Czasopismo Polskiego Towarzystwa Andrologicznego
Postępy Andrologii Online
Advances in Andrology Online
http://www.postepyandrologii.pl
Postępy Andrologii
Online
Advances in Andrology Online
Tom 6 • Numer 1 • Czerwiec 2019 Volumin 6 • Number 1 • June 2019 Czasopismo Polskiego Towarzystwa Andrologicznego Journal of Polish Society of Andrology
e-ISSN 2353-8791 ICV = 69,63
Immunohistochemiczna lokalizacja interleukiny 6 (IL-6) w prostacie mężczyzn z łagodnym rozrostem gruczołu. Lokalizacja sygnału w cytoplazmie komórek zrębu prostaty (brązowe zabarwienie). Mikrofotografi e autorstwa mgr mikrobiologii Weroniki Ratajczak, Zakład Histologii i Biologii Rozwoju, Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie. Immunohistochemical localization of interleukin 6 (IL-6) in prostate of man with benign prostatic hyperplasia. Immunopositive signal in the cytoplasm of cells in prostate stroma (brown staining). Micrographs by mgr of microbiology Weronika Ratajczak, Department of Histology and Developmental Biology, Pomeranian Medical University in Szczecin
Marta Olszewska – dr n. med., absolwentka Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu,
biotech-nolog. Współwykonawca 8 projektów grantowych. Laureatka 12 nagród, w tym: 2 American Society of
Andrology oraz Nagrody Polskiego Towarzystwa Andrologicznego im. Prof. Bokińca. Pierwszy autor
i współautor 25 prac naukowych, publikowanych w renomowanych polskich i zagranicznych cza-sopismach naukowych. Członek Polskiego Towarzystwa Andrologicznego, Polskiego Towarzystwa Genetyki Człowieka, Towarzystwa Biologii Rozrodu, Polskiego Towarzystwa Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych, F1000 oraz Europejskiego Towarzystwa Cytogenetycznego. Problem badań nad niepłodnością męską ujmuje w sposób kompleksowy w postaci panelu ugruntowanych badań, co przekłada się na unikatowe dane całogenomowe, wynikające z trzech podejść badawczych: cytogenetycznego (nosiciele aberracji chromosomowych), genomowego (poszukiwanie mutacji odpowiedzialnych za obniżoną liczbę plemników w) oraz epigenetycznego (badanie zmian epigenetycznych w plemniku: metylacja DNA, metylacja histonów, acetylacja vs. integralność chromatyny i dane seminologiczne).
Marta Olszewska – PhD, graduate of the University of Life Sciences in Poznan as biotechnologist. Co-executive of
8 grant projects. Winner of 12 awards, incl. two of American Society of Andrology, and Polish Society of Andrology Award of Prof. Bokiniec for young scientists. The first author and co-author of 25 manuscripts published in renowned Polish and foreign scientific journals. Member of the Polish Society of Andrology, Polish Society of Human Genetics, Society of Reproductive Biology, Polish Laboratory Animal Science Association, F1000, European Cytogeneticists Association. Her scientific interests concern complex analysis of male infertility including: cytogenetics (chromo-some aberrations in human spermatozoa), genomics (searching for mutations responsible for decreased sperm count) and epigenetics (methylation of DNA, histones, acethylation vs. chromatin integrity and seminology).
TRANSLOKACJE CHROMOSOMOWE
WZAJEMNE W NIEPŁODNOŚCI MĘSKIEJ
RECIPROCAL CHROMOSOME TRANSLOCATIONS
IN MALE INFERTILITY
Marta Olszewska , Maciej Kurpisz*
Instytut Genetyki Człowieka, Polska Akademia Nauki w Poznaniu
*Autor do korespondencji / corresponding author: Maciej Kurpisz, Instytut Genetyki Człowieka, Polska Akademia Nauki w Poznaniu, ul. ul. Strzeszyńska 32, 60 ‑479 Poznań
tel.: +48 61 6579 202, e ‑mail: maciej.kurpisz@igcz.poznan.pl
Otrzymano/received: 25.05.2019 r. • Zaakceptowano/accepted: 24.06.2019 r.
Abstract
Overall, about 10–15% of cases with decreased fertility originates from the male genetic factor. It is estimated that approx. 2–8% (or even to 15% in azoospermia) out of all genetic factors constitute chromosomal aberrations, including aneuploidies or structural aber-rations of the chromosomes. The most common structural aberaber-rations observed in general population are chromosomal translocations, with frequencies: 0.143% for reciprocal (RCT), and 0.123% for Robertsonian (Rob) ones. It is known that about 1% of infertile males are RTC carriers while 0.8% are Rob translocations carriers verified in blood samples. Moreover, in males with decreased fertility the total level of structural aberrations found in sperm cells rises about 4 -fold when compared to healthy, fertile males. Chromosomal aberrations may disrupt meiotic segregation of the chromosomes, which leads to a production of genetically imbalanced gametes, and subsequently to an increase of the risk of reproductive failure or to the appearance of genetic defects in the progeny. This review sum-marizes the problem of RCT in male infertility.
Key words: male infertility, chromosome aberrations, aneuploidy, spermatozoa, reciprocal chromosome translocations
Skróty / Abbreviations
aCGH – porównawcza hybrydyzacja genomowa z użyciem mikromacierzy (ang. array comparative genomic hybridization); AZF – czynnik azoospermia (ang. azoospermia factor); BFB – „pęknięcie -fuzja -most” (ang. breakage ‑fusion ‑bridge); BIR – kopiowanie sekwencji DNA poprzez replikację indukowaną pęknięciem (ang. breakage ‑induced replication); CS – odcinek centryczny (ang. centric segment); DSB – pęknięcia obu nici DNA (ang. double strand breaks); FISH – fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (ang. fluorescent in situ hybridization); HR – rekombinacja homologiczna (ang. homologic recombination); ICSI – docytoplazmatyczna iniekcja plemnika (ang. intracytoplasmic sperm injection); IS – odcinek interstycjalny (ang. intrestitial segment); KRC – kompleksowa rearanżacja chromosomowa (ang. complex chromosomal rearrange‑
ment); LCR – powtórzenie o niskiej liczbie kopii (ang. low copy repeat); NAHR – niealleliczna rekombinacja homologiczna (ang. nonallelic homologic recombination); NHEJ – łączenie końców niehomologicznych (ang. nonhomologous end ‑joinin); PAR – region pseudoautosomalny
(ang. pseudoautosomal region); SPPR – parowanie regionów subtelomerowych z rekombinacją proksymalną (ang. subtelomeric pairing with
proximal recombination); SSA – wydłużanie pojedynczej nici (ang. single strand annealing); TAR – regiony zasoscjowane z telomerami (ang. telomeric associated regions); TCW – translokacja chromosomowa wzajemna (ang. reciprocal chromosome translocation); TS – odcinek ulegający
translokacji (ang. translocated segment); WHO – Światowa Organizacja Zdrowia (ang. World Health Organization)
Streszczenie
Czynnik męski na tle genetycznym szacuje się na ok. 10–15% przyczyn obniżonej płodności ogółem, z czego aberracje chromosomowe stanowią 2–8% wszystkich czynników genetycznych, dochodząc nawet do 15% u mężczyzn z azoospermią. Aberracje chromosomowe obejmują aneuploidie oraz aberracje strukturalne chromosomów. W populacji ogólnej najczęściej spotykane aberracje strukturalne chromosomów to translokacje chromosomowe wzajemne (TCW; 0,143%) i Robertsonowskie (Rob; 0,123%). Około 1% niepłodnych mężczyzn jest nosicielami TCW, zaś 0,8% niepłodnych mężczyzn jest nosicielami translokacji Robertosnowskich badanych na poziomie krwi obwodowej. Natomiast całkowity poziom aberracji strukturalnych określanych w plemnikach u mężczyzn o obniżonej płodności może być nawet 4 -krotnie wyższy w porównaniu z grupą mężczyzn płodnych. Aberracje chromosomowe mogą zaburzać proces mejozy poprzez nieprawidłowe rozchodzenie się chromosomów do komórek potomnych, co w konsekwencji prowadzi do wytworzenia części gamet genetycznie niezrównoważonych i tym samym podwyższa ryzyko niepowodzeń rozrodu oraz wystąpienia wad na tle gene-tycznym u potomstwa. Niniejsza praca naświetla zagadnienie występowania translokacji chromosomowych wzajemnych w aspekcie niepowodzeń rozrodu u mężczyzn.
