Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Wrocław University of Environmental and Life Sciences
https://bazawiedzy.upwr.edu.pl
Rodzaj dyplomu / Diploma type Rozprawa doktorska / PhD thesis
Autor / Author Szperlik Jakub
Tytuł / Title
Wpływ zmiany ekspresji genu chs na metabolizm fenylopropanoidów i polimerów ściany komórkowej łodygi lnu oleistego (Linum usitatissimum L.) / Impact of the change in expression of chs gene on metabolism of phenylpropanoids and polymers of the cell wall in the stem of oil flax (Linum usitatissimum L.)
Rok powstania / Year of creation
Promotor / Supervisor Bujak Henryk, Żuk Magdalena
Jednostka dyplomująca / Certifying unit Wydział Przyrodniczo-Technologiczny / Faculty of Life Sciences and Technology Adres publikacji w Repozytorium URL / Publication address in Repository https://bazawiedzy.upwr.edu.pl/info/phd/UPWrfa7b18cc19e2433c89a82a7f479247fe/
Data opublikowania w Repozytorium / Deposited in Repository on 8 paź 2019
UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCŁAWIU KATEDRA GENETYKI, HODOWLI ROŚLIN I NASIENNICTWA
UNIWERSYTET WROCŁAWSKI WYDZIAŁ BIOTECHNOLOGII
JAKUB SZPERLIK
WPŁYW ZMIANY EKSPRESJI GENU CHS NA METABOLIZM FENYLOPROPANOIDÓW I POLIMERÓW ŚCIANY
KOMÓRKOWEJ ŁODYGI LNU OLEISTEGO (LINUM USITATISSIMUM L.)
PRACA DOKTORSKA WYKONANA W ZAKŁADZIE BIOCHEMII GENETYCZNEJ POD KIERUNKIEM PROF. DR HAB. HENRYKA BUJAKA
DR HAB. MAGDALENY ŻUK
WROCŁAW 2016
STRESZCZENIE
Len (Linum usitatissimum L.) jest najczęściej uprawianą w Polsce rośliną włóknistą. Włókno lniane charakteryzuje się wysoką wytrzymałością, chłonnością wody oraz posiada w swoim składzie związki bioaktywne. O właściwościach włókna lnianego decyduje jego kompozycja. Jest ono zbudowane z czterech głównych polimerów: celulozy, hemiceluloz, pektyn i lignin. Poza tym w skład włókna wchodzą białka, woski, związki nieorganiczne i cenne metabolity drugorzędowe stanowiące łącznie ok 10% masy włókna. Jedną z najliczniej reprezentowanych grup związków są flawonoidy syntetyzowane w obrębie szlaku fenylopropanoidowego. Jednym z kluczowych enzymów odpowiedzialnych za syntezę flawonoidów jest syntaza chalkonu, dlatego istotne jest, aby sprawdzić, jak zmiany ekspresji genu syntazy chalkonu wpłyną na zawartość flawonoidów, jak i innych związków fenylopropanoidowych w rozwijającej się roślinie. Ligniny, jeden z podstawowych polimerów ściany komórkowej, w sposób istotny wpływają na właściwości włókna, syntetyzowane są w obrębie szlaku fenylopropanoidowego. Zmiany syntezy flawonoidów mogła więc wpłynąć na zawartość lignin. Jest to szczególnie istotne, jeśli weźmie się pod uwagę, że zmiana zawartości lub kompozycji jednego polimeru ściany komórkowej może indukować zmiany w pozostałych polimerach prowadząc do rearanżacji całej ściany komórkowej.
Istotne wydawało się zatem prześledzenie, jak wyindukowana za pomocą transgenezy represja (W86) i nadekspresja (W92) genu chs będzie objawiała się na kolejnych etapach rozwojowych rośliny. Zbadano zarówno ekspresję genów (kluczowych dla całego szlaku fenylopropanoidowego) jak i poziom fenylopropanoidów na trzech kluczowych stadiach rozwojowych rośliny. Wnikliwej analizie poddano również ekspresję genów regulujących metabolizm oraz zawartość głównych polimerów ściany komórkowej. Wykonano również analogiczne analizy biochemiczne dla włókna lnianego, aby określić, czy wprowadzone modyfikacje przyczyniły się do jego waloryzacji.
Stwierdzono, że ekspresja transgenów pozostaje pod kontrolą ich promotora – odpowiednio rośliny W92 wykazują stabilną w rozwoju nadekspresję, a rośliny W86 represję syntazy chalkonu Jednocześnie metaboliczny efekt tej ekspresji, czyli zawartość flawonoidów, jest zależny od stadium rozwojowego rośliny. W młodej tkance (rośliny 4 tygodniowe) niezależnie od rodzaju modyfikacji zaobserwowano wyraźne przekierowanie metabolitów szlaku fenylopropanoidowego w kierunku syntezy lignin przy jednoczesnym obniżeniu poziomu flawonoidów i kwasów fenolowych. Efekt ten jest również widoczny w ekspresji genów szlaku fenylopropanoidowego – widzimy wyraźną aktywację genów prowadzących do syntezy prekursorów lignin. W roślinach znajdujących się w fazie generatywnej wzrostu zaobserwowano wyraźny wzrost zawartości fenylopropanoidów i kwasów
fenolowych. Efekt ten był szczególnie widoczny w przypadku roślin z nadekspresją syntazy chalkonu a towarzyszyło mu ograniczenie syntezy lignin (poziom tego polimeru nie odbiegał istotnie od poziomu odnotowanego dla roślin kontrolnych). Poziom metabolitów koreluje się z poziomem ekspresji genów kodujących enzymy kluczowe dla poszczególnych gałęzi szlaku fenylopropanoidowego. W roślinach z represją genu chs efekt przekierowania szlaku fenylopropanoidowego w kierunku syntezy kwasów fenolowych i flawonoidów jest mniej widoczny a w dojrzałej tkance (etap dojrzałości żółtej) całkowicie ulega niwelacji.
