TP53 mutations in hematologic malignancies

Praca poglądowa/Review

Mutacje TP53 w nowotworach hematologicznych

TP53 mutations in hematologic malignancies

Małgorzata Zając

*, Krzysztof Giannopoulos

1ZakładHematoonkologiiDoświadczalnej,UniwersytetMedycznywLublinie,Lublin,Polska

2OddziałHematologiczny,CentrumOnkologiiZiemiLubelskiej,Lublin,Polska

Wprowadzenie

GenTP53znajdujesięw chromosomie17(17p13.1) iskłada sięz 11eksonóworaz 10intronów[1].Produktem translacji genujestfosfoproteinaomasiecząsteczkowej53kDa,która pełnifunkcjegłównegosupresoranowotworowegowystępu- jącego w komórkach organizmu ludzkiego. Białko to jest czynnikiem transkrypcyjnym zbudowanym z charaktery- stycznychdlaaktywatorówtranskrypcjidomen:N-końcowej, domenyodpowiedzialnejzawiązaniesięzDNAorazdomeny C-końcowej, spełniających określone funkcje [2]. Białko p53

maliczneizoformypowstającedrogąalternatywnegoskłada- nia transkryptów. Obecnie rozróżnionoco najmniej 12 izo- form, których odrębność funkcjonalna jest wciąż tematem wielubadań[3].

P53odgrywa kluczowąrolęwregulacji proliferacjikomó- rek,główniepoprzezindukowaniekońcacyklukomórkowego, apoptozy lubaktywowaniesystemów naprawczych DNA[4].

UszkodzenieDNAinicjujenadekspresjęp53,indukujączaha- mowaniefazycyklukomórkowegoG1,przezcop53utrzymuje integralność genomu. W przypadku rozległych uszkodzeń, podczas których DNA nie podlega naprawie,p53 transakty- wuje geny odpowiedzialne za apoptozę [5–7]. Mutacja TP53 informacje o artykule

Historiaartykułu:

Otrzymano:07.10.2015 Zaakceptowano:09.11.2015 Dostępneonline:19.11.2015

Słowakluczowe:

 genTP53

 supresornowotworowyp53

 proliferacjakomórek

Keywords:

 TP53gene

 Tumorsuppressorp53

 Cellproliferation

abstract

The tumor suppressor p53 plays a crucial role in regulation of cell proliferation and maintainingintegrityofthegenomeinhumantissue.TP53mutationsarefoundinabout 50%ofsolidtumors;however,hematologicalmalignanciespresentalowerincidenceof alterationinthisgene.Withinthisgroupofpatients,mutationsofTP53and17pdeletion areassociatedwithpoorprognosisandresistancetostandardchemotherapy.Duringthe pastfew years,treatment ofpatientswith TP53aberrations has become a majorchal- lengeofmodern hematology.Currently, thereare ongoingclinical trials ondrugsthat canaffect directly p53 activity or cause activation of other mechanisms, which could convert bad prognosis of patients with TP53 aberrations. Since TP53 mutations carry prognostic significance in CLL and are relevant in choosing the treatment for CLL patients, ERIC (EuropeanResearch Initiative for CLL) made anattempt to standardize assessmentofTP53mutations.

©2015PolskieTowarzystwoHematologówiTransfuzjologów,InstytutHematologiii Transfuzjologii.PublishedbyElsevierSp.zo.o.Allrightsreserved.

*Adresdokorespondencji:ZakładHematoonkologiiDoświadczalnejUniwersytetMedycznywLublinie,ul.Chodzki4a,20-093Lublin, Polska.Tel.:+48814486630;fax:+48814486634.

Adresemail:kicaaj@gmail.com(M.Zając).

ContentslistsavailableatScienceDirect

Acta Haematologica Polonica

journalhomepage:www.elsevier.com/locate/achaem

http://dx.doi.org/10.1016/j.achaem.2015.11.005

0001-5814/©2015PolskieTowarzystwoHematologówiTransfuzjologów,InstytutHematologiiiTransfuzjologii.PublishedbyElsevierSp.

zo.o.Allrightsreserved.

uniemożliwiahamowaniefazyG1orazpowodujederegulację apoptozy,skutkująctransformacjąnowotworowąiprolifera- cjąuszkodzonychkomórek[5,6,8,9].Utratafunkcjip53jest kluczowymzdarzeniemwprocesienowotworzeniaizwiązana jestzwielomaprocesamicharakterystycznymidlanowotwo- rów, takimi jak: deregulacja cyklu komórkowego, niestabil- nośćgenomuczyopornośćnachemioterapię[10,11].

Całkowita utrata funkcji p53 może być spowodowana współistniejącąmutacjąTP53orazdelecjąpozostałegoallelu 17p, mutacją obu alleli lub homozygotyczną mutacją powstałąnaskutekutratyheterozygotyczności(lossofhete- rozygosity; LOH). Innym mechanizmem ograniczającym funkcjep53jestdominującynegatywnyefektzmutowanego białka, formującego kompleksy z jego niezmienioną posta- cią. Obecność tych kompleksów uniemożliwia wiązanie się prawidłowego białka p53do DNA i hamujetransaktywację innych genów. Dodatkowo, sugeruje się, że mutacje TP53 mogą również powodowaćzmianętermowrażliwościbiałka oraz skutkować nabywaniem nowych właściwości (gain of function; GOF), powodujących progresję nowotworu czy zwiększanieopornościnaleczenie[12].

Utratafunkcjip53spowodowanadelecjamilubmutacjami stwierdzanajestwokoło50%typówguzówlitych[13],jednak występowanie mutacji w genie TP53 jest znacznie rzadsze wprzypadkunowotworówhematologicznych[14–16].

MutacjeTP53cechujeheterogennośćzarównopodwzglę- demstruktury, jak ilokalizacji. Najczęstszymi zmianamisą mutacjezmianysensuprowadzącedozmianyaminokwasów, którestanowiąokoło75%wszystkichmutacji.Sąone umiej- scowione w obrębie eksonów 3–10, jednak stanowczawięk- szość identyfikowana jest w eksonach5–8 w kodonach 175 (ekson5),248(ekson7)oraz273(ekson8),stanowiącychtzw.

hot-spots.Rzadziejspotykanesąmutacjenonsensowne,dele- cje,insercjeczymutacjewmiejscachskładaniatranskyptów [17–19].

AML

Wgrupiechorychnaostrąbiałaczkęszpikowądenovo(acute myeloid leukemia; AML) mutacje TP53 znajdowane są na poziomie3–8%[14,19–21].Najczęstsząmutacjąjestpojedyn- cza substytucja nukleotydu Gna C, jednak w porównaniu z AML związanych z leczeniem czy innych nowotworów hematologicznychiguzówlitychspektrummutacjiwprzy- padkach AMLde novo nieprzedstawiaswoistychcech [22, 23]. Mutacje TP53 są zazwyczaj powiązane z delecją 17p, głównie w następstwie niezbalansowanej translokacji, jak naprzykładt(5;17),coskutkujeinaktywacjąobualleliTP53 [19]. Ichwystępowaniew tejgrupiechorychobserwowane byłowprawie90%przypadków[17,24].Wprzeciwieństwiedo chorychbezdelecji17p,mutacjaTP53występowałau66–84%

pacjentów[17,24],cosugeruje,żezjawiskawspółwystępowa- niadelecjiimutacjipunktowychobuhomologicznychallelisą częste,aleniebezwzględniepowiązane[17,25].Zwiększony poziommutacjizostałrównieżpowiązanyzwystępowaniem nieprawidłowej naprawy błędnie sparowanych nukleotydów [26].MutacjewgenieTP53zostałyzidentyfikowanenapozio- mie60–70%uchorychzezłożonymkariotypem,cowykazuje ich ścisłą zależność z tą grupą cytogenetyczną [17, 21].

Istotnieczęściejwystępująoneuchorychwzaawansowanym wieku, powiązane są ze swoistymi zmianami liczby kopii DNA, kariotypemmonosomalnymorazniekorzystnymroko- waniem [18]. Dodatkowo,ostatniewynikibadańprzeprowa- dzoneprzezHouiwsp.[21]wykazałykorelacjęmutacjiTP53 zniższąliczbąleukocytówipodtypemM6wedługklasyfikacji FABoraz wzajemnewykluczaniesięz mutacjamiw genach nukleofosminy-1 (nucleophosmin-1; NPM1), metylotransferazy 3ADNA(DNAmethyltransferase3a;DNMT3A)orazzwewnętrz- ną tandemową duplikacją kinazy tyrozynowej FLT3 (FLT3- internaltandemduplication;FLT3-ITD).

ChorzyzmutacjąTP53sązazwyczajoporninachemiotera- pię i charakteryzują się bardzo krótkim przeżyciem [27].

Częstość mutacji TP53 wzrasta w grupach chorych na AML i zespoły mielodysplastyczne(myelodysplastic syndrome; MDS) zależneodleczenia(therapyrelatedAML;t-AML,therapyrelated MDS;t-MDS),odsetekmutacjiwynosiodpowiednio18%i28%

i może być następstwem leczenia lekami alkilującymi, pochodnymi platyny czy inhibitorami topoizomerazy II [28– 30].Dodatkowowykazano,żewprzypadkuchorychnaAMLde novoprzeważająmutacjeTP53wpostacisubstytucjinukleoty- dów G na C, natomiast w przypadku chorych na t-AML częściejobserwowanesąsubstytucjenukleotydówAnaT[29].