Słowa kluczowe: męska niepłodność, aberracje chromosomowe, aneuploidie, plemnik, translokacje chromosomowe wzajemne
Niepłodność określana jest przez Światową Organizację Zdrowia (WHO, ang. World Health Organization) jako choroba społeczna, która dotyczy ok. 10–18% par w okresie rozrodczym (de Kretser, 1997). Szacuje się, że udział niepowodzeń rozrodu u mężczyzn w niepłod-ności małżeńskiej dochodzi do 40–60% wszystkich przy-padków (Barratt i wsp., 2017; Vander Borght i Wyns, 2018). Przyjmuje się również, że męski czynnik genetyczny (w tym aberracje chromosomowe) stanowi ok. 10–15% przyczyn obniżonej płodności ogółem (Matzuk i Lamb,
2008; Zorrilla i Yatsenko, 2013). Częstość występowania aberracji chromosomowych u mężczyzn z obniżoną płod-nością stanowi średnio ok. 5% (2–8%) wszystkich czyn-ników genetycznych (Ferlin i wsp., 2005, 2006). U męż-czyzn z azoospermią odsetek ten wzrasta do ok. 15%. Najczęstszymi wykrywanymi aberracjami są aneuploidie oraz aberracje strukturalne chromosomów (De Braekeler
i Dao, 1991; Harton i Tempest, 2012; Mau ‑Holzmann, 2005;
Pandiyan i Jequier, 1996). Aneuploidie występujące u czło-wieka wynikają z błędów w segregacji chromosomów
zarówno matczynych, jak i ojcowskich, przez co stoją u podłoża wadliwej gametogenezy. W populacji niepłod-nych mężczyzn istnieje kilku -kilkunastokrotnie wyższe prawdopodobieństwo wystąpienia aberracji chromoso-mowych niż w populacji ogólnej. Dwie najczęściej spo-tykane aberracje strukturalne chromosomów to trans-lokacje Robertsonowskie i chromosomowe wzajemne (ok. 1/500–1/700 urodzeń). Szacuje się, że ok. 1% nie-płodnych mężczyzn jest nosicielami translokacji chro-mosomowych wzajemnych (TCW, ang. reciprocal chromo‑
some translocation) (Bonduelle i wsp., 2002; Gekas i wsp.,
2001; Halgren i wsp., 2018; Xie i wsp., 2018), a całkowity poziom aberracji struktury wykrywany w limfocytach krwi obwodowej u mężczyzn płodnych wynosi ok. 0,7%, przy czym u mężczyzn o obniżonej płodności może być nawet 4 -krotnie wyższy (Templado i wsp., 2005).
Większość analiz chromosomów w plemnikach dotyczy mężczyzn będących nosicielami aberracji chro-mosomowych, zarówno strukturalnych, jak i liczbowych, wykrywanych w limfocytach krwi obwodowej podczas badania kariotypu. Aberracje chromosomowe często nie wpływają na fenotyp osobniczy, w przeciwieństwie do spermatogenezy, gdzie mogą stanowić przyczynę zabu-rzeń procesu mejozy w wyniku nieprawidłowej segregacji chromosomów do komórek potomnych, tym samym pro-wadząc do wytworzenia części gamet niezrównoważo-nych genetycznie. To z kolei podwyższa ryzyko niepo-wodzenia rozrodu oraz posiadania potomstwa z wadami na tle genetycznym (Midro i Stasiewicz ‑Jarocka, 2001a,
2001b; Midro i wsp., 2014).
Translokacje chromosomowe wzajemne
Translokacje chromosomowe wzajemne są wynikiem wzajemnej wymiany fragmentów ramion chromosomów z tej samej pary (TCW homologiczna) lub różnych par chromosomów (TCW heterologiczna). W przypadku TCW homologicznej różnej długości fragmenty ulegające trans-lokacji prowadzą do nierównej wymiany ilości materiału genetycznego. W konsekwencji prowadzi to do zaburzenia koniugacji podczas profazy I podziału mejotycznego i tym samym powstaje 50% gamet z duplikacją i 50% z delecją materiału genetycznego. W przypadku TCW heterolo-gicznej na skutek zaburzeń w profazie I podziału mejo-tycznego powstaje średnio 50% gamet niezrównoważo-nych genetycznie, na skutek czego mogą wystąpić mutacje somatyczne (tzw. efekt pozycji genu) lub zmiany w segre-gacji mejotycznej chromosomów do komórek potomnych (omówiono w dalszej części pracy) (Oliver ‑Bonet i wsp.,
2005a). Nosicielstwo TCW jest w większości przypadków dziedziczne lub też translokacja może powstać de novo (Benet i wsp., 2005).
Nosicielstwo TCW stwierdza się na podstawie analizy kariotypu najczęściej u par z niepowodze-niami rozrodu, u których przesłankę do sprawdzenia kariotypu stanowiły: brak koncepcji, wczesne zgony
noworodków, poronienia samoistne oraz urodzenia dzieci z wadami rozwojowymi. W populacji ogólnej nosiciel-stwo TCW określane jest na ok. 0,143% i obok translo-kacji Robertsonowskich stanowi najczęściej obserwo-waną aberrację chromosomową (Mau ‑Holzmann, 2005). Szacuje się, że 0,7% fenotypowo prawidłowych męż-czyzn z obniżoną liczbą plemników (oligozoospermią) jest nosicielami TCW, które jednocześnie stanowią ok. 16% wykrywanych aberracji w tej grupie mężczyzn. W przypadku mężczyzn o stwierdzonym braku plem-ników w ejakulacie (azoospermia) odsetek nosicieli TCW wynosi ok. 0,5%, a TCW same w sobie stanowią ok. 4% spośród wszystkich obserwowanych aberracji u osób z aoospermią (Mau ‑Holzmann, 2005). Często zdarza się, że wśród nosicieli tej samej TCW w jednej rodzinie mogą być zarówno mężczyźni płodni, jak i niepłodni (np. ojciec i syn, bracia, kuzyni). Jednak przyczyny tego zjawiska pozostają niewyjaśnione (Anton i wsp., 2004; Cora i wsp.,
2002; Estop i wsp., 1992; Johannisson i wsp., 1987; Morel i wsp., 2004a; Olszewska i wsp., 2013, 2019; Rousseaux i wsp., 1995; Vozdova i wsp., 2008; Wiland i wsp., 2007). U większości nosicieli TCW parametry nasienia są pra-widłowe – obecności translokowanych chromosomów najczęściej nie towarzyszą zmiany w rutynowo okre-ślanych parametrach: liczbie, morfologii i ruchliwości plemnika, co stanowi poważny problem przy zapłod-nieniu pozaustrojowym wynikającym z braku przesłanki seminologicznej do niepłodności.
Ryzyko niepowodzeń rozrodu u nosicieli TCW jest istotnie podwyższone, nie tylko ze względu na obecność samej translokacji, ale również z powodu: 1) zastoso-wania jedynie kryterium morfologiczno -motorycznego przy wyborze plemnika do zapłodnienia w technikach wspomaganego rozrodu, przy czym udowodniono brak związku pomiędzy morfologią plemnika a jego geno-typem u nosicieli translokacji chromosomowych (Cassuto
i wsp., 2011); 2) faktu, że odsetek nosicieli TCW wśród
mężczyzn skierowanych na zabieg docytoplazmatycznej iniekcji plemnika (ICSI, ang. intracytoplasmic sperm injec‑
tion) jest 11 -krotnie wyższy (0,98%) w porównaniu
z czę-stością wśród populacji ogólnej nowonarodzonych dzieci (0,09%) (Morel i wsp., 2004a) oraz 3) występowania wyższego poziomu fragmentacji DNA plemnikowego (znanego czynnika istotnie wpływającego na płodność mężczyzny) u nosicieli TCW w porównaniu ze zdro-wymi mężczyznami z populacji kontrolnej (Brugnon i wsp., 2006; Garcia ‑Peiro i wsp., 2011; Olszewska i wsp.,
2013, 2017, 2019).
Segregacja mejotyczna chromosomów
Niezrównoważenie kariotypu u potomstwa nosicieli TCW ma swoje źródło w nieprawidłowej segregacji chromosomów w procesie mejozy. W komórkach roz-rodczych w pachytenie profazy I podziału mejotycznego podczas koniugacji odcinków homologicznych chromo-somów powstaje kwadriwalent, często przypominający kształtem figurę krzyża złożonego ze wszystkich czterech
X i Y do koniugacji dochodzi tylko w krótkim fragmencie pseudoautosomalnym (PAR, ang. pseudoautosomal region)
(Handel, 2004). Tym samym prawdopodobieństwo
zabu-rzenia prawidłowego przebiegu mejozy dla chromosomów płci jest wysokie (Handel, 2004; Martin, 2005, 2008).
