sk³ada siê z dwóch podjednostek alfa (gp80) i be- ta (gp130).
Aby oceniæ rolê IL-6 w mikroœrodowi- sku raka nerki, postanowiono oceniæ ekspresjê mRNA dla IL-6 oraz podjed- nostek alfa i beta jej receptora w gu- zach nowotworowych oraz w zdrowej tkance nerki. Badaniami objêto 44 cho- rych: 18 kobiet i 26 mê¿czyzn, u któ- rych wykonano nefrektomiê z powodu raka jasnokomórkowego nerki. Z tkan- ki nowotworowej wyizolowano komór- ki, które nastêpnie hodowano in vitro.
Z tkanki nowotworowej, z tkanki nie za- jêtej przez nowotwór oraz z hodowli ko- mórkowej izolowano RNA, które pod- dawano procesowi odwrotnej trans- krypcji. Uzyskane DNA amplifikowano przy u¿yciu metody PCR stosuj¹c pri- mery dla IL-6 i podjednostek alfa i be- ta receptora dla IL-6.
Ekspresjê IL-6 w tkance zdrowej wyka- zano w 45 proc. analizowanych przy- padków, w tkance nowotworowej w 77 proc., a w hodowli komórek guzów ner- ki w 54 proc. Podjednostka alfa recep- tora IL-6 obecna by³a w 59 proc. ko- mórek zdrowych, w 84 proc. komórek nowotworowych oraz w 70 proc. komó- rek w hodowli. Ekspresjê podjednost- ki beta receptora wykryto w 70 proc.
tkanek zdrowych, w 82 proc. tkanek nowotworowych oraz w 57 proc. ho- dowli komórek rakowych. Nasze bada- nia wykaza³y wy¿sz¹ ekspresjê IL-6 w mikroœrodowisku raka jasnokomór- kowego nerki ni¿ w tkance zdrowej, po- chodz¹cej z tego samego narz¹du.
Ponadto, Ÿród³em badanych czynni- ków w znacznym odsetku by³y same komórki nowotworowe. Uzyskane wy- niki œwiadcz¹ o tym, ¿e IL-6 wystêpu- je w mikroœrodowisku raka nerki, w któ- rym obecny jest jej swoisty receptor, co potwierdzaæ mo¿e rolê IL-6 w pato- genezie raka jasnokomórkowego.
S³owa kluczowe: rak jasnokomórko- wy nerki, IL-6, ekspresja mRNA W
Wssppóó³³cczzeessnnaa OOnnkkoollooggiiaa ((22000011)) vvooll.. 55;; 22 ((4455––4477))
WSTÊP
Rak jasnokomórkowy jest najczêstszym nowotworem nerki, stanowi¹cym 3 proc.
wszystkich nowotworów u ludzi doros³ych [1]. Rak ten wystêpuje czêœciej u mê¿- czyzn (5:1), g³ównie w 50.–70. roku ¿ycia.
Tylko 37 proc. chorych z takim rozpozna- niem prze¿ywa 5 lat. U 30 proc. chorych w chwili rozpoznania obecne s¹ ju¿ prze- rzuty w narz¹dach odleg³ych (p³ucach, tkankach miêkkich, koœciach, w¹trobie).
Rak jasnokomórkowy wywodzi siê z na- b³onka kanalików proksymalnych.
Interleukina 6 (IL–6) odgrywa wa¿n¹ ro- lê w zapewnieniu sprawnego funkcjonowa- nia mechanizmów obronnych organizmu.
Jest produkowana przez szereg komórek uk³adu immunologicznego (limfocyty T, ak- tywowane limfocyty B, makrofagi, monocy- ty – szczególnie po stymulacji). IL–6 modu- luje wzrost szpiczaków, guzów szyjki maci- cy oraz hamuje wzrost niektórych guzów litych (raka gruczo³u piersiowego, czerniaka, raka p³uc, raka nerki). Wykazano równie¿,
¿e komórki niektórych nowotworów mog¹ tê cytokinê wytwarzaæ. Ostatnio wykazano au- tokrynow¹ stymulacjê proliferacji komórek raka nerki IL–6. IL–6 wp³ywa na komórki poprzez wi¹zanie siê z b³onowym komplek- sem receptorowym, który sk³ada siê z pod- jednostki alfa (gp 80, IL–6R) – wi¹¿¹cej IL- 6 oraz podjednostki beta (gp 130, CD 130) – przekaŸnika sygna³u [2]. Najpierw IL-6 ³¹- czy siê z podjednostk¹ alfa, nastêpnie po- wsta³y kompleks przy³¹cza 2 podjednostki beta i dochodzi do przekazania sygna³u do wnêtrza komórki.