MDS

WgrupieMDSmutacjeTP53identyfikowanesąuokoło8–9%

chorych[31, 32]i,podobniejakw przypadkuAML,częstość mutacjizwiększasięuchorychleczonychwcześniejlekami alkilującymi [29]. Kulasekararaj i wsp. [32] wykazali silną zależność między mutacjami TP53 a aberracjami chromo- somu5,identyfikującjeu19%chorychzizolowanądelecją 5q oraz u 72% chorych ze złożonym kariotypem, w tym zmianą -5/5q. Dodatkowo mutacje TP53 korelowały z II pośrednimstadium zaawansowania choroby wgskali IPSS, ekspresją białka p53, większą liczbą komórek blastycznych orazprogresjąchoroby.Mutacjezmianysensupojawiałysię znacznie częściej w dwóch typach MDS: RAEB (Refractory AnemiawithExcessBlasts)orazRAEB-T(RefractoryAnemiawith Excess Blasts in Transformation),którym częściejtowarzyszył kariotypzłożony[28,33].Mutacjezmianysensuwykrywane w eksonach 4-8obserwowanebyłyzarównojakozdarzenia wczesne,jakipóźne,wiązałysięzgwałtownymprzebiegiem chorobyiniekorzystnymrokowaniem[29].

ALL

U chorychnaostrąbiałaczkęlimfoblastyczną (acutelympho- blastic leukemia; ALL) mutacje TP53 występują na poziomie 2–3%,jednak,biorącpoduwagęzmiany,takiejakhiperme- tylacjemiejscapromotorowego,nieprawidłowościgenuTP53 mogą występować znacznie częściej tj. u 30–40% chorych [15]. Wykrywane sąonegłównie udzieci, gdzienajczęściej pojawiają sięw czasie nawrotów i sązwiązanez gorszym rokowaniem[34, 35]. Istnieje tylkokilka doniesień ostanie mutacji TP53 u dorosłych chorych, jednak obejmują one niewielkie grupyoraz głównie pacjentówz nawrotamicho- roby[36,37].

Analizastanu mutacji TP53u dorosłych chorych na ALL przeprowadzonaprzezzespółChiaretti[38]obejmowałagrupę 98 pacjentów i wykazała mutacje u 8,2% chorych, co było porównywalnezpoziomemmutacjiwykrywanychuchorych na AML w czasie diagnozy oraz u chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową (chronic lymphocytic leukemia; CLL) wczasieprogresji[39,40].Wynikitepotwierdziłypoprzednie doniesienia, w których mutacje TP53 były częściej znajdo- wane w nawrotowej postaci choroby [35–37]. Mutacje TP53 wykrywanebyłyczęściejwALLwywodzącejsięzliniilimfo- cytówTniżwALLwywodzącejsięzliniilimfocytówB,gdzie stanowiły 14% przypadków negatywnych pod względem występowanianawracającychgenówfuzyjnych[38].Ostatnio, Stengeliwsp.[41]przebadaligrupę625chorychnaALL,gdzie mutacje TP53 stanowiły 15,7%, a ich odsetek wzrastał z wiekiem.Mutacje znajdowanebyły najczęściejw grupach ALLzniskimpoziomemhipodiploidii (32–39chromosomów) irearanżacjamigenuMYC. MutacjeobualleliTP53obserwo- wanebyłyu12%chorych,natomiastmutacjaiwspółtowarzy- szącadelecjadrugiegoalleluwykrywanabyłau39%chorych.

Wysokiodsetekmutacjikorelowałzniskimpoziomemhipo- diploidii, wysokim poziomem hiperdiploidii, kariotypem złożonym oraz obserwowany był częściej u chorych ALL wywodzących się z linii limfocytów B. Podobnie jak w przypadku innych nowotworów, mutacje TP53 związane były z krótszym przeżyciem, szczególnie w przypadkach, kiedyobaallelegenubyłydotkniętezmianą[41].

MM

Mutacje TP53 występują rzadko u chorych na szpiczaka plazmocytowego(multiplemyeloma;MM),sąwykrywaneu3%

nowozdiagnozowanych pacjentów, jednak ich odsetek wzrastawbardziejzaawansowanych stadiachchoroby [42].

Chng i wsp. [42] wykazali, że obecność mutacji TP53 była istotniezwiązanazwystępowaniemdelecji17p13,costano- wiło56%przypadków,iporazpierwszyzostałaopisanajako czynnik o niezwykle niekorzystnym rokowaniu związany jedynie z 1,5-rocznym przeżyciem chorych. W przeciwień- stwiedotychwynikówLodeiwsp.[43]donieśli,żemutacje TP53 są ściśle związane z delecją 17p, jednak analiza przeżycia nie wykazała żadnych różnic wśród chorych z delecją 17p między grupami z lub bez współistniejącej mutacjiTP53. Dotychczasowebadaniawykonywanebyłyna nielicznychgrupachchorych,dlategojednoznaczneokreśle- nie zależności oraz znaczeniamutacji TP53 u tychpacjen- tówwymaga dalszych weryfikacji.Utratafunkcjitego genu stwierdzana jest w znacznie większej liczbie przypadków, dodatkowowgLodeiwsp.[43],większośćdelecji17p(około 63%) jest hemizygotyczna, co sugeruje, że u chorych bez mutacjiTP53zachowanejestfunkcjonalebiałkoipotencjal- nie może ono przezwyciężać negatywny efekt delecji 17p, jednakbezokreślonegoznaczeniaklinicznego.

CLL

NieprawidłowościgenuTP53wykrywanesąnapoziomie10– 15% u nieleczonych chorych na CLL, jednak ich częstość

wzrastado40–50%uchorychopornychnaleczeniefludara- biną [44, 45]. U ponad 80% przypadków z delecją 17p zaobserwowano występowanie mutacji TP53 w pozostałym allelu [46–48]. Ostatnie wynikibadańwykazały, że mutacje TP53 bezwspółistniejącejdelecji 17pwystępują uokoło 5%

chorychwpierwszejliniileczeniaisązwiązanezeznacznie gorszym przeżyciem,zwłaszcza w przypadkumutacjiznaj- dującej się w domenie wiążącej DNA [40, 47, 49]. Chorzy, u których wykryto mutacje w domenie wiążącej DNA, charakteryzowalisięznaczniekrótszymczasemwolnymod leczenia oraz czasem całkowitego przeżycia w porównaniu z chorymimającymimutacjezmianysensuwinnychmiej- scach białka oraz mutacje inne niż zmiany sensu [50].

Spektrum mutacji TP53 identyfikowane u chorych na CLL jest podobnedoinnychnowotworówjednakzaobserwowa- nokilkacechswoistychjedyniedlatejgrupypacjentów[49].

Badania oparte na wieloośrodkowych analizach wykazały niższyodsetek tranzycjiw miejscach CpGw porównaniu z innymi nowotworami. Zaobserwowano przeważającą liczbę tranzycji G na A w porównaniu z C na T, podczas gdy w przypadku innych nowotworów obserwowano podobne proporcjeobuzmian[51].

Stan mutacji genów zmiennej części łańcuchaimmuno- globulin(immunoglobulinheavyvariablechain;IGHV)jestnieza- leżnym czynnikiem prognostycznym chorych na CLL.

PozwalaonnarozróżnieniegrupyzmutacjąIGHVokorzyst- nymrokowaniuorazgrupybezmutacjicharakteryzującejsię agresywnym przebiegiem choroby [52, 53], co wskazuje na istotną rolę receptora B-komórkowego (B cell receptor; BCR) w patogenezie CLL. Dodatkowo, w około 20% przypadków nieleczonych pacjentówstwierdza sięwystępowanie niemal identycznych BCR, tzw.stereotypowychBCR. Wydajesię,że BCRodgrywarolęwoddziaływaniuzkomórkamipodścieliska [54].Dotejporywspółwystępowaniestymulacjimikrośrodo- wiska wraz z nieprawidłowościami genów związanych z rozwojem nowotworu, w tym TP53, stanowiło niewyjaś- nionąkwestię.Podjętopróbęzbadania,czyobazdarzeniasą zesobąpowiązane,czyteżwykazująniezależnemechanizmy prowadzącedo rozwojuCLL. Pierwsze analizymutacji TP53 odnoszące siędo stanu mutacji genów IGHV u chorych na CLL wykazały zwiększony odsetekw grupie z niezmutowa- nym IGHV.Dodatkowo,zaobserwowano różnyprofilmutacji TP53 w zależności od podtypu stereotypowych CLL [55].

W tabeli I przedstawiono częstość występowania mutacji TP53 w poszczególnych grupach chorych na nowotwory hematologiczne.