Podczas anafazy I podziału mejotycznego chromo-somy rozchodzą się (segregują) na sześć różnych spo-sobów do dwóch komórek potomnych w różnych propor-cjach: 2:2 (segregacja naprzeciwległa, przyległa typu I lub przyległa typu II), 3:1 (wymienna lub trzeciorzędowa) oraz 4:0. Jedynie w wyniku segregacji naprzeciwległej powstają plemniki z kariotypem prawidłowym lub zrównoważonym genetycznie (rycina 1). Zestawienie odsetków poszczególnych kariotypów plemnikowych powstających w wyniku segregacji w czasie mejozy tworzy tzw. wzór segregacji mejotycznej, który jest indywidualny dla każdego nosiciela TCW. Wzór segregacji mejotycznej chromosomów dwóch par zaangażowanych
w translo-kację. W analizie materiału z cienkoigłowej biopsji jądra uwidocznienie kwadriwalentu nie stanowi problemu, gdyż za pomocą przeciwciał lub metodą srebrzenia wybarwia się białka kompleksu synaptonemalnego powstającego między chromosomami podczas koniu-gacji chromosomów. Umożliwia to obserwację stopnia, w jakim synapsa objęła długości ramion chromosomów. Odpowiednie wybarwienie kompleksów synaptonemal-nych pozwala również oszacować długość odcinków inter-stycjalnych (IS, ang. interstitial segment) oraz transloko-wanych (TS, ang. translocated segment), a także określić liczbę powstałych chiazm. Chiazmy są niezbędne do pra-widłowej orientacji chromosomów podczas metafazy, co jest warunkiem niezbędnym do prawidłowej segre-gacji do komórek potomnych (Martin, 2005, 2008). Wiadomo również, że w przypadku chromosomów płci
Ryc. 1. Typy segregantów powstających w wyniku segregacji mejotycznej chromosomów plemnikowych, na przykładzie wzajemnej translokacji chromosomowej
(TCW) 46,XY,t(6;14)(q21;q13.3) (badania własne). Na schemacie zaznaczono sygnały fluorescencyjne (fenotyp wg. FISH – fluorescencyjna hybrydyzacja in situ) w plemnikach powstałych na skutek segregacji mejotycznej chromosomów, przy zastosowaniu znakowania trójkolorowego FISH, tj. sondy: pomarańczowa (α -satelitarna) – centromer chromosomu 6; czerwona i zielona (subtelomerowe) – odpowiednio regiony subtelomerowe chromosomów 6 i 14 (6q czerwony
i 14q zielony) oraz jako tło – DAPI (barwienie chromatyny, kolor niebieski). Dla każdego typu segreganta opisano powstające genotypy plemnikowe
Fig. 1. Types of segregants after meiotic segregation of the chromosomes in the reciprocal chromosome translocation (RCT) carrier 46,XY,t(6;14)(q21;q13.3)
(own collection). Different sperm FISH phenotypes after three -color labelling using fluorescent in situ hybridization (FISH) probes: orange (α -satellite) for centromere of the chromosome 6; red and green (subtelomeric) for subtelomeric regions of the chromosomes 6 and 14 (6q red and 14q green), and DAPI
zależy od sposobu rozchodzenia się chromosomów, a to z kolei jest ściśle związane z: 1) lokalizacją miejsc złamań chromosomów – długością IS i TS; im miejsce zła-mania chromosomu zlokalizowane jest bliżej centromeru, tym przebieg spermatogenezy jest bardziej zaburzony – większości odnotowanych przypadków towarzyszy
obniżenie liczby plemników (oligozoospermia), a nawet ich brak w ejakulacie (azoospermia) (Ferguson i wsp., 2008;
Jalbert i wsp., 1980; Leng i wsp., 2009; Oliver ‑Bonet i wsp.,
2005a, 2005b; Pigozzi i wsp., 2005); 2) rodzajem chro-mosomów – udział chromosomów akrocentrycznych, chromosomów płci, chromosomów z blokiem hetero-chromatynowym powoduje obniżenie płodności, a nawet występowanie niepłodności, szczególnie w przypadku TCW z zaangażowanym chromosomem X (Leng i wsp.,
2009; Ferguson i wsp., 2008; Sciurano i wsp., 2006; Pigozzi i wsp., 2005; Zhang i wsp., 2019); 3) właściwościami kwa-driwalentu utworzonego przez translokujące chromo-somy – brak pełnej koniugacji i tym samym występo-wanie wolnych, niesparowanych końców chromosomów może sprzyjać przyłączaniu się dodatkowych chromo-somów niezaangażowanych w translokację i tym samym negatywnie wpływać na płodność (Oliver ‑Bonet i wsp.,
2005a, 2005b); 4) lokalizacją i liczbą chiazm powstają-cych podczas koniugacji (Oliver ‑Bonet i wsp., 2004) oraz 5) funkcjonowaniem mikrotubul wrzeciona kariokine-tycznego w rozpoznawaniu centromerów chromosomów homologicznych (Benet i wsp., 2005). Wzór segregacji mejotycznej nie zmienia się z upływem czasu oraz jest podobny w przypadkach rodzinnych (Anton i wsp., 2004;
Cora i wsp., 2002; Estop i wsp., 1992; Ferfouri i wsp., 2013;
Johannisson i wsp., 1987; Morel i wsp., 2004a,2004b;
Olszewska i wsp., 2013; Rousseaux i wsp., 1995; Vozdova i wsp., 2008; Wiland i wsp., 2007).
Biorąc pod uwagę powyższe czynniki wpływa-jące na proporcję poszczególnych typów segregantów, można teoretycznie przewidzieć, którego typu segreganty powinny dominować dla indywidualnej translokacji chro-mosomowej wzajemnej (Faraut i wsp., 2000; Jalbert i wsp.,
1980; Rickards, 1983a, 1983b). Na rycinie 2
przedsta-wiono teoretyczne założenia konfiguracji i kierunków roz-chodzenia się chromosomów w powstającym kwadriwa-lencie – uwzględniono długości oraz stosunki odcinków: centrycznych (CS, ang. centric segment), na który składają się ramię chromosomu niezaangażowane w translokację oraz IS (tj. odcinki chromosomu pomiędzy centromerem a punktem złamania chromosomu) i TS (rycina 2A) (Faraut i wsp., 2000; Jalbert i wsp., 1980).
Na schemacie B ryciny 2 przedstawiono kwadriwa-lent predysponujący do powstawania gamet po segregacji przyległej typu I. W tym typie segregacji najkrótszy CS jest równy lub dłuższy od najdłuższego TS, a zależność tę można opisać wzorem: ∑ CS ≥ ∑ TS. W praktyce TS jest bardzo krótki – najczęściej telomerowy lub będący ramie-niem p chromosomu akrocentrycznego. W przypadku gdy chromosom akrocentryczny bierze udział w translokacji, punkt złamania znajduje się na ramieniu p lub w regionie telomerowym ramienia q. Chromosomy podczas segre-gacji tworzą łańcuch IV typu I, tj. na jednym z TS nie tworzą się chiazmy.
Schemat C ryciny 2 dotyczy kwadriwalentów pre-dysponujących do rozdziału przyległego typu II. W tym przypadku istotna jest obecność dwóch chromosomów
Ryc. 2. Teoretyczne założenia segregacji chromosomów do komórek
potomnych wynikające z parametrów geometrycznych chromosomów i ich punktów złamań we wzajemnych translokacjach chromosomowych (TCW) (szczegółowy opis w tekście). Jeden z chromosomów zaznaczono kolorem czarnym, drugi szarym, białym polem oznaczono blok heterochromatynowy, a linia przerywana wyznacza ścieżkę rozchodzenia się chromosomów podczas segregacji. Kolorem zielonym oznaczono centromery. TS – odcinek ulegający translokacji, CS – odcinek centryczny, IS – segment interstycjalny, der –
chromosom pochodny
Fig. 2. Theoretical assumptions of chromosomal segregation including
geometrical features and predicted breakpoints of the chromosomes involved in the reciprocal chromosome translocation (RCT) (described in details in the text). Chromosomes are marked with black and grey colours; white colour means heterochromatin block; dashed line means a pathway of chromosomes’ disjunction during segregation; green colour means centromeres. TS – translocated segment, CS – centric segment, IS –
akrocentrycznych (i) lub jednego chromosomu akrocen-trycznego i chromosomu 9 zawierającego blok hetero-chromatynowy 9qh (ii). W pierwszym przypadku suma długości dwóch CS jest mniejsza niż suma długości dwóch TS, co wyraża wzór: 2 × CS < 2 × TS, ∑ CS < ∑ TS. W drugim przypadku (ii) istotne jest to, że obydwa CS obejmują heterochromatynowe segmenty 9qh lub ramiona p akrocentryków, natomiast TS nigdy ich nie zawierają. Tym samym CS jest zawsze krótki, natomiast TS długi. Zależność tę obserwuje się dla TCW z zaan-gażowanym chromosomem 9 z punktem złamania nie niżej niż 9q13 (Jalbert i wsp., 1980). Ponadto prawdopo-dobieństwo wystąpienia segregantów typu przyległego II jest tym wyższe, im odcinek IS jest krótszy oraz gdy IS lub TS są tak krótkie, że nie ma możliwości pojawienia się chiazm, tym samym chromosomy tworzą łańcuch IV typu II (brak chiazm na jednym z CS) (Faraut i wsp.,
2000; Rickards, 1983a, 1983b).
Na schemacie D ryciny 2 przedstawiono formę kwa-driwalentów determinującą segregację typu 3:1, która prowadzi do trzeciorzędowej monosomii lub trisomii. Zakłada się, że w translokację zaangażowany jest jeden chromosom akrocentryczny (i) lub jeden chromosom 9 (ii). W obu tych przypadkach CS nie może być dłu-gością równy lub zbliżony do TS, który jednocześnie znajduje się w sąsiedztwie krótkiego CS. Gdy w trans-lokację zaangażowany jest chromosom akrocentryczny, to krótki CS jest zawsze krótszy niż długi TS. Istotne są tutaj wzajemne długości obu CS oraz obu TS względem siebie. Aby miała miejsce segregacja typu 3:1, stosunek jednego odcinka CS do drugiego CS powinien wynosić ok. 0,30, natomiast stosunek jednego TS do drugiego TS – ok. 0,28. Ponadto stosunek długości krótszego CS do długości dłuższego TS powinien wynosić 0,57. Z kolei w sytuacji, w której krótki CS obejmuje ramię 9p, wartość wzrasta do 1,34. Powstający kwadriwalent jest bardzo asymetryczny, a chromosomy podczas segregacji przyj-mują konfigurację III + I (segregacja triwalentu naprze-ciwległa z losową segregacją uniwalentu) (Faraut i wsp.,
2000; Rickards, 1983a, 1983b).