Celem pracy by³a ocena ekspresji IL–6 oraz podjednostki alfa i beta jej receptora
w obrêbie raka jasnokomórkowego nerki, w tkance zdrowej tej samej nerki i w pierwot- nej hodowli komórek wyizolowanych z guza.
MATERIA£Y I METODY
Chorzy
44 chorych: 18 kobiet w wieku 41–81 lat (mediana 63) i 26 mê¿czyzn w wieku 39–86 lat (mediana 61) z rakiem jasnoko- mórkowym nerki zoperowano w latach 1997–1998 w Szpitalu im. J. Strusia w Po- znaniu. U 17 chorych histopatologicznie rozpoznano carcinoma clarocellulare w stopniu G1, u 10 chorych w stopniu G2, a u 14 chorych carcinoma granulocelulare w stopniu G2.
Hodowle pierwotne
raka jasnokomórkowego nerki
Z 44 usuniêtych operacyjnie guzów ner- ki o ró¿nym typie histopatologicznym za-
³o¿ono pierwotne jednowarstwowe hodow- le komórkowe. W sterylnych warunkach tkankê rozkawa³kowano, a nastêpnie tra- wiono kolagenaz¹ (0,14 proc.) i DNA-z¹ typu I (0,1 proc.). Wyizolowane komórki hodowano w po¿ywce DMEM i F12 (1:1), wzbogaconej w 10-procentow¹ surowicê p³odow¹ cielêc¹ (FCS) i antybiotyk (gen- tamycynê).
Izolacja RNA z hodowanych komórek raka jasnokomórkowego nerki, tkanek nowotworowych oraz tkanki zdrowej
RNA izolowano stosuj¹c metodê Chom- czyñskiego i Sazzil. Uzyskane RNA zawie- szano w wodzie z dodatkiem DEPC i pod- dawano dalszej analizie.
Ekspresja IL-6, IL-6R i gp130 w raku jasnokomórkowym nerki, tkance oko³oguzowej
i hodowli komórkowej*
Expression of interleukin-6 and its receptor subunits in the microenviroment of renal cell cancer
Ma³gorzata Mackiewicz-Wysocka
1, Aldona Karczewska
1, Zbigniew Kwias
2, Andrzej Mackiewicz
11Zak³ad Immunologii Nowotworów Akademii Medycznej w Poznaniu i Wielkopolskie Centrum Onkologii
2Katedra i Klinika Urologii Akademii Medycznej w Poznaniu
Renal cell cancer (RCC) is the most common adult cancer of the kidney.
IL-6 plays an important role in patho- genesis of the RCC. IL-6 exhibits mul- tiple biological activities such as re- gulation of immunological responses, promotion of acute inflammation and haematopoesis. IL-6 is produced by monocytes, macrophages, fibrobla- sts, endothelial cells, T and B cells and also by many different cancer cells, including RCC cells. IL-6 also stimulates proliferation of RCC cells.
IL-6 exerts its activity via its receptor complex which consists of two subu- nits: alpha (gp80) and beta (gp130).
We decided to evaluate the expres- sion of mRNA encoding IL-6 and for alpha and beta subunits of IL-6 re- ceptor in tumors and healthy kidney tissue. Cancer cells from tumors we- re isolated and cultured in vitro. In 44 patients, 18 women and 26 men ne- phrectomy due to RCC was perfor- med. Total RNA was isolated from tu- mors, healthy tissues and from cultu- red cells. After reverse transcription obtained DNA was amplified using primers for IL-6 and for alpha and be- ta subunits of IL-6 receptor. We de- monstrated expression of IL-6 mRNA in 45% of healthy tissues, in 77% of cancer tissues and in 54% of cancer cells cultured in vitro. The alpha and beta subunits of IL-6 receptor were expressed in 59% and 70% of heal- thy tissues, in 84% and 82% of can- cer tissues and in 70% and 57% of cultured cells respectively. We de- monstrated higher expression of IL-6 in renal cell carcinoma microenviron- ment, than in healthy kidney tissues.