W toku realizacji niniejszej rozprawy ustalono także, że zachodzą istotne zmiany w kompozycji biochemicznej i polimerowej roślin z modyfikacjami chs w porównaniu do roślin kontrolnych w trakcie ich rozwoju. Możemy zatem stwierdzić iż modyfikacja genu syntazy chalkonu w istotny sposób wpływa na cały metabolizm szlaku fenylopropanoidowego, a poprzez regulacje poziomu lignin generuje zmiany w kompozycji i proporcji poszczególnych polimerów ściany komórkowej roślin. Obserwowane zmiany ulegają wprawdzie znaczącemu wyrównaniu w roślinach na etapie dojrzałości żółtej, jednakże efekt wzmożonej akumulacji związków fenylopropanoidowych, obserwowany szczególnie dla roślin z nadekspresją syntazy chalkonu, pozostaje stabilny przez cały czas życia rośliny.
Godna podkreślenia jest zaobserwowana w przypadku roślin z nadekspresją genu syntazy chalkonu wzmożona akumulacja związków fenylopropanoidowych (flawonoidy, kwasy fenolowe, związki benzoesowe) we frakcji związanej ze ścianą komórkową w porównaniu do roślin kontrolnych. Cecha ta utrzymuje się praktycznie w całym okresie wzrostu rośliny, a owocuje tym, że włókno z roślin W92 charakteryzuje się wyższą zawartość związków bioaktywnych niż włókno z roślin kontrolnych i z represją genu syntazy chalkonu. Ta właściwość tego włókna pozwala na wykorzystane go do celów biomedycznych.
ABSTRACT
Flax (Linum usitatissimum L.) is the most commonly grown fibrous plant in Poland. Flax fibre is strong, absorbs water well and contains bioactive components. Properties of flax fibre are caused by its chemical composition. Fibre is composed of four main polymers: cellulose, hemicelluloses, pectins and lignins. Other than those, there are also proteins, waxes and valuable secondary metabolites in the fibre, that amount to about 10% of the fibre’s mass. Among the most abundant classes of compounds are flavonoids, which are synthetized within the phenylpropanoid pathway.
One of the key genes in the phenylpropanoid pathway is the chalcone synthase. As flavonoids are synthesized within the phenylpropanoid pathway, it seemed prudent to ascertain how changes in the expression of chs would affect content of flavonoids and other phenylpropanoids in the developing plant. It is important to note that lignins, an important component of flax fibre, are synthesized by the phenylpropanoid pathway as well, so then changes in the synthesis of the flavonoids could therefore impact their content. It is quite important, taking into consideration that it is agreed in the literature that changes of the contents or composition of one of the polymers of the cell wall could induce changes in the others, leading to rearrangement of the cell wall as a whole.
It therefore seemed important to understand how the transgenes inducing repression (W86) or overexpression (W92) of chs are regulated during the life of the plant. Both gene expression and content and chemical composition of phenylpropanoids during three critical stages of plant development were therefore investigated. Transcript level of genes regulating metabolism of main cell wall polymers as well as content of those polymers was researched as well. Analogical analyses were carried out for the fibre, to ascertain whether the modifications lead to improvement of its properties or not.
It has been established that as far as expression of the transgenes is regulated by their promoter, namely W92 plants show overexpression of chs stable throughout the development, while W86 plants show a stable repression. The metabolomic result of expression however, namely the content of flavonoids, is being controlled by the developmental stage of the plant. The same effect is observed in the expression of the genes from phenylpropanoid pathway, as we see that the genes that take part in the synthesis of precursors of lignins are being activated. Significant increase in the content of phenylpropanoids and phenolic acids was also observed. This effect was particularly pronounced for the plants overexpressing chalcone synthase, where it was accompanied by a reduction of lignins synthesis (content of this polymer was similar to that in the control plants).
Content of the metabolites also correlates with the expression of key genes of the branches of the
phenylpropanoid pathway. As for the plants with chs repression, the effect of redirecting of the phenylpropanoid pathway was less pronounced, to diminish completely in mature plant (yellow maturity phase).
During our investigations it was also observed that there are major differences in biochemical and polymer composition of the plant with chs modifications during their development, compared to control. It may be said then, that modification of the chalcone synthase significantly affects whole phenylpropanoid metabolism and also generates changes in the composition and mutual proportions of polymers of the cell wall as well. The changes being observed diminish in scope in the mature plants, however the effect of increased accumulation of phenylpropanoids, observed especially for the plants with chs overexpression, remains constant throughout the whole plant development.
It seems worthwhile to highlight the increased accumulation of phenylpropanoids (flavonoids, phenolic acids, benzoic compounds) in their fraction bound to the cell wall in comparison to control plants that occurs in the plants overexpressing chalcone synthase. The effect is constant during the entirety of plant development and results in higher content of bioactive compounds in the fibre from W92 plants while compared to both control plants and plants repressing chalcone synthase. This property of this fibre allows for its use for biomedical purposes.