Metody detekcji mutacji TP53

Aktualnie mutacje TP53 uznawane są za silny czynnik predykcyjny związany z gorszym przeżyciem oraz nawro- tami u chorych naCLL [40, 46, 47, 56–58]. Wiele doniesień potwierdziło ich znaczenie kliniczne oraz bezpośrednie zastosowanie w postępowaniu terapeutycznym [49, 59–61]. Do tej pory stan mutacji TP53 nie był rutynowo oceniany, przezcorównieżniebyłydostępnewystandaryzowanetesty imetodydojegookreślenia.Zważywszynawartośćrokow- niczą oraz znaczenie w wyborzeoptymalnej metodylecze- nia,Europejska GrupadoBadańnad CLL(EuropeanResearch

InitiativeonCLL;ERIC)podjęłapróbęstandaryzacjimetodydo ocenystanumutacji[59].

Istnieje kilka metod umożliwiających wykrycie mutacji TP53.Należymiećnauwadze,żewynikuzależnionyjestod ilościkomórekbiałaczkowychwekrwi obwodowej.Jeśli ich odsetek nie przekracza 50%, należy rozważyć pobranie szpikukostnego,zwłaszczajeślimetodąocenystanumuta- cji jest bezpośrednie sekwencjonowanie metodą Sangera.

Alternatywąmogąbyć również separowanekomórkiCD19+

[59].

Obecnie rekomendowaną metodą do oznaczania stanu mutacji genu TP53 jest bezpośrednie sekwencjonowanie metodą Sangera [59]. Niektóre mutacje mogą prowadzić do degradacji RNA zachodzącej na drodze rozpoznawania iniszczeniatranskryptuzawierającegoprzedwczesnykodon stop [62], dlatego też materiałem z wyborujest genomowe DNA.Zuwaginausytuowanie mutacjiwewnątrzgenuTP53 rekomendujesięsekwencjonowanieeksonów4–9.Niestwier- dzonomutacjiweksonach2,3oraz11,natomiastweksonie 10wykryto jedynie4% wszystkichmutacjiTP53[49].Bezpo- średnie sekwencjonowanie wydaje się względnie prostą metodą, dostępną w większości laboratoriów, jednak jej czułość jest ograniczona w przypadkach występowania małych populacji komórek białaczkowych, gdzie zmiany molekularne mogą pozostać niewykryte. Pozytywny wynik sekwencjonowania dlamutacji TP53powinien być potwier- dzonyoddzielnąreakcjąPCR.Niekorzystnymaspektemdoty- czącym metody bezpośredniego sekwencjonowania jest względniedługiczaszwiązanyzprzygotowaniemreakcjioraz niskaczułość(jedynie25%zmutowanychalleliwpróbce).

Spośród innych dostępnych metod można wyróżnić metody przesiewowe, takie jak denaturująca wysoko- sprawna chromatografia cieczowa czy badanie zmian kon- formacjijednoniciowegoDNA, charakteryzującesięwiększą czułością orazniższymkosztem.Wynikitychanaliz muszą byćjednakpotwierdzonereakcjąsekwencjonowania,wcelu wykluczeniabłędówwynikającychzartefaktów.Mimowielu zalet, takich jak szybkość, prostota, ekonomiczność oraz

wysoka czułość, wyniki uzyskane tymi metodami nie dostarczająinformacjinatematrodzajumutacji.

Kolejnątechnikąjestfunkcjonalnaanalizaalleli wdroż- dżach(FunctionalAnalysisofSeparatedAllelesinYeast;FASAY).

Metoda ta oparta jest na klonowaniu komplementarnego DNApochodzącegozkomórkinowotworowejdozmodyfiko- wanych komórek drożdży. Ekspresja genu TP53 powoduje transkrypcję genu reportera ADE2, będącego enzymem uczestniczącymw syntezieadeniny.Niefunkcjonalnebiałko p53niewzbudzaaktywacjireporteraiprowadzidoakumu- lacji pośredniego czerwonego produktu metabolizmu ade- niny. Kolejnym etapem jest sekwencjonowanie materiału pochodzącego z czerwonych kolonii drożdży. FASAY jest metodą tanią, wykazującą czułość już przy około 10%

zawartości zmutowanego DNA obecnegow próbce. Metoda ta może być jednak niewystarczająca do wykrycia mutacji prowadzących do uszkodzenia RNA. Ponadto, wyniki uzy- skane techniką FASAY powinny być zawsze potwierdzone reakcjąsekwencjonowania.

Istnieją dwie platformy mikromacierzy stosowane do oznaczaniamutacjiTP53(GeneChipArraysoraz p53Ampli- Chip)[63].DziałaniemikromacierzyGeneChipopartejestna technice wydłużania starterówprzymocowanychdo mikro- macierzy (Arrayed Primer Extension; APEX), pozwalającej na szybką i czułą identyfikację mutacji w genie TP53. APEX łączy technologię sekwencjonowania Sangera z jednoczes- nym użyciem wysokoprzepustowego potencjału mikroma- cierzy. Badane DNA jest powielane, następnie podlega enzymatycznej fragmentacji i hybrydyzacji do immobilizo- wanych na płytce starterów. W kolejnym etapie zachodzi wydłużanie oligonukleotydów z użyciem czterech fluores- cencyjnie znakowanych dideoksynukleotydów. Każda sek- wencja jest kolejno wydłużana przez zastosowanie dwóch starterów skierowanychdonicisensownejiantysensownej [64]. Mikromacierzezostałyzaprojektowane dowykrywania 95% znanych mutacji TP53 [64]. Platforma p53 AmpliChip została wykorzystana jakonarzędziediagnostyczne służące do detekcji wszystkich substytucji pojedynczych par zasad oraz delecji pojedynczych nukleotydów leżących w eks- onach 2–11 i miejscach składania transkryptów z limitem detekcjiokoło1–2%zmutowanegoDNA.Zaletamimikroma- cierzyAmplichipsąszybkośćorazłatwośćużycia,natomiast platform GeneChips Arrays jednoczesna analiza mutacji wielu genów. Obecnie mikromacierze tego typu nie są powszechniedostępne[59].Zastosowanietechnologiiwyso- koprzepustowegosekwencjonowania (nextgenerationsequen- cing; NGS) do oceny stanu mutacji TP53 wydaje się coraz bardziej dostępnym rozwiązaniem. Analizując dużą liczbę pacjentówlub wielesekwencji,NGS prezentujetańsząoraz mniej czasochłonną opcję w porównaniu z innymi meto- dami. W zależności odoczekiwanychwyników sekwenator możesłużyćdojednoczesnejanalizydużejliczbypróbeklub dziękitzw.głębokiemusekwencjonowaniumożebyćzasto- sowany dosekwencjonowaniapróbekz bardzodużączuło- ścią. Główną trudnością związaną z techniką głębokiego sekwencjonowaniajestinterpretacjawynikówpolegającana odróżnieniufaktycznychmutacjiodprzypadkowychbłędów [65, 66]. Identyfikacja małych populacji uzależniona jest m.in od: 1) wystarczającej ilości materiału genetycznego poddanego analizie, 2) ilości odczytów dla próbki czy 3) TabelaI–OdsetekmutacjiTP53uchorychnanowotwory

hematologiczne

TableI–TP53mutationsinhematologicalmalignancies Jednostkachorobowa Odsetek

chorychz mutacjąTP53

Piśmiennictwo

AML

AMLzdelecją17p AMLzezłożonym

kariotypem t-AML

3–8%

90%

60–70%

18%

[14,19–21]

[17,24]

[17,21]

[28–30]

MDS

MDSzdelecją5q MDSzezłożonym

kariotypem t-MDS

8–9%

19%

72%

28%

[31,32]

[32]

[32]

[28–30]

ALL

ALLzdelecją17p

15,7%

39%

[41]

[41]

MM

MMzdelecją17p13

3%

37–56%

[42]

[42,43]

CLL

CLLzdelecją17p

10–15%

80%

[44,45]

[46–48]

błędów występujących na każdym etapie przygotowania próbki, w procesie sekwencjonowania i analizy danych.

Ostatniewynikibadańprzeprowadzonetechnikągłębokiego sekwencjonowaniawykazały obecność małych subpopulacji komórekzmutacjąTP53u9%nieleczonychchorychnaCLL, którezewzględunabardzoniskipoziomniezostaływykryte metodą konwencjonalnego sekwencjonowaniaSangera [67].

Chorzy, u których wykryto małe subpopulacje z mutacją TP53,charakteryzowalisiępodobnymfenotypemklinicznym oraz przeżyciem w porównaniu z chorymi z dominującym klonemkomórekobjętychmutacją.Dodatkowokolejneanali- zy wykazały, że komórki z mutacją TP53 wykryte przed rozpoczęciemleczenia ulegały ekspansji istanowiły główną populację komórek nowotworowych w czasie nawrotu, jak równieżprzyczyniałysiędorozwojuopornościnachemiote- rapię [67]. Dzięki dużejczułości metodagłębokiegosekwen- cjonowaniaNGSumożliwiławykryciebardzomałychpopula- cji z mutacją TP53, które również mają znaczeniekliniczne uchorychnaCLL.WzwiązkuztymużycieNGSwprzyszłych badaniachwydajesięzasadneimogłobysłużyćdoszczegóło- wejanalizynieprawidłowościgenuTP53utychchorych[67].

Leczenie chorych z nieprawidłowościami genu TP53 w nowotworach hematologicznych

Leczenie chorych z nieprawidłowościami genu TP53 jest wyzwaniemwspółczesnejhematologii,zewzględunazwią- zanez tą aberracjązłe rokowanieoraz opornośćna trady- cyjneschematyleczenia.Leczenietomożebyćnakierowane bezpośrednio na aktywność p53 lub aktywację innychme- chanizmów i osiągają dobre odpowiedzi kliniczne w tej grupiechorych.