Schemat E ryciny 2 przedstawia formę kwadriwa-lentu predysponującą do segregacji typu 3:1 wymiennej. Sytuacja taka ma miejsce, gdy jeden z chromosomów zaangażowanych w translokację jest chromosomem akrocentrycznym, a długości CS i TS są znacznie różne od siebie. Cechą charakterystyczną jest to, że długi TS zlokalizowany jest zawsze w sąsiedztwie krótkiego CS. Ponadto stosunek sumy CS do sumy TS nie ma stałej wartości i tym samym jest zmienny. Powstające chromo-somy pochodne der są długie i ulegają segregacji razem z mniejszym chromosomem prawidłowym (Faraut i wsp.,
2000; Rickards, 1983a, 1983b).
Na schemacie F ryciny 2 przedstawiono kwadriwa-lenty, w których jednym z chromosomów zaangażowa-nych w translokację jest chromosom akrocentryczny. Dotyczy to sytuacji bardzo rzadko spotykanej, w której prawdopodobieństwo dominacji segregantów powstałych
na skutek segregacji przyległej I jest takie samo jak dla segregacji 3:1. Sytuacja taka może mieć miejsce, kiedy suma długości CS jest większa od sumy długości TS, a fragmenty chromosomów ulegające translokacji nie są podobnej długości. Jeśli chromosomy rozejdą się zgodnie z sytuacją (i), wynikiem będą segreganty typu przyległego I. Jeśli zaś będzie to ścieżka (ii), wówczas powstaną segreganty typu 3:1 prowadzące do trisomii trzeciorzędowej (Faraut i wsp., 2000; Rickards, 1983a,
1983b).
Ponadto istotnym elementem wpływającym na sposób rozchodzenia się chromosomów jest konfiguracja kwa-driwalentu na etapie diakinezy. Możliwe są dwie konfi-guracje – pierścienia lub łańcucha. Sugeruje się, że kon-figuracja pierścienia sprzyja segregacji 2:2, natomiast konfiguracja łańcucha faworyzuje rozdział chromosomów typu 3:1 (Koduru, 1984; Templado i wsp., 1990). Jednakże nie stanowi to reguły i decydujący wydaje się wpływ liczby i lokalizacji chiazm, mogących zmienić preferowany typ segregacji (Goldman i Hulten, 1993; Oliver ‑Bonet i wsp.,
2004). Co więcej, teoretycznie odsetek segregantów kom-plementarnych dla każdego typu segregacji powinien być zbliżony (np. dla teoretycznej TCW: 46,XY,t(A;B); częstość plemników o genotypie 23, -A,+der(B) powinna być zbli-żona do częstości plemników 23, -B,+der(A), w segregacji 2:2 typu przyległego II), jednak często wyniki te odbie-gają znacząco od siebie (Benet i wsp., 2005; Olszewska
i wsp., 2013; Vozdova i wsp., 2008). Różnice w odsetku
obserwowanych segregantów mogą być wynikiem zmian w częstości rekombinacji na skutek wpływu lokalizacji miejsc złamań chromosomów zaangażowanych w TCW, jak również zajścia rekombinacji niekompletnej podczas metafazy I podziału mejotycznego czy wczesnej selekcji niezrównoważonych genetycznie komórek gametogenicz-nych podczas spermatogenezy (Benet i wsp., 2005). Stąd też rzeczywiste (eksperymentalne) oszacowanie odsetka poszczególnych typów segregantów jest istotne dla pra-widłowej diagnostyki ryzyka niepowodzeń rozrodu (Benet i wsp., 2005; Midro i Stasiewicz ‑Jarocka, 2001a, 2001b;
Midro i wsp., 2006, 2014; Olszewska i wsp., 2013; Vozdova i wsp., 2008).
Przedstawione hipotezy opisują wpływ wielu ele-mentów charakteryzujących chromosomy zaangażowane w translokację na przewidywanie ilościowej dominacji typu segregantów niezrównoważonych genetycznie. Należy jednak pamiętać, że nie wszystkie translokacje chromosomowe wzajemne muszą zachowywać się zgodnie z powyższymi założeniami (Faraut i wsp., 2000;
Goldman i Hulten, 1993; Jalbert i wsp., 1980; Oliver ‑Bonet
i wsp., 2004). Pierwsze hipotezy zostały wysunięte
prze-szło 30 lat temu mimo trudności technicznych w badaniu wzorów segregacji mejotycznej (badania prowadzono na bardzo małej liczbie komórek) i nadal stanowią cenną podstawę teoretyczną w tworzeniu modeli prognostycz-nych (Faraut i wsp., 2000; Jalbert i wsp., 1980; Oliver‑
‑Bonet i wsp., 2004). Obecnie do oceny wzoru segregacji
hybrydyzacji in situ FISH (ang. fluorescent in situ hybri‑
disation) do jąder komórkowych plemnika, jak również
barwienie roztworem Giemzy chromosomów metafazo-wych plemnika (po penetracji do oocytów chomiczych – ok. 40 opisanych przypadków) (Oliver ‑Bonet i wsp., 2001). Zaletą techniki FISH jest możliwość analizy znacznie większej liczby plemników niż przy barwieniu roztworem Giemzy. Z drugiej strony, przy stosowaniu metody FISH pewien problem interpretacyjny stanowić mogą sygnały hybrydyzacyjne pochodzące od sond subtelomerowych – mały rozmiar tych sond upodabnia sygnały hybrydy-zacyjne do artefaktów (Anton i wsp., 2007). Dotychczas wzór segregacji mejotycznej badano u ok. 240 nosicieli 220 różnych TCW (Anton i wsp., 2007, 2008; Benet i wsp.,
2005; Brugnon i wsp., 2006; Cassuto i wsp., 2011; Godo i wsp., 2013; Kékesi, 2007; Martin, 2008; Midro i wsp., 2006,
2014; Olszewska i wsp., 2013, 2014; Perrin i wsp., 2009,
2010, 2011; Wiland i wsp., 2007, 2008; Vozdova i wsp.,
2012, 2013). Większość gamet wydaje się powstawać w wyniku segregacji naprzeciwległej – średnio 56% (19– 80%). Odsetek segregantów powstałych w wyniku segre-gacji przyległej typu I obserwuje się w 3,7–63,4% gamet, ze średnią częstością 32%, segregantów po segregacji przyległej typu II – 0–40%, ze średnią częstością 13%, oraz po 3:1 – 0–47%, ze średnią częstością 9,2%. Wyniki te wskazują, że u nosicieli TCW średnio blisko połowa plemników jest niezrównoważona genetycznie (Anton i wsp., 2007; Benet i wsp., 2005; Olszewska i wsp., 2013;
Vozdova i wsp., 2013).
Należy pamiętać, że badanie wzoru segregacji mejo-tycznej nie pozwala określić liczby chiazm powstających w kwadriwalencie mejotycznym i tym samym nie jest możliwe rozróżnianie niektórych typów segregantów od siebie przy zastosowaniu metody FISH (np. naprzeciw-ległych po rekombinacji od przynaprzeciw-ległych typu I niezrekom-binowanych). Częstość chiazm dla danego chromosomu jest wysoce zmienna zarówno w przypadkach różnych TCW, jak i między indywidualnymi nosicielami TCW (Spriggs i wsp., 1992; Sun i wsp., 2005). Przyczynę rozbież-ności wyników można upatrywać w zjawisku rekombi-nacji w IS chromosomów zaangażowanych w TCW. Tym samym badanie wzorów segregacji mejotycznej pozwala na sprawdzenie rzeczywistego rozkładu częstości gamet o różnym genotypie. Informacja ta stanowi uzupełnienie szacunkowych wartości indywidualnego ryzyka poronień lub urodzenia dziecka z wadami. Badanie wzoru segre-gacji mejotycznej jest szczególnie informatywne w przy-padku braku danych rodowodowych oraz faktu, iż nie każdy rodzaj niezrównoważenia genetycznego jest obecny u żywo narodzonych dzieci (Midro i Stasiewicz ‑Jarocka,
2001a, 2001b). Szacuje się, że średnia częstość wykry-wanych niezrównoważonych genetycznie płodów z TCW jest ok. 5 -krotnie niższa od średniej częstości wystę-powania niezrównoważonych genetycznie plemników u męskich nosicieli TCW. Świadczy to o braku wystarcza-jąco efektywnej selekcji usuwającej wszystkie niezrówno-ważone genetycznie plemniki podczas spermatogenezy
(Spriggs i Martin, 1994; Spriggs i wsp., 1992). Selekcja nie-zrównoważonych segregantów może w różnym stopniu dotyczyć każdego z translokowanych segmentów, a brak proporcji 1:1 dla danego typu segregacji jest wynikiem nieukończonej rekombinacji (Honda i wsp., 1999; Oliver‑ ‑Bonet i wsp., 2004; Van Hummelen i wsp., 1997). Ponadto różnica w wielkości fragmentów TS skutkuje wymianą najczęściej tylko jednego z segmentów (tzw. single ‑segment
exchange), prowadząc do częściowej trisomii lub
mono-somii u potomstwa (Gardner i Amor, 2018). Podobne obserwacje opisano kilkukrotnie w literaturze, zwra-cając uwagę, że zapłodnienie plemnikiem typu przyle-głego I z wymianą jednego z segmentów TS wykazuje największe prawdopodobieństwo przeżycia genetycznie niezrównoważonego potomstwa wśród wszystkich typów niezrównoważenia wynikającego z segregacji mejotycznej (Gardner i Amor, 2018; De Carvalho i wsp., 2008; Mortimer i wsp., 1980; Zhang i wsp., 2019).