The tumor cells were mostly the ma- in source of studied factors. Obtained results indicate that IL-6 and its re- ceptor subunits are present in the mi- croenvironment of RCC and may play a role in the pathogenesis of renal cell carcinoma in vivo.
Key words: renal cell cancer (RCC), IL-6, expression of mRNA
W
Wssppóó³³cczzeessnnaa OOnnkkoollooggiiaa ((22000011)) vvooll.. 55;; 22 ((4455––4477))
Ryc. 1. Ekspresja IL-6 w badanych tkankach
Ryc. 2. Ekspresja IL-6R w badanych tkankach 90
80 70 60 50 40 30 20 10 0
120
100
80
60
40
20
0 tkanka zdrowa
tkanka zdrowa
guz G1 guz G2
guz G1 guz G2
hodowla komórek G1
hodowla komórek G2
hodowla komórek G1
hodowla komórek G2
proc.proc. ekspresja
IL-6
ekspresja IL-6R
Ryc. 3. Ekspresja gp130 w badanych tkankach i hodowlach komórkowych 100
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
tkanka zdrowa
guz G1 guz G2 hodowla
komórek G1
hodowla komórek G2
ekspresja gp130
proc.
Ekspresja IL-6, IL-6R i gp130 w raku jasnokomórkowym nerki, tkance oko³oguzowej i hodowli komórkowej
47
Reakcja odwrotnej transkrypcji
Do 1 µg RNA rozpuszczonego w 4 µl sterylnej wody dodano 1 µg 50 M heksa- merów i inkubowano przez 2 min w temp.
90°C. Do och³odzonej do temp. 42°C mie- szaniny dodano: 4 µl buforu 4RT, 8 µl 10 M dNTPs, 1 µl odwrotnej transkryptazy AMV (250U/µl) i 1 µl (280/µl) inhibitora RNA-zy.
Nastêpnie mieszaninê inkubowano przez 1 godz. w temp. 42°C.
Reakcja PCR
W celu amplifikacji fragmentów cDNA, uzyskanych w wyniku reakcji RT na matry- cy RNA, przeprowadzono reakcje PCR, do- daj¹c do 1 µl mieszaniny reakcyjnej RT 9 µl roztworu Master-Mix, który zawiera³ primery swoiste dla poszczególnych czynników.
Primery dla receptora alfa i beta zosta³y skonstruowane na podstawie programu Oligo Vers 5.0. Primery dla GAPDH i IL–6 zosta³y skonstruowane na wzór opublikowanych wcze- œniej sekwencji. Wszystkie primery zosta³y wy- produkowane przez firmê Eurogentec (Belgia).
Dla ka¿dej pary primerów, bior¹c pod uwagê temperaturê topnienia i d³ugoœæ produktu, ustalono warunki PCR. Poni¿ej przedstawiono sekwencje stosowanych primerów. Pod nume- rem 1. primer w orientacji sens, pod nume- rem 2. primer w orientacji anty-sens.
GAPDH
1:5’ GGT CGG AGT CAA CGG ATT TG 3’
2:5’ ATG ACG CCC AGCC CTT CTC CAT 3’
IL-6
1:5’ ATG AAC TCC TTC TCC ACA AGC GC 3’
2:5’ GAA GAG CCC TCA GGC TGG ACT G 3’
IL-6R
1:5’ TGC TGA CCA GTC TGC CAG GAG A 3’
2:5’ ACA CTA CTG GCG ACG CAC ATG 3’
gp130
1: 5’ TGT TGA CGT TGC AGA CTT GG 3’
2: 5’ TCT GGA GGC AAG CCT GAA AT 3’
Powsta³e produkty oceniano poprzez analizê restrykcyjn¹. Ka¿de badanie wyko- nywa³y niezale¿nie 2 osoby, powtarzaj¹c je 2-krotnie.
