Genomic Mini AX SWAB&SEMEN SPIN
zestaw do izolacji genomowego DNA z wymazów i nasienia
Protokół
numer katalogowy 025-100S
01
Uwagi
• Proteinazę K, kolumny Mini AX Spin oraz bufor elucyjny E należy przechowywać w temp. od +4 do +8 °C
• Aby uzyskać 1 M DTT (ditiotreitol) należy dodać po 1 ml jałowej wody do fiolki przed rozpoczęciem izolacji DNA. Całkowiecie rozpuścić. Proszek i roztwór przechowywać w temp. -20 °C
• Pojemność wiązania DNA pojedynczej kolumny Mini AX Spin wynosi 15 µg DNA • Bufor elucyjny E traci aktywność przy dłuższym kontakcie z powietrzem! Bezpośrednio
po użyciu należy zawsze szczelnie zakręcać pojemnik zawierający bufor E Przygotowanie próbek:
A. Wymazy:
1. Przygotować odpowiednią ilość probówek typu Eppendorf o pojemności 2 ml (nie ma w zestawie). Do każdej probówki dodać po 700 µl buforu lizującego LSU
2. Pobrać wymaz, następnie odciąć część patyczka wymazowego z pobraną próbką i umieścić w probówce
Odcięta część wymazówki z pobraną próbką powinna być całkowicie zanurzona w buforze lizującym LSU
3. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA B. Nasienie:
1. Pobrać po 100-150 µl nasienia i dodać po 20 µl 1M DTT (ditiotreitolu) 2. Do próbki dodać po 500 µl buforu lizującego LSU
3. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA Protokół izolacji DNA:
1. Do próbek dodać po 20 µl Proteinazy K.
Całość wymieszać i inkubować przez 10 min - wymaz lub 20 min - nasienie w temp. 50 °C. Mieszać od czasu do czasu przez worteksowanie.
Uwaga: Inkubację można przeprowadzać w termomikserze firmy Eppendorf lub jego odpowiedniku, przy parametrach ciągłego mieszania 1400 RPM. W przypadku zastosowania takich warunków lizy można pominąć pkt. 2 protokołu izolacji
Opcjonalne usuwanie RNA. Patrz “Informacje dodatkowe” na końcu protokołu
2. Po inkubacji próbki należy intensywnie wymieszać przez worteksowanie w ciągu 2 min w zakresie 1000-1400 RPM. Zaleca się stosowanie worteksów z odpowiednią przystawką.
Uwaga: Ten krok jest kluczowy dla wydajności izolacji DNA!
A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, 81-451 Gdynia, Poland tel +48 58 6982194 fax +48 58 6228578, www.aabiot.com, info@aabiot.com
Protokół
02
3. Wirować probówki przez 5 min przy prędkości 8 000 x g, aby osadzić na dnie probówek pozostałości niezlizowanego materiału
4. Nanosić po ~ 600 µl supernatantu na kolumny Mini AX Spin znajdujące się w 2 ml probówkach. Wirować kolumny przez 30-60 s przy prędkości 8 000 x g
5. Usunąć zużyte 2 ml probówki i umieścic kolumny Mini AX Spin w nowych 2 ml probówkach (w zestawie). Nanieść po 600 µl pierwszego buforu płuczącego W1 Całość wirować przez 30-60 s przy prędkości 8 000 x g
6. Usunąć zużyte 2 ml probówki i umieścic kolumny Mini AX Spin w nowych 2 ml probówkach (w zestawie). Nanieść po 500 µl drugiego buforu płuczącego W2 Całość wirować przez 30-60 s przy prędkości 8 000 x g
7. Podczas wirowania przygotować probówki elucyjne (nie ma w zestawie) i dodać na ich dno po 5 µl buforu zobojętniającego N
Zobojętnianie próbek DNA. Patrz “Informacje dodatkowe” na końcu protokołu 8. Po wirowaniu ostrożnie usunąć zużyte 2 ml probówki i umieścic kolumny Mini AX Spin
w próbówkach do elucji. Nanieść po 75 µl buforu elucyjnego E i inkubować przez 2 min w temp. pokojowej
Uwaga: Bufor elucyjny E traci aktywnośc przy dłuższym kontakcie z powietrzem. Należy zawsze szczelnie zamykać pojemnik bezposrednio po zakonczeniu pracy z buforem E 9. Wirować przez 30-60 s przy prędkości 8 000 x g
10. Ponownie nanieść na kolumny Mini AX Spin po 75 µl buforu elucyjnego E 11. Wirować przez 30-60 s przy 8 000 x g
12. Usunąć kolumny. Zamknąć probówki zawierające oczyszczone DNA.
Informacje dodatkowe
• Opcjonalne usuwanie RNA. Jeżeli zależy nam na całkowitym usunięciu RNA, to do próbki należy dodać 5 µl RNAzy (10 mg/ml) (nie ma w zestawie, nr kat. 1006-10), a następnie całość wymieszać i pozostawić na 5 min w temp.pokojowej Następnie przejść do punktu 2. protokołu.
• Zobojętnianie próbek DNA. Bufor elucyjny E jest silnie alkaliczny i po zamrożeniu może powodować degradację DNA. Jeżeli oczyszczone próbki DNA mają być przechowywane w formie zamrożonej to bezwzględnie należy je zobojętnić przed zamrożeniem buforem zobojętniającym N. Z naszej praktyki laboratoryjnej wynika, że najwygodniej jest dodać bufor N przed elucją DNA do pustej probówki elucyjnej (punkt 7. protokołu). W trakcie elucji, zawieszone w buforze elucyjnym DNA wymiesza się z buforem N i ulegnie natychmiastowej neutralizacji.
Jeżeli bufor neutralizujący N nie został dodany w punkcie 7. protokołu, to można dodać go po zakończonej izolacji - przed zamrożeniem próbek DNA.
A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, 81-451 Gdynia, Poland tel +48 58 6982194 fax +48 58 6228578, www.aabiot.com, info@aabiot.com