Leczenie nacelowane na nieprawidłowości szlaku p53 w nowotworach hematologicznych

Istniejewieledowodów nato,że lekiprzeciwnowotworowe indukują apoptozę poprzez różne mechanizmy, które przy- najmniejczęściowo zależne sąodaktywacji białka p53 [68– 71]. Aktualnie podjęte są próby rozwoju strategii leczenia opartych na małych cząsteczkach, które w sposób swoisty mogłybymodulowaćaktywnośćtegobiałka.Wyróżnićmożna dwie kategorie cząsteczek: pierwsze z nich mają na celu modulowanieaktywnościdzikiegotypubiałkap53,natomiast drugie odpowiedzialne są za przywrócenie prawidłowych funkcjizmutowanego białka. Zastosowaniebadańkomórko- wychumożliwiło zidentyfikowaniemałych cząsteczek,które zudziałembiałkap53mogąpowodowaćniszczeniekomórek nowotworowych[69–71]. Do cząsteczek tych należąnutliny, RITA(reactivationofp53and inductionoftumorcellapoptosis) oraz PRIMA-1 (p53 reactivation and induction of massive apoptosis)[72–74].Zdrugiejstronywynikianalizbiałkowych pozwoliły na zidentyfikowanie związków chemicznych, które bezpośrednio oddziałują z konkretnymi białkami, jednakmogąoneodznaczaćsięznacznątoksycznościąoraz niewystarczalną biodostępnością [74–76]. Małe cząsteczki należące dowyżejwymienionychkategoriisąwciążtema- tem badań, niektóre z nich zostały zakwalifikowane do

zaawansowanych prób przedklinicznych bądź do wczes- nychfaz(1/2)badańklinicznych.

Nutliny zostały opisanejako pierwsze cząsteczki hamu- jące oddziaływanie między białkiem p53, a jego negatyw- nym regulatorem – białkiem MDM2 [72]. Reprezentują one związki, które nie wykazują działania genotoksycznego, a ich aktywność oparta jest na wiązaniu się do kieszeni wiążącej p53w białku MDM2,co powoduje uwolnieniep53 spod negatywnej kontroli MDM2. Efekt ten prowadzi do skutecznej stabilizacji p53 i jego aktywacji w komórkach nowotworowych wykazujących ekspresję dzikiego typu białka p53, lecz nie zmutowanego białka [72, 76, 77]. Od czasu ich wykrycia nutliny stały się jednymi z najbardziej badanych małychcząsteczekw kontekście terapii przeciw- nowotworowej (NCT00623870, NCT00559533). W badaniach przedklinicznych wykazywały onewysoki potencjał leczni- czy dlanowotworów hematologicznych [78–82]. Wykazano, żenutlinyindukująodpowiedźcytotoksycznąorazapoptozę w komórkach pochodzących od chorych na AML oraz ALL [78, 79, 83, 84]. Selektywna aktywacja p53 poprzez nutliny indukowała w sposób zmienny apoptozę komórek pocho- dzących od chorych na CML [85, 86] oraz CLL zarówno o niskim, jak i wysokim stopniu ryzyka choroby [87–90]. Aktywność przeciwnowotworowa nutlin została również zaobserwowanawkomórkachpochodzącychodchorychna MM oraz w komórkach mikrośrodowiska szpiku kostnego tychpacjentów[81,91,92].

Kolejnącząsteczkąpowodującąreaktywacjęp53jestRITA.

Wiążąc się z p53, RITA rozrywa jego wiązanie z MDM2, co powoduje indukcję apoptozy [73, 76]. Aktywność cząsteczki RITAzostałapierwszyrazopisanadlakomórekpochodzących odchorychnaCLLorazAML[14].Wbadaniutymwykazano ciągłą aktywację szlaku przekaźnictwa sygnału z udziałem białka p53, prowadzącą do indukcji końca cyklu komórko- wegoorazapoptozykomórekAMLiCLLzekspresjądzikiego typup53[14].Wykazanorównieżjejdziałaniesynergistyczne wpołączeniuzfludarabinąwkomórkachCLLbezwzględuna status p53 orazw połączeniu zPRIMA-1 wkomórkach AML [14]. Przeciwnowotworowa aktywność tej cząsteczki została wykazana również dla komórek MM [93]. Początkowo uwa- żano, że RITA wiąże się z domeną N-końcową białka p53, indukując jego zmianę konformacyjną i powodując wzrost jegoczasupółtrwaniaorazakumulacjęwkomórkachnowo- tworowych. Ostatnie badania wykorzystujące metodę spek- troskopii magnetycznegorezonansujądrowego(nuclear mag- netic resonance; NMR) wykazały, że cząsteczka RITA może zmieniaćfunkcjep53poprzezodrębnemechanizmy,takiejak oddziaływaniezinnymibiałkamiwiążącymiczykofaktorami [94]. Saha i wsp. [95] wykazali, że RITA może wiązać się zN-końcemkinazyc-Jun(c-JunN-terminalkinase;JUN)iwten sposóbindukowaćapoptozęwkomórkachMM.Narycinie1A przedstawiono mechanizmy działanianutlinorazcząsteczki RITAnadzikitypbiałka53,prowadzącedoapoptozykomórek nowotworowych.

Zwróceniemałychcząsteczek wkierunkuoddziaływania zezmutowanymbiałkiemp53okazałosiębardziejskompli- kowane niż aktywacja dzikiego typu p53 w komórkach nowotworowych. Aktualnie opisano dwie małe cząsteczki, charakteryzującesięswoistymprzywracaniemfunkcjizmu- towanegobiałkap53wnowotworachhematologicznych.

PRIMA-1 jest związkiem chemicznym o niskim ciężarze molekularnym, który przywraca prawidłową konformację zmutowanegobiałkap53iswoiściewiążesięzDNA,wywo- łując apoptozę komórek nowotworowych z ekspresją tej formy białka [70, 74, 96, 97]. PRIMA-1 umożliwia ponowne sfałdowanie zarównozmutowanego, jak idzikiegotypu p53 [98]. Została ona zidentyfikowana w 2002 roku jako czą- steczka o aktywności hamującej wzrost różnychtypów ko- mórek linii nowotworowych z mutacją p53 [70, 74, 96].

W 2009 roku została ona włączona do badań klinicznych (NCT00900614), ponieważ stanowiła obiecujący lek przeciw- nowotworowy[99].Nahiiwsp.[97,100]opisaliwpływPRIMA- 1 na komórki pochodzące odchorych na CLL i AML z lub zbrakiemdelecjip53.Niewykazanożadnychistotnychróżnic w odpowiedzi cytotoksycznej pomiędzy komórkami CLL zhemizygotycznądelecjąp53akomórkamibezdelecji[100].

WprzypadkuAMLPRIMA-1wykazywałasięwiększącytotok- sycznością względem komórek z hemizygotyczną delecją/

mutacją p53 [97]. Dodatkowo zaobserwowano jej synergi- stycznelubaddytywnedziałaniewpołączeniu zfludarabiną w komórkach CLL i AML [100, 101]. Metylowany analog PRIMA-1(themethylatedanalogofPRIMA-1;PRIMA-1Met)został równieżzakwalifikowanydopróbyklinicznejjakocząsteczka o silniejszympotencjaleterapeutycznym[99]. Wykazano,że

Ryc.1–Mechanizmyindukcjiapoptozywywołaneprzez małecząsteczkiskierowanebezpośrednionadzikityplub zmutowanebiałkop53oraznoweinhibitory

przekaźnictwasygnałuprzezreceptorB-komórkowy (A)Nutlinyhamująoddziaływaniemiędzybiałkiemp53a jegonegatywnymregulatorembiałkiemMDM2.Efektten prowadzidoskutecznejstabilizacjip53ijegoaktywacji poprzezwywoływanieapoptozyorazzahamowaniecyklu komórkowegowkomórkachnowotworowych.Wiążącsię zp53,RITArozrywajegowiązaniezMDM2ipowoduje indukcjęapoptozy.WkomórkachMMRITAmożewiązać sięzkinaząJUN(c-JunN-terminalkinase)irównieżwten sposóbindukowaćapoptozę.(B)CząsteczkaPRIMA-1 przywracaprawidłowąkonformacjęzmutowanegobiałka p53iwywołujeapoptozękomóreknowotworowych.

PRIMA-1umożliwiaponownesfałdowaniezarówno zmutowanego,jakidzikiegotypup53.DziałanieMIRA-1 orazjejanalogówpoleganaprzywróceniutransaktywacji genównadrodzezależnejodp53orazindukcjiapoptozy.