WYNIKI
Ekspresja interleukiny 6 w badanych tkankach
Ekspresjê IL–6 w tkance zdrowej wyka- zano w 45 proc. analizowanych przypad- ków. W obrêbie guza o stopniu zró¿nico- wania G1 IL–6 wystêpowa³a w 81 proc.
przypadków, a w stopniu zró¿nicowania G2 w 80 proc. W hodowlach komórek nowo- tworowych ekspresjê mRNA dla IL-6 wyka- zano w 41 proc. hodowli komórek guzów nerki o stopniu zró¿nicowania G1 oraz w 68 proc. hodowli z guzów o stopniu zró¿nicowania G2.
Analiza ekspresji receptora alfa IL-6
Ekspresja mRNA receptora alfa IL-6, w zdrowej tkance wyizolowanej z nerki usu- niêtej z powodu zmian nowotworowych wy- stêpowa³a w 59 proc. przypadków. mRNA IL-6R obecne by³o w 100 proc. guzów o stopniu zró¿nicowania G1 oraz w 80 proc. guzów G2. Hodowla komórek nowo- tworowych wyizolowanych z guzów o od- powiednim stopniu zró¿nicowania wykazy- wa³a ekspresjê mRNA IL-6R w 70,5 proc.
przypadków guzów G1 oraz w 72 proc.
przypadków guzów G2.
Ekspresja gp130 w badanych tkankach i hodowlach komórkowych
Ekspresjê mRNA podjednostki beta (gp130) receptora IL-6 w tkance zdrowej wykryto w 70 proc. przypadków. W guzach o stopniu zró¿nicowania G1 mRNA dla gp130 wystêpowa³o w 83 proc., a w gu- zach G2 w 88 proc. przypadków. Hodow- la komórek wyizolowanych z guzów scha- rakteryzowanych jako G1 lub G2 wykazy- wa³a ekspresjê gp130 odpowiednio w 65 i 56 proc. przypadków.
DYSKUSJA
Badania autorów wykaza³y wy¿sz¹ ekspre- sjê IL–6 w mikroœrodowisku raka jasnokomór- kowego nerki ni¿ w tkance zdrowej pocho- dz¹cej z tego samego narz¹du. Pierwotne hodowle komórek nowotworowych wykaza³y,
¿e w znacznym odsetku Ÿród³em pochodze- nia IL–6 s¹ same komórki transformowane.
Ponadto stwierdzono, ¿e komórki pochodz¹- ce z guzów o stopniu zró¿nicowania G2 wy- twarzaj¹ wiêcej IL–6 ni¿ komórki w stopniu G1. Równie¿ Costes i wsp. [3], stosuj¹c de- tekcjê bia³ka IL–6 w skrawkach tkankowych stwierdzili ekspresjê w ok. 50 proc. przypad- ków. Tekanawa i wsp. [4], przy u¿yciu meto- dy Northern Blot wykazali ekspresjê mRNA IL–6 w ponad po³owie przypadków. W bada- niach autorów odsetek guzów, w których stwierdzono ekspresjê mRNA IL–6 by³ wy¿- szy. Jest to prawdopodobnie zwi¹zane z za- stosowaniem bardziej czu³ej metody.
IL–6 mo¿e oddzia³ywaæ na drodze auto- krynowej i parakrynowej na komórki nowo- tworowe. Aby jednak by³y one w stanie od- powiedzieæ na IL–6, musz¹ posiadaæ na po- wierzchni receptor dla IL–6. W zwi¹zku z tym postanowiono oceniæ ekspresjê pod- jednostek receptora w badanych tkankach i hodowlach komórkowych. IL–6R obecny by³ we wszystkich preparatach nowotworo- wych o stopniu zró¿nicowania G1, ale ju¿
tylko w 80 proc. preparatów G2. Ni¿sza ek- presja obserwowana by³a w przypadku ho- dowli komórkowych, chocia¿ nie stwierdza siê ró¿nic miêdzy komórkami w stopniu G1 i G2. Costes i wsp. [3] wykazali, stosuj¹c metody RT–PCR, obecnoœæ mRNA dla IL–6R w 100 proc. guzów niezale¿nie od stopnia zró¿nicowania. Jednak przy pomocy barwie- nia immunohistochemicznego wykryli bia³ko
IL–6R tylko w 26 proc. guzów. Ró¿nica w odsetku nowotworów produkuj¹cych IL–6R mo¿e byæ zwi¹zana z faktem, ¿e nie we wszysktich komórkach dochodzi do transla- cji na matrycy zsyntnetyzowanego mRNA.