Dane literaturowe wskazują również na korelację częstości występowania niezrównoważenia gene-tycznego obserwowanego w plemnikach i zarodkach (Escudero i wsp., 2003, 2008; Wiland i wsp., 2008; Yakut i wsp., 2006; Zhang i wsp., 2018). Dotychczas tylko poje-dyncze prace opisują przypadki TCW z zestawionymi wzorami segregacji mejotycznej plemników z wynikami kariotypowania blastomerów w diagnostyce przedim-plantacyjnej. Stwierdzono, że odsetek genetycznie nie-zrównoważonych zarodków był zbieżny lub wyższy niż odsetek genetycznie niezrównoważonych plemników (Escudero i wsp., 2003, 2008; Munne i wsp., 2005; Ogilvie
i Scriven, 2002; Wiland i wsp., 2008; Yakut i wsp., 2006;
Zhang i wsp., 2018). Stwierdzono, że niezrównoważenie
plemników na poziomie powyżej 60% drastycznie obniża prawdopodobieństwo uzyskania zdrowego potomstwa (Escudero i wsp., 2003; Munne i wsp., 2005; Yakut i wsp.,
2006). Zaobserwowano również proporcjonalne odwzo-rowanie częstości prawidłowych/zrównoważonych gene-tycznie plemników u nosicieli TCW w odsetku wyni-kłych ciąż (Gianaroli i wsp., 2002; Munne i wsp., 2005;
Zhang i wsp., 2018). Nie stwierdzono natomiast różnic
w częstości genetycznie prawidłowych/zrównoważonych zarodków pochodzących z zapłodnienia gametą męską lub żeńską pochodzącą od nosiciela TCW (Lim i wsp.,
2008; Lledo i wsp., 2010). Powyższe korelacje wydają się podkreślać istotność badania wzorów segregacji mejo-tycznej w plemnikach nosicieli TCW, co stanowi cenną pomoc w diagnostyce przedimplantacyjnej, pozwalając na oszacowanie prawdopodobieństwa wystąpienia nie-zrównoważenia genetycznego w zarodkach oraz ryzyka niepowodzeń rozrodu.
Prognozowanie ryzyka niepowodzeń rozrodu
Porównanie odsetków poszczególnych typów powstają-cych segregantów z danymi rodowodowymi potomstwa nosicieli TCW stanowi cenną pomoc w oszacowaniu indy-widualnego ryzyka genetycznego. Dane te wzajemnie się uzupełniają i są elementami porady genetycznej. Wyniki
kariotypowania potomstwa nosicieli TCW wskazują, że nie każdy rodzaj niezrównoważenia genetycznego jest obecny u żywo narodzonych dzieci (Jalbert i wsp., 1980). Analiza prognostyczna ryzyka niepowodzenia rozrodu/ prawdopodobieństwa urodzenia zdrowego dziecka pozwala określić, jakie formy genetycznego niezrów-noważenia są istotne przy przeżywalności potomstwa nosicieli TCW. W przypadku wykrycia nosicielstwa TCW u potencjalnych rodziców prognozowanie genetyczne oparte jest na starannej analizie empirycznych danych rodowodowych oraz szczegółowej interpretacji punktów złamań chromosomów zaangażowanych w translokację, co zostało szczegółowo opisane przez Midro i Stasiewicz‑ ‑Jarocką(2001a, 2001b).
Kompleksowe rearanżacje chromosomowe
Klasycznym terminem translokacji chromosomowych wzajemnych (TCW) określa się rearanżacje struk-turalne genomu pomiędzy dwoma chromosomami, każdy z jednym miejscem złamania. W sytuacji gdy w aberracji obserwuje się minimum trzy miejsca zła-mania na dwóch lub więcej chromosomach, stosuje się termin: „kompleksowych rearanżacji chromosomowych” (KRC, ang. complex chromosomal rearrangement) (rycina 3). Znanych jest ponad 250 przypadków nosicieli gene-tycznie zrównoważonych KRC, opisywanych w litera-turze od 1970 r. (podsumowano w: Madan, 2012; Pellestor
i wsp., 2011a, 2011b). Największa liczba przypadków
dotyczy rearanżacji z trzema (30%) lub czterema (29%) miejscami złamań chromosomów. Wiadomo, że wzro-stowi liczby złamań chromosomów towarzyszy wzrost ryzyka wystąpienia nieprawidłowego fenotypu u nosi-ciela (30–50%) lub jego potomstwa (20–90%) (Madan,
2012). W większości przypadków KRC powstają de novo (ok. 75%), na skutek wystąpienia tzw. katastrofy chromo-somowej (tzw. chromothripsis) wraz z rekombinacją homo-logiczną lub są dziedziczone po matce (70% przypadków dziedzicznych) (Eisfeldt i wsp., 2019; Fukami i wsp., 2017;
Ly i Cleveland, 2017; Madan, 2012; Piazza i Heyer, 2019). Ze względu na strukturę wyróżnia się cztery typy KRC (I–IV; rycina 3), przy czym pierwsze trzy typy charak-teryzują się zrównoważoną ilością materiału genetycz-nego, a ich występowanie można stwierdzić na poziomie obserwacji mikroskopowej chromosomów. W przypadku typu IV identyfikacja możliwa jest przede wszystkim na poziomie molekularnym z zastosowaniem porów-nawczej hybrydyzacji genomowej z użyciem mikroma-cierzy (aCGH, ang. array comparative genomic hybridization). Typ IV związany jest z powstawaniem delecji, duplikacji lub przerwaniem ciągłości genu, powodując zaburzenia jego ekspresji, co następnie wpływa negatywnie na funk-cjonowanie organizmu (Kang i wsp., 2010; Pellestor i wsp.,
2011b). Najczęściej obserwowanym wśród KRC (44%) jest typ I – rearanżacja trójstronna (ang. three ‑way rearran‑
gement) dziedziczona głównie po matce,
charakteryzu-jąca się zaangażowaniem trzech chromosomów, każdy z jednym punktem złamania. Typ II – rearanżacja nad-zwyczajna (ang. exceptional complex chromosomal rearrange‑
ment) powstaje przede wszystkim de novo, a jej wytyczną
są minimum dwa punkty złamania na jednym z chromo-somów. Ten typ KRC obejmuje m.in. współwystępowanie TCW z inwersją lub insercją. Dla KRC typu II zaobserwo-wano dotychczas maksymalnie 7 zaangażowanych chro-mosomów z liczbą 15 złamań (Houge i wsp., 2003). W przy-padku typu III – tzw. translokacji podwójnej lub potrójnej (ang. double/triple two ‑way translocation) u jednego nosi-ciela obserwuje się de facto jednoczesne współwystępo-wanie 2 lub 3 translokacji chromosomowych wzajemnych
Ryc. 3. Typy kompleksowych rearanżacji chromosomowych (KRC) Fig. 3. Types of complex chromosomal rearrangements (CCR)
(TCW) lub Robertsonowskich (Pellestor i wsp., 2011b). Typ IV stanowi tzw. translokacja insercyjna (ang. inser‑
tional translocation), charakteryzująca się zmienioną liczbą
kopii fragmentu sekwencji DNA na skutek wystąpienia minimum 3 miejsc złamań chromosomów (Kang i wsp.,
2010).
Dotychczas opisano 130 przypadki mężczyzn – nosi-cieli KRC, z czego jedynie 13 było płodnych (Ferfouri i wsp., 2013; Goumy i wsp., 2006; Grasshoff i wsp., 2003;
Hornak i wsp., 2014; Mas i wsp., 2018; Olszewska i wsp.,
2014). Wyższy niż w przypadku nosicieli TCW odsetek mężczyzn niepłodnych wśród nosicieli KRC jest wyni-kiem zahamowania lub wręcz zatrzymania spermato-genezy na skutek zaburzeń w parowaniu chromosomów homologicznych na etapie pachytenu (Kim i wsp., 2011). Jest to ściśle związane z powstawaniem multiwalentu mejotycznego, któremu w przypadku KRC towarzyszy wyższe prawdopodobieństwo (niż w przypadku kla-sycznej TCW) wystąpienia niesparowanych odcinków chromosomów na skutek ich konfiguracji przestrzennej, często bardzo skomplikowanej. Tym samym do niespa-rowanych podczas koniugacji odcinków chromosomów mogą przyłączać się m.in. chromosomy płci, powodując zahamowanie spermatogenezy lub też obniżenie jej poziomu, odzwierciedlone w obniżonych parametrach nasienia. W przypadku KRC możliwych typów segre-gantów jest minimum 64 (w zależności od liczby zaan-gażowanych chromosomów liczba ta wzrasta – 64 typy dla 3 chromosomów z 3 punktami złamań: po jednym na chromosom), co w sposób jednoznaczny zwiększa prawdopodobieństwo wystąpienia niezrównoważenia genetycznego po segregacji mejotycznej chromosomów
(Loup i wsp., 2010). Dane literaturowe opisują tylko 9
przypadków nosicieli KRC, u których badano wzór segre-gacji mejotycznej, przy czym dla 6 mężczyzn wykonano badanie techniką FISH (Ferfouri i wsp., 2012, 2013;
Hornak i wsp., 2014; Kirkpatrick i Ma, 2012; Loup i wsp.,
2010; Olszewska i wsp., 2014; Pellestor i wsp., 2011a), podczas gdy dla pozostałych 2 zastosowano system penetracji do chomiczej komórki jajowej (Burns i wsp.,
1986; Cifuentes i wsp., 1998). Zaobserwowano 3 typy
rearanżacji (I–III), a częstość plemników niezrównowa-żonych genetycznie wynosiła 73,0–86,5%. Stwierdzono również, że dominującym typem segregacji dla rearan-żacji trójstronnej (typ I) był 4:2, podczas gdy dla trans-lokacji podwójnej (typ III) najwyższy odsetek plemników był wynikiem segregacji naprzeciwległej. W przypadku rearanżacji nadzwyczajnej (typ II) nie zaobserwowano preferencji dla żadnego z typów segregantów. Być może niewielka liczba opisanych przypadków jest tego przy-czyną. Z wyższym odsetkiem plemników niezrównowa-żonych genetycznie ściśle związane jest podwyższone (50–100%) u nosicieli KRC ryzyko wystąpienia niezrów-noważonych genetycznie zarodków ulegających poronie-niom. Tym samym odsetek KRC wykrywanych podczas badań prenatalnych jest stosunkowo niski (ok. 5–10%) (Brunet i wsp., 2018; Escudero i wsp., 2008; Giardino i wsp.,
2006, 2009; Halgren i wsp., 2018; Lim i wsp., 2008; Madan,
2012; Pylyp i wsp., 2016). Szacuje się, że dla genetycznie zrównoważonych KRC wykrywanych w badaniach pre-natalnych ryzyko wystąpienia wad wrodzonych szaco-wane jest na ok. 3,5% na każde złamanie chromosomu (Warburton, 1991).