(C)IbrutynibjestselektywnyminhibitoremkinazyBtk (Brutontyrosinekinase),uczestniczącejwprzekazywaniu sygnałupłynącegoprzezBCR.Idelalizybjestselektywnym

inhibitoremizoformydkinazyPI3Kd(phosphoinositide 3-kinased;PI3Kd).AktywnaformaPI3Kdpowoduje pobudzeniekinazyserynowo-treoninowejAKToraz kinazymTOR(mammaliantargetofrapamycinkinase), spełniającychistotnefunkcjewprocesachmetabolizmu komórkowego,proliferacji,migracjikomórekczy przeżycia.BlokowaniekinazyPI3Kdprzezidelalizyboraz kinazyBtkprzezibrutynibhamujeprzekazywaniesygnału przezBCR,prowadzącdozahamowaniaproliferacji iindukcjiapoptozykomórekbiałaczkowych

Fig.1–Inductionofapoptosiscausedbysmallmolecules targetingmutantorwildtypep53andnewinhibitorsaffected B-cellreceptorsignaltransduction

(A)Nutlinsinhibitinteractionbetweentumorsuppressorp53 anditsnegativeregulatorMDM2.Thiseffectleadstothe stabilizationandactivationofp53,whichcauseapoptosisand cellcyclearrestofmalignantcells.RITAdisruptsinteraction betweenMDM2andp53inducingapoptosis.InMMcells,RITA canalsobindtotheJUNkinase(c-JunN-terminalkinase)and triggeringapoptosis.(B)SmallmoleculePRIMA-1restores conformationofmutantp53andinducesapoptosisoftumor cells.PRIMA-1canrefoldbothunfoldedmutantp53and unfoldedwildtypep53.MIRA-1actswithp53mutantand causesrestorationofp53-mediatedtransactivationoftarget genesandtheinductionofp53-dependentapoptosis.(C) IbrutinibrepresentsaselectiveinhibitoroftheBtkkinase (Brutontyrosinekinase),whichisinvolvedinBCRsignalling transduction.IdelalisibisaselectiveinhibitorofthePI3K kinasedisoform(phosphoinositide3–kinased).Activationof PI3KdsubsequentlyactivatesthekinasesAKTandmTOR (mammaliantargetofrapamycinkinase),andexerts multipleeffectsonmetabolism,proliferation,cellmigration, andsurvival.BothibrutinibandidelalisibblockBCRsignaling, whichinhibitsproliferationanddrivescellsintoapoptosis

PRIMA-1Met może w sposób selektywny oddziaływać na zmutowanebiałko p53 iindukować apoptozęw komórkach nowotworowych, jednocześnie nie wywołując znacznego wpływunadzikitypp53wkomórkachprawidłowych[96].Do tej pory oddziaływanie PRIMA-1Met na p53 w komórkach nowotworowychbez mutacji p53 nie jest w pełni poznane.

Wydaje się, że PRIMA-1Met może odgrywać rolę cząsteczki przywracającejfunkcjenieaktywnemubiałkup53,niezależnie od stanu mutacji. Wyniki ostatnich badań dowodzą, że PRIMA-1Met może wywoływać apoptozęrównież w komór- kachzdzikimtypemp53lubwkomórkachbezekspresjip53 [100–102].BadanianakomórkachMMcharakteryzującychsię ekspresją lub brakiem ekspresji p53 sugerują, że apoptoza możebyćwywołananadrodzeaktywacjibiałkap73[102].

Kolejną cząsteczką indukującą apoptozę w komórkach z mutacją p53 jest MIRA-1. Wykazuje ona odmienną od PRIMA-1 strukturę i wydaje się mieć silniejsze działanie [103]. Reaktywacja zmutowanego białka p53 poprzez cząs- teczkę MIRA-1 zachodzi poprzez indukowanie ekspresji genówzależnych odp53, takich jakp21, MDM2oraz Puma, w guzach litych. Uważa się, że działanie MIRA-1 oraz jej analogówpoleganaprzywróceniutransaktywacjigenówna drodzezależnejodp53 oraz indukcji apoptozy.Na podsta- wiebadańprzeprowadzonychnaliniachkomórkowychoraz komórkach pochodzących odchorych naMM stwierdzono, żeaktywnośćMIRA-1 jestniezależnaodstanu mutacjip53 [104]. Rycina 1B przedstawia uogólnionyschemat działania cząsteczek PRIMA-1 i MIRA-1 na zmutowaną postać białka p53inicjującychapoptozękomórekbiałaczkowych.

Nowe metody leczenia skuteczne u chorych z nieprawidłowościami szlaku p53

DoniedawnachorzynaCLLzmutacjąTP53bądźdelecją17p byli leczeni konwencjonalnym schematem CIT (na przykład FCR) lub terapią opartą na alemtuzumabie (samym bądź skojarzonym z kortykosteroidami) [105, 106]. Czas trwania remisjiosiąganyutychpacjentówbyłjednakznaczniekrótszy wporównaniuzinnymigrupamiryzyka,dlategoallogeniczne przeszczepianekrwiotwórczychkomórekmacierzystych(allo- geneichematopoietic stem cell transplantation; allo-HSCT) wyda- wało się jedyną opcją terapeutyczną. Wyniki aktualnych badań określiły skuteczność tej metody na ok. 40% remisji utrzymującychsięwfazieplateau,comożesugerować,żeta formaleczeniamożeprowadzićdowyleczeniapewnejliczby chorych na CLL. Opcja ta powinna być jednak uważnie przedyskutowanaorazjestzarezerwowanadlachorychopor- nych/nawrotowychmającychnieprawidłowościTP53.

Sytuacjaterapeutyczna wCLL uległaistotnymzmianom wostatnichlatachwraz zwprowadzeniemdwóchinhibito- rówprzekaźnictwaprzezBCR.Wedługnajnowszychzaleceń Europejskiego Towarzystwa Onkologii Medycznej (European SocietyforMedicalOncology;EMSO)pierwsząliniąleczeniadla chorychnaCLL zdelecjąbądźmutacjągenuTP53 są nowe inhibitory:ibrutynib orazidelalizybwpołączeniuz rytuksy- mabem[107].Uchorych odpowiadających naleczenietymi inhibitorami alloHSCT jest kwestią dyskusyjną i zależy od indywidualnychorazzwiązanychzprzeszczepianiemczyn- ników ryzyka [108]. Kontynuowanie leczenia u chorych

z podwyższonymryzykiemnawrotumożeprzynosićpewne korzyści,jednakniejestwpełnirekomendowane[107].

Ibrutynib jest selektywnym inhibitorem kinazy Brutona (Bruton tyrosinekinase; Btk),uczestniczącej w przekazywaniu sygnału płynącegoprzez BCR. Ibrutynib wiążesiędoreszty cysteiny w miejscu aktywnym Btk, powodując jego trwałe unieczynnienie, przez co uniemożliwia przekazywanie syg- nału[109].Badaniaprzeprowadzonenachorychzrozrostami B-komórkowymi, w tym CLL oraz chłoniakiem z małych limfocytów B (small lymphocytic leukemia; SLL) wykazały, że ibrutynib jest lekiem o dobrej tolerancji, związanym z wysokim wskaźnikiemodpowiedzi [110–112]. W grupie85 chorychnanawrotowąlubopornąpostaćCLL/SLLwfazie1b/

2badaniaklinicznego(NCT01105247)wykazano,żecałkowity odsetek odpowiedzi (overall responserate; ORR) zostałosiąg- niętyu71%chorych,przyczym26-miesięcznyczaswolnyod progresji(progressionfreesurvival,PFS)osiągnęło75%chorych [111].Wyniki3.fazybadaniaklinicznego(NCT01578707)nad skutecznością leczenia ibrutynibem w porównaniu z ofatu- mumabem wykazały, że chorzy na CLL/SLL, którzy leczeni byli wcześniej przynajmniej jednym schematem, osiągali istotniedłuższecałkowiteprzeżycie (overallsurvival;OS),PFS orazORR[113].Niezaobserwowanożadnychistotnychróżnic w 12-miesięcznym PFS między chorymi charakteryzującymi się brakiem lub występowaniem delecji 17p [113]. Wstępne wyniki2.fazybadaniaklinicznego(NCT01744691)prowadzo- nego na144chorychnanawrotowąlub opornąpostać CLL/

SLL z delecją 17p wykazały znaczną skuteczność leczenia ibrutynibem w odniesieniudo ORR, PFSoraz czasutrwania odpowiedzi (duration of response;DOR) [114]. W12. miesiącu badania79,3% pacjentówpozostawałowolnychodprogresji, cobyłozgodnezwcześniejszymiwynikami[114].

Idelalizybjestselektywnyminhibitoremizoformydkinazy PI3K (phosphoinositide 3-kinase d; PI3Kd), ulegającej ekspresji wleukocytachiodgrywającejkluczowąrolęwprzekaźnictwie sygnału przez receptor BCR [115]. Aktywna forma PI3Kd powoduje pobudzenie kinazy serynowo-treoninowej AKT oraz kinazy mTOR (mammalian target of rapamycin kinase), spełniających istotne funkcje w procesach metabolizmu komórkowego, proliferacji, migracji komórek czy przeżycia [116].BlokowaniekinazyPI3Kdprzezidelalizybhamujeprze- kazywanie sygnału na ścieżce PI3Kd/AKT, co prowadzi do apoptozykomórekbiałaczkowych.Wynikibadań3fazypróby klinicznej(NCT01539)nadskutecznościąleczeniaidelalizybu w połączeniu z rytuksymabem w porównaniu z placebo zrytuksymabemwykazałyistotnewydłużeniePFS,ORRoraz OS wśród chorych na nawrotową postać CLL leczonych pierwszym schematem leków [117]. Według najnowszych danych,medianaPFSwgrupieleczonychidelalizybemosiąg- nięła19,4miesiąca,podczasgdyw grupieplacebowynosiła 6,5 miesiąca. Efekt leczenia idelalizybem był podobny we wszystkich grupach chorych, niezależnie od stanu mutacji TP53,delecji17p czymutacjiIGHV[117]. O’Brien iwsp.[118]

opisali wyniki 2. fazy próby klinicznej (NCT01203930) nad skutecznościąleczeniaidelalizybemirytuksymabemuniele- czonychwcześniejchorychnaCLL/SLL.ORRzostałosiągnięty u97%chorych,zktórych19%osiągnęłocałkowitąodpowiedź.