W przypadku zdrowej tkanki nerki, me- tod¹ RT–PCR wykazano obecnoœæ IL–6R w 59 proc. przypadków, podczas gdy Co- stes i wsp. [3] metodami immunohistoche- micznymi wykazywali ca³kowity brak eks- presji IL–6R. Ró¿nice w ocenie obecnoœci tego bia³ka mog¹ byæ spowodowane g³ów- nie metodami u¿ytymi do wykrycia obec- noœci IL–6R, jak równie¿ sposobem izola- cji zdrowej tkanki nerki. Równie¿ Tekanawa i wsp. [4], przy pomocy RT–PCR wykazali obecnoœæ mRNA dla IL–6R w 100 proc. ra- ków jasnokomórkowych nerek, ale ocena mRNA dla IL-6R metod¹ Northern Blot by-
³a dodatnia tylko w 26 proc. Nie ma donie- sieñ na temat ekspresji podjednostki gp130 w raku nerki. Badania autorów wykaza³y wysoki odsetek preparatów, w których wy- stêpowa³o mRNA dla gp130. Podobnie w hodowlach komórkowych – mRNA dla gp130 wystêpowa³o rzadziej ni¿ w prepa- ratach operacyjnych. Zjawisko to mo¿e byæ zwi¹zane ze zmianami komórek nowotwo- rowych, zachodz¹cymi in vitro lub te¿ wy- kazywaæ, ¿e komórki te w trakcie transfor- macji trac¹ niektóre geny. Podobne zjawi- sko obserwowano w raku piersi [5].
Uzyskane wyniki wskazuj¹ na wa¿n¹ ro- lê, jak¹ mo¿e odgrywaæ IL–6 w patogenezie raka nerki. Obserwuje siê ekspresjê genu dla IL–6 w mikroœrodowisku guza oraz odpo- wiednich podjednostek jej receptora, co pod- kreœla funkcjonalnoœæ omawianej cytokiny.
PIŒMIENNICTWO
1. Blay J-Y, Negrier S, Combaret V, Attali S, Goillot E, Merrouche Y, Mercatello A, Ravault A, Tourani J-M, Moskovtchenko J-F, Philip T, Favrot M. Serum level of IL-6 as a prognosis factor in metastatic renal cell carcinoma. Cancer Research 1992; 52: 3317-22.
2. Graeve L, Kolorenko TA, Hemman U, Weiergraber O, Dittrich E, Heinrich P C A complex of a soluble IL-6R and IL-6 is internalized via the signal transdu- cer gp 130. FEBS Letters 1996; 399: 131-4.
3. Costes V, Liautard J, Picot M-C, Robert M, Lequ- eux N, Brochier J, Baldet P, Rossi J-F. Expression of the interleukin 6 receptor in primary renal cell carcinoma. J Clin Pathol 1997; 50: 835-40.
4. Tekanawa J, Kanako Y, Fukyumoto M, Fukatsu A, Hirano T, Fukuyama H. Enhanced expression of IL- 6 in primary human renal cell carcinoma. J Natl Cancer Inst 1991; 83: 1668-72.
5. Karczewska A, Nawrocki S, Brêborowicz D, Filas V, Mackiewicz A. Expression of IL-6, IL-6R and gp130 correlates with good prognoses for patients with breast carcinoma. Cancer 2000; 88: 2061.
ADRES DO KORESPONDENCJI M
Maa³³ggoorrzzaattaa MMaacckkiieewwiicczz--WWyyssoocckkaa Zak³ad Immunologii Nowotworów Wielkopolskie Centrum Onkologii ul. Garbary 1561-866 Poznañ e-mail: gmackiewicz@efis2000
*Praca sponsorowana przez KBN 4P05B 035 12