Mechanizmy powstawania
translokacji chromosomowych
Powstawanie translokacji chromosomowych związane jest z przestrzenną lokalizacją chromosomów zaanga-żowanych w translokację i wymagany jest ich fizyczny kontakt. Dotychczasowe dane literaturowe dopiero od niedawna sugerują istnienie związku lokalizacji poszczególnych chromosomów w przestrzeni jądra komórkowego z powstawaniem translokacji chromo-somowych (Meaburn i wsp., 2007). Analiza ponad 11 000 aberracji chromosomowych wykazała, że przypuszczalnie im chromosom jest większy, tym prawdopodobieństwo wystąpienia translokacji jest większe (Bickmore i Teague,
2002; Williamson i wsp., 2014). Wyższe
prawdopodobień-stwo wystąpienia translokacji chromosomowej zaobser-wowano również pomiędzy chromosomami zlokalizo-wanymi bliżej siebie w przestrzeni jądra komórkowego (Bickmore i Teague, 2002; Branco i Pombo, 2006; Kuroda i wsp., 2004; Nikiforova i wsp., 2000; Parada i wsp., 2004;
Williamson i wsp., 2014). Mechanizmy powstawania
trans-lokacji chromosomowych podsumowano w pracy prze-glądowej własnej (Olszewska i Kurpisz, 2014), stąd punkt ten zostanie omówiony skrótowo.
Powstanie translokacji chromosomowej jest pro-cesem wieloetapowym. Po pierwsze, na chromoso-mach zaangażowanych w rearanżację musi jednocze-śnie dojść do powstania pęknięć obu nici DNA (DSB, ang. double strand break). Po drugie, musi zawieść mecha-nizm naprawczy eliminujący DSB. Po trzecie, musi dojść do fizycznego kontaktu między końcami chromosomów z DSB, a następnie do ich połączenia (Carvalho i Lupski,
2016; Ghosh i wsp., 2018). Sugerowane są dwa modele
uwzględniające odległość zaangażowanych chromo-somów: 1) „model pierwszeństwa pęknięcia” (ang.
breakage ‑first model) – oderwane fragmenty
chromo-somów odległych od siebie ulegają przemieszczeniu się w przestrzeni jądra komórkowego, a następnie wzajem-nemu przyłączeniu do tych chromosomów (Aten i wsp.,
2004; Savage, 2000) oraz 2) „model pierwszego kontaktu”
(ang. contact ‑first model) – do połączenia uszkodzonych końców chromosomów dochodzi wyłącznie w obrębie włókien chromatydowych zlokalizowanych blisko siebie w momencie powstania DSB (Savage, 2000).
Rola ścieżek naprawczych DNA w powstawaniu translokacji chromosomowych
Dwie najczęstsze ścieżki naprawcze zaangażowane w powstawanie translokacji chromosomowych to:
rekombinacja homologiczna (HR, ang. homologous recom‑
bination) i jej wariant – wydłużanie pojedynczej nici (SSA,
ang. single ‑strand annealing) oraz mechanizm łączenia końców niehomologicznych (NHEJ, ang. non ‑homologous
end joining) wymagający niewielkiej lub braku homologii
sekwencji DNA (Elliott i Jasin, 2002; Iliakis i wsp., 2015;
Kloosterman i wsp., 2011; Sallmyr i Tomkinson, 2018;
Tsai i Lieber, 2010). Mechanizm „pęknięcie -fuzja -most” (BFB, ang. breakage ‑fusion ‑bridge) najczęściej towarzyszy powstawaniu kryptycznych duplikacji odwróconych i złamań chromosomów w regionach subtelomerowych (Ballif i wsp., 2004; Gajęcka i wsp., 2008). Wśród mecha-nizmów rzadziej spotykanych wymienia się: 1) niealle-liczną rekombinację homologiczną (NAHR, ang. nonallelic
homologous recombination) w obrębie obszarów powtórzeń
o niskiej liczbie kopii (LCR, ang. low ‑copy repeat) głównie w regionach subtelomerowych (Carvalho i Lupski, 2016;
Ou i wsp., 2011; Stankiewicz i Lupski, 2006). Mechanizm NAHR jest odpowiedzialny za rearanżacje w regionie Yq11 ściśle związane z delecjami regionów AZF (ang.
azoospermia factor) powodującymi obniżenie płodności
u mężczyzn (Carvalho i wsp., 2011); 2) parowanie regionów subtelomerowych z rekombinacją proksymalną (SPPR, ang. subtelomeric pairing with proximal recombination) ma miejsce w obrębie powtarzalnych sekwencji zaso-scjowanych z regionem subtelomerowym (TAR, ang.
telomeric associated regions) o długości ok. 100–300 kpz,
w tym obejmujących domeny subtelomerowe dystalne (<2 kpz), bloki powtarzalne (głównie regiony LCR, obecne na końcach wielu chromosomów niehomologicznych) oraz domeny subtelomerowe proksymalne zawierające LCR (10–40 kpz) na końcach tylko kilku chromosomów
(Mefford i Trask, 2002); 3) kopiowanie sekwencji DNA
poprzez replikację indukowaną pęknięciem (BIR, ang.
breakage ‑induced replication): kopiowanie sekwencji
sub-telomerowych z jednego ramienia chromosomu prawi-dłowego lub z chromatydy siostrzanej na koniec dru-giego ramienia chromosomu zawierającego delecję (Ballif i wsp., 2004; Carvalho i Lupski, 2016; Leffak, 2017; Sakofsky
i Malkova, 2017).
Z powstawaniem translokacji chromosomowych mogą być związane również tzw. miejsca łamliwe chro-mosomów, tj. regiony chromosomowe podatne na zła-manie, dziedziczne i konserwatywne ewolucyjnie, o pod-wyższonej liczbie przerw, zwężeń lub pęknięć po procesie replikacji DNA, występujące w regionach chromatyny nie-prawidłowo upakowanej podczas mitozy (Arlt i wsp., 2006;
Black i Giunta, 2018; Barros i wsp., 2017; Feng i Chakraborty,
2017; Lukusa i Fryns, 2008). Miejsca łamliwe
chromo-somów mogą stanowić potencjalne regiony rearanżacji i sprzyjać większej liczbie wymian między chromatydami siostrzanymi, powielaniu liczby kopii genów wewnątrz chromosomu oraz odgrywać rolę tzw. miejsc gorących (ang. hotspots) podczas inicjacji powstawania delecji lub translokacji (Lukusa i Fryns, 2008). Wyodrębnia się dwie kategorie miejsc łamliwych: 1) powszechne miejsca łamliwe (ang. common fragile sites) – region
łamliwy chromosomu zawierający hipoacetylowane histony, głównie w obrębie sekwencji DNA bogatych w pary AT oraz wykazujących tendencję do przyjmo-wania nietypowych struktur II -rzędowych lub tzw. spinki do włosów (Debatisse i Rosselli, 2018; Feng i Chakraborty,
2017; Lukusa i Fryns, 2008); 2) rzadkie miejsca łamliwe (ang. rare fragile sites) – regiony DNA bogate w sekwencje AT/TA lub w trójki nukleotydów CCG/CGG, sprzyjające formowaniu struktury DNA w konformacji innej niż B -DNA, o większej elastyczności i skrętności nici DNA oraz charakteryzujące się obniżoną podatnością przyłą-czania się nukleosomów do DNA (Durkin i Glover, 2007;
Lukusa i Fryns, 2008).
Efekt interchromosomowy/zaburzenia
mejotyczne
Z danych literaturowych wynika, że u 40–64% nosicieli TCW występuje tzw. efekt interchromosomowy, czyli pod-wyższona częstość aneuploidalnych plemników na skutek zaburzeń w rozchodzeniu się chromosomów niezaan-gażowanych w translokację (Anton i wsp., 2011; Blanco i wsp., 2000; Douet ‑Guilbert i wsp., 2005; Estop i wsp., 2000;
Godo i wsp., 2013; Li i wsp., 2015; Machev i wsp., 2005;
Moretti i wsp., 2009; Tulay i wsp., 2015; Vozdova i wsp.,
2012). Aneuploidie stanowią przykład numeryczny aber-racji (liczby) chromosomów, powstają w wyniku błędów mejotycznych, czyli nieprawidłowego rozchodzenia się chromosomów do komórek potomnych (Ioannou
i Tempest, 2015; Ioannou i wsp., 2018; Martin, 2005; Uroz
i Templado, 2012). Błędy w mejozie męskich komórek rozrodczych wynikają ze zredukowanej liczby chiazm lub ich braku lub też przedwczesnego rozchodzenia się chromatyd siostrzanych (Ioannou i Tempest, 2015;
Ioannou i wsp., 2018; Uroz i Templado, 2012).