U pacjentów z delecją 17p lub mutacją TP53 ORR wynosił 100%, natomiastuchorych z niezmutowanymgenem IGHV ORRwynosił97%.W36.miesiącubadaniaPFSosiągnęło83%

chorych [118]. Schematdziałaniaibrutynibuorazidelalizybu naprzekaznictwoBCRzostałprzedstawionynarycinie1C.

AktualnewytyczneESMOnierekomendująterapiialemtu- zumabem w pierwszej linii nawet u starszych chorych zdelecją17p,pomimożetenlekwykazywałistotniewyższe odsetki odpowiedzi w porównaniu z chlorambucilem w tej grupiechorych [119].Pomimo braku bezpośredniegoporów- nania alemtuzumabu z terapią inhibitorami przekaźnictwa przez BCR, zarówno ibrutynib,jak i idelalizyb w połączeniu z rytuksymabem wykazują znacznie większą aktywność w badaniach rejestracyjnych w grupach chorych opornych/

nawrotowych,uktórychmożnasiębyłospodziewaćgorszych odpowiedzi.

Spośród innych cząsteczek mogących mieć znaczenie w leczeniu rozrostów hematologicznych można zwrócić uwagęnabromowodorekhalofuginonu(halofuginonehydrobro- mide; HF) czy cząsteczkę JNJ-26854165, będącą pochodną tryptaminy. W swoich badaniach in vitro oraz in vivo Leiba iwsp.[120]opisali HRjakocząsteczkę wywołującązahamo- wanie wzrostu zarówno komórek linii szpiczakowych, jak ikomórekodchorychnaMM.DodatkowoHRnasilałcytotok- sycznośćinnychleków,jakmelfalan, deksametazon, dokso- rubicynaczy lenalidomid[120].JNJ-26854165zostałaopisana jakocząsteczkablokującaproteasomalnądegradacjęp53oraz indukująca apoptozę w komórkach linii białaczkowych z prawidłowymbądźzmutowanymp53 [121]. Kolejną grupę stanowiąinhibitorybiałkaBcl2,będącegoistotnymregulato- remapoptozyiwykazującegozwiększonąekspresjęwkomór- kachCLL [122]. Dozwiązkówz tejgrupy należą:obatoklaks (GX15-070), nawitoklaks (Abt-263) czy nawitoklaks (Abt-199) [123–125].Szczególniewynikibadańklinicznychzzastosowa- niemtegoostatniegowydająsiębardzoobiecujące wgrupie chorych naCLLz aberracjami TP53.Prowadzanesą badania nad skutecznością leczenia inhibitorami kinaz cyklinozależ- nych (cyclin-dependent kinases; CDK), mogącymi przynosić pewnekorzyściwleczeniuchorychzdelecją17p[126].

Podsumowując, zaburzenia szlaku TP53 obejmujące za- równo delecję 17p, jak i mutacje TP53, stanowią istotny problemwleczeniuchorychnanowotworyhematologiczne.

Wynikipracbadawczychmającychnaceluaktywacjęszlaku p53, czyli odwrócenie biologicznego efektu mutacji, są bardzoobiecujące,jednakprzełomowe wydajesięwprowa- dzeniedo terapii leków o innychmechanizmach działania skuteczneuchorychzmutacjągenuTP53.

Wkład autorów/Authors’ contributions

Wedługkolejności.

Konflikt interesu/Conflict of interest

Niewystępuje.

Finansowanie/Financial support

Artykuł powstał dzięki wsparciu firmy Gilead Sciences Poland, jednakże w pracy nie zachodzi konflikt interesów,

a prezentowana w niej problematyka ma charakter obiek- tywny.

Etyka/Ethics

Treści przedstawione w artykule są zgodne z zasadami Deklaracji Helsińskiej,dyrektywamiEUorazujednoliconymi wymaganiamidlaczasopismbiomedycznych.

pi smiennictwo/references

[1] LambP,CrawfordL.Characterizationofthehumanp53 gene.MolCellBiol1986;6:1379–1385.http://dx.doi.org/

10.1128/MCB.6.5.1379.Updated.

[2] Yanga,KaghadM,WangY,GillettE,FlemingMD,Dötsch V,etal.P63,aP53HomologAt3Q27-29,EncodesMultiple ProductsWithTransactivating,Death-Inducing,and Dominant-NegativeActivities.MolCell1998;2:305–316.

http://dx.doi.org/10.1016/S1097-2765(00)80275-0.

[3] KhouryMP,BourdonJ-C.p53Isoforms:AnIntracellular Microprocessor?GenesCancer2011;2:453–465.http://dx.

doi.org/10.1177/1947601911408893.

[4] BiegingKT,MelloSS,AttardiLD.Unravellingmechanisms ofp53-mediatedtumoursuppression.NatRevCancer 2014;14:359–370.http://dx.doi.org/10.1038/nrc3711.

[5] LevineAJ.P53,theCellularGatekeeperforGrowthand Division.Cell1997;88:323–331.http://dx.doi.org/10.1016/

S0092-8674(00)81871-1.

[6] LevineAJ,MomandJ,FinlayCa.Thep53tumour suppressorgene.Nature1991;351:453–456.http://dx.doi.

org/10.1038/351453a0.

[7] FinlayCa,HindsPW,LevineAJ.Thep53proto-oncogene canactasasuppressoroftransformation.Cell

1989;57:1083–1093.http://dx.doi.org/10.1016/0092-8674(89) 90045-7.

[8] El-DeiryWS,HarperJW,O’ConnorPM,VelculescuVE, CanmanCE,JackmanJ,etal.WAF1/CIP1isinducedinp53- mediatedG1arrestandapoptosis.CancerRes1994;54:

1169–1174.

[9] SigalA,RotterV.OncogenicMutationsofthep53Tumor Suppressor:TheDemonsoftheGuardianoftheGenome OncogenicMutationsofthep53TumorSuppressor:The DemonsoftheGuardianoftheGenome.CancerRes 2000;53:6788–6793.http://dx.doi.org/10.3748/wjg.14.3819.

[10] HarrisCC.Structureandfunctionofthep53tumor suppressorgene:cluesforrationalcancertherapeutic strategies.JNatlCancerInst1996;88:1442–1455.

[11] KirschDG,KastanMB.Tumor-suppressorp53:

implicationsfortumordevelopmentandprognosis.JCO 1998;16:3158–3168.

[12] OrenM,RotterV.Mutantp53Gain-of-FunctioninCancer.

ColdSpringHarbPerspectBiol2010;2.http://dx.doi.org/

10.1101/cshperspect.a001107.a001107–a001107.

[13] SoussiT,DehoucheK.p53Websiteandanalysisofp53 genemutationsinhumancancer:Forgingalinkbetween epidemiologyandcarcinogenesis.HumMutat

2000;15:105–113.http://dx.doi.org/10.1002/(SICI)1098-1004 (200001)15:1<105::AID-HUMU19>3.0.CO;2-G.

[14] NahiH,SelivanovaG,LehmannS,MöllgårdL,BengtzenS, ConchaH,etal.Mutatedandnon-mutatedTP53astargets inthetreatmentofleukaemia.BrJHaematol2008;141:445–

453.http://dx.doi.org/10.1111/j.1365-2141.2008.07046.x.

[15] AgirreX,NovoFJ,CalasanzMJ,LarráyozMJ,LahortigaI, ValgañónM,etal.TP53IsFrequentlyAlteredby

Methylation,Mutation,and/orDeletioninAcute LymphoblasticLeukaemia.MolCarcinog2003;38:201–208.

http://dx.doi.org/10.1002/mc.10159.

[16] PekovaS,MazalO,CmejlaR,HardekopfDW,PlachyR, ZejskovaL,etal.AcomprehensivestudyofTP53 mutationsinchroniclymphocyticleukemia:Analysisof 1287diagnosticand1148follow-upCLLsamples.LeukRes 2011;35:889–898.http://dx.doi.org/10.1016/j.

leukres.2010.12.016.

[17] HaferlachC,DickerF,HerholzH,SchnittgerS,KernW, HaferlachT.MutationsoftheTP53geneinacutemyeloid leukemiaarestronglyassociatedwithacomplexaberrant karyotype.LeukOffJLeukSocAmLeukResFundUK 2008;22:1539–1541.http://dx.doi.org/10.1038/leu.2008.143.

[18] RückerFG,SchlenkRF,BullingerL,KayserS,TeleanuV, KettH,etal.TP53alterationsinacutemyeloidleukemia withcomplexkaryotypecorrelatewithspecificcopy numberalterations,monosomalkaryotype,anddismal outcome.Blood2012;119:2114–2121.http://dx.doi.org/

10.1182/blood-2011-08-375758.