Do więk-szości nieprawidłowości dochodzi podczas I podziału mejotycznego, co zostało potwierdzone obserwacjami wykazującymi ponad 5 -krotnie wyższy odsetek aneuplo-idalnych spermatocytów II rzędu względem spermato-cytów I -rzędowych (Ioannou i Tempest, 2015; Ioannou i wsp.,
2018; Sarrate i wsp., 2014, 2018; Uroz i Templado, 2012). Większa częstość aneuploidii dotyczy głównie chromo-somów z grupy G, w których z racji małego rozmiaru liczba chiazm może być obniżona lub może nie być ich wcale, oraz chromosomów płci, w których rekombinacja ma miejsce na ograniczonym, krótkim PAR.
Za ok. 95% aneuploidii obserwowanych we wczesnych zarodkach odpowiadają zaburzenia przebiegu mejozy matczynej i obejmują one błędy w I podziale mejo-tycznym (3:1 w stosunku do II podziału mejotycznego) (Buwe i wsp., 2005; Kort i wsp., 2018). Dotyczy to głównie chromosomów autosomalnych, podczas gdy aneuplo-idie chromosomów płci są zdecydowanie pochodzenia ojcowskiego (6% 47,XXX; 50% 47,XXY; 100% 47,XYY) (Hall i wsp., 2006; Kort i wsp., 2018). Chromosomami, dla których poziom aneuploidii jest badany najczęściej, są:
13, 18, 21, X i Y. Jest to spowodowane faktem, że tylko zarodki z trisomią chromosomów 13, 18 i 21 oraz aneu-ploidią chromosomów płci są w stanie przeżyć przy zaistnieniu wad wrodzonych (Altug ‑Teber i wsp., 2007). Co więcej, wśród autosomów jedynie trisomia chromo-somu 21 (zespół Downa) pozwala na osiągnięcie wieku dojrzałego, przy czym jedynie 6–10% przypadków tej trisomii jest pochodzenia ojcowskiego. Ponadto ana-lizie poziomu aneuploidii często poddaje się również chromosomy 15, 16 oraz 22, ze względu na zaobserwo-wane wyższe ryzyko poronień na skutek aneuploidii tych chromosomów (Elkarhat i wsp., 2019; Maxwell i wsp.,
2016; Pylyp i wsp., 2018; Rubio i wsp., 2019). W przypadku chromosomów płci najczęściej spotykaną aberracją jest zespół Klinefeltera (47,XXY) przypadający na 0,1–0,2% nowo narodzonych dzieci (Mau ‑Holzmann, 2005; Vialard i wsp., 2012). Szacuje się, że wśród niepłodnych mężczyzn odsetek ten wzrasta od 5% (oligozoospermia) do 10% (azoospermia) (Ferlin i wsp., 2005).
Szacuje się, że u płodnych mężczyzn o prawidłowych parametrach nasienia (normozoospermia) odsetek plem-ników aneuploidalnych wynosi średnio ok. 4,5% (3–5%) (Chatziparasidou i wsp., 2015; Ioannou i Tempest, 2015;
Ioannou i wsp., 2018; Muriel i wsp., 2007; Templado i wsp.,
2011), w tym: średni odsetek plemników z aneuploidią chromosomów autosomalnych (za wyjątkiem mosomów 3 i 22) wynosi 0,09% (0,03–0,12%), chro-mosomów: 3, 14, 21 i 22 0,2–0,47%, chromosomu 18 0,03–0,25%, chromosomów X i Y 0,26% (0,01–0,43%), a plemników diploidalnych 0,19% (0,01–0,38%) (Ioannou
i Tempest, 2015; Olszewska i wsp., 2013, 2015; Rubes i wsp.,
2005; Templado i wsp., 2011). Różnice w wynikach
poda-wanych w literaturze wynikają z dwóch faktów: występo-wania zmienności międzyosobniczej oraz tego, że każde laboratorium ma własne grupy kontrolne. Aby wyeli-minować błędy wynikające z metodyki FISH (rodzaj sond, wybrane kryterium oceny preparatu), potrzebne są restrykcyjne kryteria laboratoryjne (Garcia ‑Mengual
i wsp., 2019; Templado i wsp., 2005). W plemnikach
nie-których zdrowych mężczyzn o prawidłowych parame-trach nasienia zaobserwowano zjawisko tzw. wariantów aneuploidii dla wybranych chromosomów (Rubes i wsp.,
2005; Tempest i wsp., 2009), co oznacza, że na przestrzeni kilku lat powtarzanych badań poziom aneuploidii bada-nych chromosomów był cały czas podwyższony. Taka niejednorodność obserwacji w różnych grupach męż-czyzn podkreśla złożony charakter zjawiska aneuplo-idii. Ponadto poziom aneuploidii w plemniku nie zależy od wieku mężczyzny (Donate i wsp., 2016).
Szacuje się, że częstość plemników aneuploidalnych u mężczyzn niepłodnych wzrasta średnio 3-krotnie (2–10 -krotnie), co przypuszczalnie jest wynikiem nie-stabilności w mechanizmach kontrolujących podziały komórkowe, związanych z prawidłowym funkcjonowa-niem mikrotubul wrzeciona podziałowego oraz z błędami występującymi podczas rekombinacji (Chatziparasidou i wsp., 2015; Ioannou i wsp., 2018; Templado i wsp., 2011).
Podwyższony poziom aneuploidii obserwowany jest u mężczyzn z zaburzonymi parametrami nasienia, jak również w przypadku plemników pozyskiwanych z jąder u mężczyzn z azoospermią. Jednak kwestia związku parametrów nasienia z poziomem aneuploidii w plem-nikach nadal pozostaje dyskusyjna (Ferfouri i wsp., 2011;
Mazzilli i wsp., 2017; Olszewska i wsp., 2013; Pellestor i wsp.,
2001; Tang i wsp., 2010). Również badania plemników
frakcjonowanych metodami wypływania swim up oraz wirowania w gradiencie perkolu nie były rozstrzygające – w większości przypadków nie wykazały różnic w czę-stości plemników aneuploidalnych pomiędzy poszcze-gólnymi frakcjami (Rives i wsp., 2005). Wiadomo również, że poziom aneuploidii chromosomów niezaangażowanych w translokację chromosomową w plemnikach ma swoje odwzorowanie w poziomie aneuploidii w zarodkach
(Martin, 2008). Zaobserwowano związek pomiędzy
podwyższonym poziomem aneuploidii chromosomów 13, 21, 22, X i Y i/lub częstością plemników diploidal-nych u ojców dzieci z zespołami: Downa, Klinefeltera czy Turnera (Martinez ‑Pasarell i wsp., 1999; Soares i wsp.,
2001a, 2001b). Co więcej, badania na plemnikach o podwyższonym stopniu fragmentacji DNA wykazały ok. 4,6-krotnie wyższy poziom aneuploidii chromo-somów 18, X i Y względem kontroli (Muriel i wsp., 2007). Podczas prawidłowego przebiegu profazy I chro-mosomy X i Y ulegają heterochromatyzacji skutkującej brakiem aktywności transkrypcyjnej i przybierają postać tzw. sex body – struktury subchromatynowej widocznej jedynie podczas pachytenu (Oliver ‑Bonet i wsp., 2005b). Z licznych doniesień literaturowych wynika, że musi dojść do prawidłowej koniugacji między chromoso-mami X i Y podczas pachytenu i stanowi to warunek konieczny do tego, aby plemnik był zdolny do zapłod-nienia, a towarzyszyć temu musi rekombinacja (Martin,
2005). Potwierdzają to obserwacje zachowania się uniwa-lentów (nieskoniugowanych chromosomów płci) w sper-matocytach, u których brak rekombinacji zatrzymuje spermatocyty na etapie diakinezy, w przeciwieństwie do uniwalentów zrekombinowanych, których obecność stwierdzono w spermatocytach metafazy II podziału mejotycznego (Solari, 1999). Warunkiem prawidłowego przebiegu spermatogenezy jest brak aktywności trans-krypcyjnej nieskoniugowanych regionów biwalentu XY. Odnotowano, że zaburzenia inaktywacji tych regionów skutkują apoptozą spermatocytów (Mahadevaiah i wsp.,
2008; Royo i wsp., 2010). Liczne doniesienia zdają się
również potwierdzać, że asocjacja biwalentu XY z chro-mosomami autosomalnymi prowadzi do zaburzenia sper-matogenezy, a nawet do jej zatrzymania, co skutkuje obniżeniem płodności u mężczyzn, nawet do poziomu azoospermii. Najwyższy odsetek takich asocjacji dotyczy nosicieli translokacji chromosomowych wzajemnych, szczególnie z zaangażowanym chromosomem akrocen-trycznym (Ferguson i wsp., 2008; Leng i wsp., 2009; Pigozzi i wsp., 2005; Sciurano i wsp., 2006, 2007, 2012; Vialard i wsp., 2006).
W niniejszej pracy poglądowej przedstawiono obecny stan wiedzy dotyczący TCW. Należy podkreślić istotną rolę obecności TCW w zaburzeniach przebiegu podziałów mejotycznych, co w konsekwencji prowadzić może do nie-powodzeń rozrodu oraz pojawienia się wad genetycz-nych u potomstwa. Warto raz jeszcze podkreślić, że bez badania genetycznego TCW pozostaną niewykryte, albo-wiem nie ma fenotypowych cech osobniczych wskazu-jących na osobę – nosiciela genetycznie zrównoważonej TCW, którymi można byłoby się posiłkować.
Finansowanie
Narodowe Centrum Nauki, projekt grantowy: 2011/01/B/ NZ2/04819.
Piśmiennictwo
Altug ‑Teber O., Bonin M., Walter M., Mau ‑Holzmann U.A., Dufke A., Stappert H. i wsp.: Specific transcriptional changes in human fetuses with autosomal
trisomies. Cytogenet Genome Res. 2007, 119, 171–184. PMID: 18253026. DOI: 10.1159/000112058.
Anton E., Vidal F., Blanco J.: Interchromosomal effect analyses by sperm
FISH: incidence and distribution among reorganization carriers. Syst Biol Reprod Med. 2011, 57, 268–278. PMID: 22092077. DOI: 10.3109/ 19396368.2011.633682.
Anton E., Vidal F., Blanco J.: Reciprocal translocations: tracing their meiotic
behavior. Genet Med. 2008, 10, 730–738. PMID: 18813133. DOI: 10.1097/ GIM.0b013e318187760f.
Anton E., Vidal F., Blanco J.: Role of sperm FISH studies in the genetic
repro-ductive advice of structural reorganization carriers. Hum Reprod. 2007, 22, 2088–2092. PMID: 17573525. DOI: 10.1093/humrep/dem152.
Anton E., Vidal F., Egozcue J., Blanco J.: Preferential alternate segregation
in the common t(11;22)(q23;q11) reciprocal translocation: sperm FISH analysis in two brothers. Reprod Biomed Online. 2004, 9, 637–644. PMID: 15670411. DOI: 10.1016/s1472 -6483(10)61774 -9.
Arlt M.F., Durkin S.G., Ragland R.L., Glover T.W.: Common fragile sites as
tar-gets for chromosome rearrangements. DNA Repair. 2006, 5, 1126–1135. PMID: 16807141. DOI: 10.1016/j.dnarep.2006.05.010.
Aten J.A., Stap J., Krawczyk P.M., van Oven C.H., Hoebe R.A., Essers J. i wsp.:
Dynamics of DNA double -strand breaks revealed by clustering of damaged chromosome domains. Science. 2004, 303, 92–95. PMID: 14704429. DOI: 10.1126/science.1088845.
Ballif B.C., Wakui K., Gajecka M., Shaffer L.G.: Translocation breakpoint
map-ping and sequence analysis in three monosomy 1p36 subjects with der(1) t(1;1)(p36;q44) suggest mechanisms for telomere capture in stabilizing de novo terminal rearrangements. Hum Genet. 2004, 114, 198–206. PMID: 14579147. DOI: 10.1007/s00439 -003 -1029 -y.
Barratt C.L.R., Björndahl L., De Jonge C.J., Lamb D.J., Osorio Martini F., McLachlan R. i wsp.: The diagnosis of male infertility: an analysis of the
evidence to support the development of global WHO guidance -challenges and future research opportunities. Hum Reprod Update. 2017, 23, 660–680. PMID: 28981651. DOI: 10.1093/humupd/dmx021.
Barros A.V., Wolski M.A., Nogaroto V., Almeida M.C., Moreira ‑Filho O., Vicari M.R.: Fragile sites, dysfunctional telomere and chromosome fusions: What
is 5S rDNA role? Gene. 2017, 608, 20–27. PMID: 28111257. DOI: 10.1016/j. gene.2017.01.013.
Benet J., Oliver ‑Bonet M., Cifuentes P., Templado C., Navarro J.: Segregation
of chromosomes in sperm of reciprocal translocation carriers: a review. Cytogenet Genome Res. 2005, 111, 281–290. PMID: 16192706. DOI: 10.1159/000086901.
Bickmore W.A., Teague P.: Influences of chromosome size, gene density and
nuclear position on the frequency of constitutional translocations in the human population. Chromosome Res. 2002, 10, 707–715. PMID: 12575798. DOI: 10.1023/A:1021589031769.
Black E.M., Giunta S.: Repetitive Fragile Sites: Centromere Satellite DNA As
a Source of Genome Instability in Human Diseases. Genes (Basel) 2018, 9(12) pii: E615. PMID: 30544645. DOI: 10.3390/genes9120615.
Blanco J., Egozcue J., Vidal F.: Interchromosomal effects for chromosome
21 in carriers of structural chromosome reorganizations determined by fluorescence in situ hybridization on sperm nuclei. Hum Genet. 2000, 106, 500–505. PMID: 10914679. DOI: 10.1007/s004390000295.
Bonduelle M., Van Assche E., Joris H., Keymolen K., Devroey P., Van Steirteghem A. i wsp.: Prenatal testing in ICSI pregnancies: incidence of
chromo-somal anomalies in 1586 karyotypes and relation to sperm parameters. Hum Reprod. 2002, 17, 2600–2614. PMID: 12351536. DOI: 10.1093/ humrep/17.10.2600.
Branco M.R., Pombo A.: Intermingling of chromosome territories in
inter-phase suggests role in translocations and transcription -dependent asso-ciations. PLoS Biol. 2006, 4, e138. PMID: 16623600. DOI: 10.1371/jour-nal.pbio.0040138.
Brugnon F., Van Asche E., Verheyen G., Sion B., Boucher D., Pouly J.L. i wsp.:
Study of two markers of apoptosis and meiotic segregation in ejaculated sperm of chromosomal translocation carrier patients. Hum Reprod. 2006, 21, 685–693. PMID: 16339168. DOI: 10.1093/humrep/dei401.
Brunet B.C.F.K., Shen J., Cai L., Xie J., Cui Y., Liu J. i wsp.: Preimplantation
genetic testing for complex chromosomal rearrangement carriers by -generation sequencing. Reprod Biomed Online. 2018, 37, 375–382. PMID:
30314889. DOI: 10.1016/j.rbmo.2018.07.001.
Burns J.P., Koduru P.R., Alonso M.L., Chaganti R.S.: Analysis of meiotic
seg-regation in a man heterozygous for two reciprocal translocations using the hamster in vitro penetration system. Am J Hum Genet. 1986, 38, 954– 964. PMID: 3728467.
Buwe A., Guttenbach M., Schmid M.: Effect of paternal age on the frequency
of cytogenetic abnormalities in human spermatozoa. Cytogenet Genome Res. 2005, 111, 213–228. PMID: 16192697. DOI: 10.1159/000086892.
Carvalho C.M., Lupski J.R.: Mechanisms underlying structural variant
for-mation in genomic disorders. Nat Rev Genet. 2016, 17, 224–238. PMID: 26924765. DOI: 10.1038/nrg.2015.25.
Carvalho C.M., Zhang F., Lupski J.R.: Structural variation of the human genome:
mechanisms, assays, and role in male infertility. Syst Biol Reprod Med. 2011, 57, 3–16. PMID: 21210740. DOI: 10.3109/19396368.2010.527427.
Cassuto N.G., Le Foll N., Chantot ‑Bastaraud S., Balet R., Bouret D., Rouen A. i wsp.: Sperm fluorescence in situ hybridization study in nine men
car-rying a Robertsonian or a reciprocal translocation – relationship between segregation modes and high -magnification sperm morphology examina-tion. Fertil Steril. 2011, 96, 826–832. PMID: 21871621. DOI: 10.1016/j. fertnstert.2011.07.1143.
Chatziparasidou A., Christoforidis N., Samolada G., Nijs M.: Sperm aneuploidy
in infertile male patients: a systematic review of the literature. Andrologia. 2015, 47, 847–860. PMID: 25352353. DOI: 10.1111/and.12362.
Cifuentes P., Navarro J., Míguez L., Egozcue J., Benet J.: Sperm segregation
analysis of a complex chromosome rearrangement, 2;22;11, by whole chro-mosome painting. Cytogenet Cell Genet. 1998, 82, 204–209. PMID: 9858818. DOI: 10.1159/000015101.
Cora T., Acar H., Kaynak M.: Molecular cytogenetic detection of meiotic
segrega-tion patterns in sperm nuclei of carriers of 46,XY,t(15;17)(q21;q25). J Androl. 2002, 23, 793–798. PMID: 12399524. DOI: 10.1002/j.1939 -4640.2002. tb02335.x.
De Braekeler M., Dao T.: Cytogenetic studies in male infertility: a review.
Hum Reprod. 1991, 6, 245–250. PMID: 2056021. DOI: 10.1093/oxford-journals.humrep.a137315.
De Carvalho A.F., da Silva Bellucco F.T., Kulikowski L.D., Toralles M.B., Melaragno M.I.: Partial 5p monosomy or trisomy in 11 patients from a family with
a t(5;15)(p13.3;p12) translocation. Hum Genet. 2008, 124, 387–392. PMID: 18777129. DOI: 10.1007/s00439 -008 -0557 -x.
de Kretser D.M.: Male infertility. Lancet. 1997, 349, 787–790. PMID: 9074589.