[19] FenauxP,JonveauxP,QuiquandonI,LaïJL,PignonJM, Loucheux-LefebvreMH,etal.P53genemutationsinacute myeloidleukemiawith17pmonosomy.Blood

1991;78:1652–1657.

[20] SlingerlandJM,MindenMD,BenchimolS.Mutationofthe p53geneinhumanacutemyelogenousleukemia.Blood 1991;77:1500–1507.

[21] HouH,ChouW-C,KuoY-Y,LiuC-Y,LinL-I,TsengM-H, etal.TP53mutationsindenovoacutemyeloidleukemia patients:longitudinalfollow-upsshowthemutationis stableduringdiseaseevolution.BloodCancerJ2015;5:

e331.http://dx.doi.org/10.1038/bcj.2015.59.

[22] GreenblattMS,BennettWP,HollsteinM,HarrisCC.The p53tumorsuppressorgene:Cluestocanceretiologyand molecularpathogenesis.LungCancer1994;11:126–127.

http://dx.doi.org/10.1016/0169-5002(94)92083-4.

[23] ProkocimerM,UngerR,RennertHS,RotterV,RennertG.

Pooledanalysisofp53mutationsinhematological malignancies.HumMutat1998;12:4–18.http://dx.doi.org/

10.1002/(SICI)1098-1004(1998)12:1<4::AID-HUMU2>3.0.

CO;2-G.

[24] SchochC,KernW,KohlmannA,HiddemannW,Schnittger S,HaferlachT.Acutemyeloidleukemiawithacomplex aberrantkaryotypeisadistinctbiologicalentity

characterizedbygenomicimbalancesandaspecificgene expressionprofile.GenesChromosomCancer2005;43:

227–238.http://dx.doi.org/10.1002/gcc.20193.

[25] SeifertH,MohrB,ThiedeC,OelschlägelU,SchäkelU, IllmerT,etal.Theprognosticimpactof17p(p53)deletion in2272adultswithacutemyeloidleukemia.LeukOffJ LeukSocAmLeukResFundUK2009;23:656–663.http://dx.

doi.org/10.1038/leu.2008.375.

[26] ZhuYM,Das-GuptaEP,RussellNH.Microsatellite instabilityandp53mutationsareassociatedwith abnormalexpressionoftheMSH2geneinadultacute leukemia.Blood1999;94:733–740.

[27] WattelE,PreudhommeC,HecquetB,VanrumbekeM, QuesnelB,DerviteI,etal.P53MutationsAreAssociated WithResistanceToChemotherapyandShortSurvivalin HematologicMalignancies.Blood1994;84:3148–3157.

[28] Pedersen-BjergaardJ,AndersenMK,AndersenMT, ChristiansenDH.Geneticsoftherapy-related

myelodysplasiaandacutemyeloidleukemia.Leukemia 2008;22:240–248.http://dx.doi.org/10.1038/sj.leu.2405078.

[29] ChristiansenD,AndersenM,Pedersen-BjergaardJ.

Mutationswithlossofheterozygosityofp53arecommon intherapy-relatedmyelodysplasiaandacutemyeloid leukemiaafterexposuretoalkylatingagentsand significantlyassociatedwithdeletionorlossof5q,a

complexkaryotype,andapoorprognosis.JClinOncol 2001;19:1405–1413.

[30] MerlatA,LaiJ,SterkersY,DemoryJ,BautersF, PreudhommeC,etal.Therapy-relatedmyelodysplastic syndromeandacutemyeloidleukemiawith17pdeletion.

Areporton25cases.Leukemia1999;13:250–257.

[31] BejarR,StevensonK,Abdel-WahabO,GaliliN,NilssonB, Garcia-ManeroG,etal.ClinicalEffectofPointMutationsin MyelodysplasticSyndromes.NEnglJMed2011;364:

2496–2506.http://dx.doi.org/10.1056/NEJMoa1013343.

[32] KulasekararajAG,SmithAE,MianSa,MohamedaliAM, KrishnamurthyP,LeaNC,etal.TP53mutationsin myelodysplasticsyndromearestronglycorrelatedwith aberrationsofchromosome5,andcorrelatewithadverse prognosis.BrJHaematol2013;160:660–672.http://dx.doi.

org/10.1111/bjh.12203.

[33] HoriikeS,Kita-SasaiY,NakaoM,TaniwakiM.

ConfigurationoftheTP53geneasanindependent prognosticparameterofmyelodysplasticsyndrome.Leuk Lymphoma2003;44:915–922.http://dx.doi.org/10.1080/

1042819031000067620.

[34] WadaM,BartramCR,NakamuraH,HachiyaM,ChenDL, BorensteinJ,etal.Analysisofp53mutationsinalarge seriesoflymphoidhematologicmalignanciesof childhood.Blood1993;82:3163–3169.

[35] HofJ,KrentzS,VanSchewickC,KörnerG,ShalapourS, RheinP,etal.MutationsanddeletionsoftheTP53gene predictnonresponsetotreatmentandpooroutcomein firstrelapseofchildhoodacutelymphoblasticleukemia.

JClinOncol2011;29:3185–3193.http://dx.doi.org/10.1200/

JCO.2011.34.8144.

[36] ZhuYM,ForoniL,McQuakerIG,PapaioannouM,Haynesa, RussellHH.Mechanismsofrelapseinacuteleukaemia:

involvementofp53mutatedsubclonesindisease progressioninacutelymphoblasticleukaemia.BrJCancer 1999;79:1151–1157.http://dx.doi.org/10.1038/sj.bjc.6690183.

[37] TangJL,TienHF,LinMT,ChenPJ,ChenYC.Frequentp53 mutationinrelapsedacutelymphoblasticleukemiawith cytogeneticinstability:Alongitudinalanalysis.Anticancer Res1998;18:1273–1278.

[38] ChiarettiS,BrugnolettiF,TavolaroS,BoninaS,PaoloniF, MarinelliM,etal.TP53mutationsarefrequentinadult acutelymphoblasticleukemiacasesnegativeforrecurrent fusiongenesandcorrelatewithpoorresponseto inductiontherapy.Haematologica2013;98:59–61.http://dx.

doi.org/10.3324/haematol.2012.076786.

[39] FenauxP,PreudhommeC,QuiquandonI,JonveauxP,Laï JL,VanrumbekeM,etal.MutationsoftheP53genein acutemyeloidleukaemia.BrJHaematol1992;80:178–183.

[40] ZenzT,EichhorstB,BuschR,DenzelT,HabeS,WinklerD, etal.TP53MutationandSurvivalinChronicLymphocytic Leukemia.JClinOncol2010;28:4473–4479.http://dx.doi.

org/10.1200/JCO.2009.27.8762.

[41] StengelA,SchnittgerS,WeissmannS,KuzniaS,KernW, KohlmannA,etal.TP53mutationsoccurin15.7%ofALL andareassociatedwithMYC-rearrangement,low hypodiploidy,andapoorprognosis.Blood2014;124:251–

258.http://dx.doi.org/10.1182/blood-2014-02-558833.

[42] ChngWJ,Price-TroskaT,Gonzalez-PazN,VanWierS, JacobusS,BloodE,etal.ClinicalsignificanceofTP53 mutationinmyeloma.Leukemia2007;21:582–584.http://

dx.doi.org/10.1038/sj.leu.2404524.

[43] LodeL,EveillardM,TrichetV,SoussiT,WuillemeS, RichebourgS,etal.MutationsinTP53areexclusively associatedwithdel(17p)inmultiplemyeloma.

Haematologica2010;95:1973–1976.http://dx.doi.org/

10.3324/haematol.2010.023697.

[44] ZenzT,MertensD,KüppersR,DöhnerH,StilgenbauerS.

Frompathogenesistotreatmentofchroniclymphocytic

leukaemia.NatRevCancer2010;10:37–50.http://dx.doi.

org/10.1038/nrc2764.

[45] ZenzT,HäbeS,DenzelT,MohrJ,WinklerD,BühlerA,etal.

Detailedanalysisofp53pathwaydefectsinfludarabine- refractorychroniclymphocyticleukemia(CLL):dissecting thecontributionof17pdeletion,TP53mutation,p53-p21 dysfunction,andmiR34ainaprospectiveclinicaltrial.

Blood2009;114:2589–2597.http://dx.doi.org/10.1182/blood- 2009-05-224071.

[46] RossiD,CerriM,DeambrogiC,SozziE,CrestaS,RasiS, etal.TheprognosticvalueofTP53mutationsinchronic lymphocyticleukemiaisindependentofDel17p13:

Implicationsforoverallsurvivalandchemorefractoriness.

ClinCancerRes2009;15:995–1004.http://dx.doi.org/

10.1158/1078-0432.CCR-08-1630.

[47] GonzalezD,MartinezP,WadeR,HockleyS,OscierD, MatutesE,etal.MutationalstatusoftheTP53geneasa predictorofresponseandsurvivalinpatientswithchronic lymphocyticleukemia:ResultsfromtheLRFCLL4trial.J ClinOncol2011;29:2223–2229.http://dx.doi.org/10.1200/

JCO.2010.32.0838.

[48] DickerF,HerholzH,SchnittgerS,NakaoA,PattenN,WuL, etal.ThedetectionofTP53mutationsinchronic lymphocyticleukemiaindependentlypredictsrapid diseaseprogressionandishighlycorrelatedwitha complexaberrantkaryotype.Leukemia2009;23:117–124.

http://dx.doi.org/10.1038/leu.2008.274.

[49] ZenzT,VollmerD,TrbusekM,SmardovaJ,BennerA,Soussi T,etal.TP53mutationprofileinchroniclymphocytic leukemia:evidenceforadiseasespecificprofilefroma comprehensiveanalysisof268mutations.Leukemia 2010;24:2072–2079.http://dx.doi.org/10.1038/leu.2010.208.

[50] MalcikovaJ,PavlovaS,KozubikKS,PospisilovaS.TP53 mutationanalysisinclinicalpractice:Lessonsfrom chroniclymphocyticleukemia.HumMutat2014;35:

663–671.http://dx.doi.org/10.1002/humu.22508.

[51] PetitjeanA,MatheE,KatoS,IshiokaC,TavtigianS, HainautP,etal.Impactofmutantp53functional propertiesonTP53mutationpatternsandtumor phenotype:lessonsfromrecentdevelopmentsintheIARC TP53database.HumMutat2007;28:622–629.http://dx.doi.

org/10.1002/humu.20495.

[52] HamblinBTJ,DavisZ,GardinerA,OscierDG,Stevenson FK.UnmutatedIgV.Analysis1999;94:1848–1854.

[53] DamleRN,WasilT,FaisF,GhiottoF,Valettoa,AllenSL, etal.IgVgenemutationstatusandCD38expressionas novelprognosticindicatorsinchroniclymphocytic leukemia.Blood1999;94:1840–1847.

[54] CesanoA,PerbelliniO,EvensenE,ChuCC,CioffiF,PtacekJ, etal.AssociationbetweenB-cellreceptorresponsiveness anddiseaseprogressioninB-cellchroniclymphocytic leukemia:Resultsfromsinglecellnetworkprofiling studies.Haematologica2013;98:626–634.http://dx.doi.org/

10.3324/haematol.2012.071910.

[55] MalcikovaJ,StalikaE,DavisZ,PlevovaK,TrbusekM, MansouriL,etal.ThefrequencyofTP53genedefects differsbetweenchroniclymphocyticleukaemiasubgroups harbouringdistinctantigenreceptors.BrJHaematol 2014;166:621–625.http://dx.doi.org/10.1111/bjh.12893.

[56] DöhnerH,StilgenbauerS,BennerA,LeupoltE,KröberA, BullingerL,etal.GenomicAberrationsandSurvivalin ChronicLymphocyticLeukemia.NEnglJMed 2000;343:1910–1916.http://dx.doi.org/10.1056/

NEJM200012283432602.

[57] RossiD,RasiS,SpinaV,BruscagginA,MontiS,CiardulloC, etal.Integratedmutationalandcytogeneticanalysis identifiesnewprognosticsubgroupsinchronic lymphocyticleukemia.Blood2013;121:1403–1412.http://

dx.doi.org/10.1182/blood-2012-09-458265.

[58] ZenzT,GribbenJG,HallekM,DohnerH,KeatingMJ, StilgenbauerS.RiskcategoriesandrefractoryCLLinthe eraofchemoimmunotherapy.Blood2012;119:4101–4107.

http://dx.doi.org/10.1182/blood-2011-11-312421.

[59] PospisilovaS,GonzalezD,MalcikovaJ,TrbusekM,RossiD, KateraP.etal.ERICrecommendationsonTP53mutation analysisinchroniclymphocyticleukemia.Leukemia 2012;26:1458–1461.http://dx.doi.org/10.1038/leu.2012.25.

[60] HallekM,ChesonBD,CatovskyD,Caligaris-CappioF, DighieroG,DohnerH,etal.Guidelinesforthediagnosis andtreatmentofchroniclymphocyticleukemia:areport fromtheInternationalWorkshoponChronicLymphocytic LeukemiaupdatingtheNationalCancerInstitute-Working Group1996guidelines.Blood2008;111:5446–5456.http://

dx.doi.org/10.1182/blood-2007-06-093906.

[61] OscierD,DeardenC,EremE,FeganC,FollowsG,HillmenP, etal.Guidelinesonthediagnosis,investigationand managementofchroniclymphocyticleukaemia.BrJ Haematol2012;159.http://dx.doi.org/10.1111/bjh.12067.

n/a–n/a.

[62] SilvaAL,RomãoL.Themammaliannonsense-mediated mRNAdecaypathway:Todecayornottodecay!Which playersmakethedecision?FEBSLett2009;583:499–505.

http://dx.doi.org/10.1016/j.febslet.2008.12.058.

[63] KringenP,BergamaschiA,DueEU,WangY,TagliabueE, NeslandJM,etal.Evaluationofarrayedprimerextension forTP53mutationdetectioninbreastandovarian carcinomas.Biotechniques2005;39:755–761.http://dx.doi.

org/10.2144/000112000.

[64] TõnissonN,ZernantJ,KurgA,PavelH,SlavinG,Roomere H,etal.Evaluatingthearrayedprimerextension resequencingassayofTP53tumorsuppressorgene.Proc NatlAcadSciUSA2002;99:5503–5508.http://dx.doi.org/

10.1073/pnas.082100599.

[65] MeachamF,BoffelliD,DhahbiJ,MartinDI,SingerM, PachterL.Identificationandcorrectionofsystematicerror inhigh-throughputsequencedata.BMCBioinformatics 2011;12:451.http://dx.doi.org/10.1186/1471-2105-12-451.

[66] FlahertyP,NatsoulisG,MuralidharanO,WintersM, BuenrostroJ,BellJ,etal.Ultrasensitivedetectionofrare mutationsusingnext-generationtargetedresequencing.

NucleicAcidsRes2012;40:1–12.http://dx.doi.org/10.1093/

nar/gkr861.

[67] RossiD,KhiabanianH,SpinaV,CiardulloC,BruscagginA, FamàR,etal.ClinicalimpactofsmallTP53mutated subclonesinchroniclymphocyticleukemia.Blood 2014;123:2139–2147.http://dx.doi.org/10.1182/blood-2013- 11-539726.

[68] SteghAH.Targetingthep53signalingpathwayincancer therapy-thepromises,challengesandperils.ExpertOpin TherTargets2012;16:67–83.http://dx.doi.org/10.1517/

14728222.2011.643299.

[69] ShangaryS,WangS.Small-moleculeinhibitorsofthe MDM2-p53protein-proteininteractiontoreactivatep53 function:anovelapproachforcancertherapy.AnnuRev PharmacolToxicol2009;49:223–241.http://dx.doi.org/

10.1146/annurev.pharmtox.48.113006.094723.

[70] SelivanovaG.Therapeutictargetingofp53bysmall molecules.SeminCancerBiol2010;20:46–56.http://dx.doi.

org/10.1016/j.semcancer.2010.02.006.

[71] LaneDP,BrownCJ,VermaC,CheokCF.Newinsightsinto p53basedtherapy.DiscovMed2011;12:107–117.

[72] VassilevLT,VuBT,GravesB,CarvajalD,PodlaskiF,Filipovic Z,etal.Invivoactivationofthep53pathwaybysmall- moleculeantagonistsofMDM2.Science2004;303:844–848.

http://dx.doi.org/10.1126/science.1092472.

[73] IssaevaN,BozkoP,EngeM,ProtopopovaM,VerhoefLGGC, MasucciM,etal.SmallmoleculeRITAbindstop53,blocks p53-HDM-2interactionandactivatesp53functionin

tumors.NatMed2004;10:1321–1328.http://dx.doi.org/10.

1038/nm1146.

[74] WimanKG.Pharmacologicalreactivationofmutantp53:

fromproteinstructuretothecancerpatient.Oncogene 2010;29:4245–4252.http://dx.doi.org/10.1038/onc.2010.188.

[75]SeemannS,MauriciD,OlivierM,CarondeFromentelC, HainautP.ThetumorsuppressorgeneTP53:implicationsfor cancermanagementandtherapy.CritRevClinLabSci2004;

41:551–583.http://dx.doi.org/10.1080/10408360490504952.

[76] SahaMN,MicallefJ,QiuL,ChangH.Pharmacological activationofthep53pathwayinhaematological malignancies.JClinPathol2010;63:204–209.http://dx.doi.

org/10.1136/jcp.2009.070961.

[77] TovarC,RosinskiJ,FilipovicZ,HigginsB,KolinskyK, HiltonH,etal.Small-moleculeMDM2antagonistsreveal aberrantp53signalingincancer:implicationsfortherapy.

ProcNatlAcadSciUSA2006;103:1888–1893.http://dx.doi.

org/10.1073/pnas.0507493103.

[78] GuL,ZhuN,FindleyHW,ZhouM.MDM2antagonist nutlin-3isapotentinducerofapoptosisinpediatricacute lymphoblasticleukemiacellswithwild-typep53and overexpressionofMDM2.Leukemia2008;22:730–739.

http://dx.doi.org/10.1038/leu.2008.11.

[79] KojimaK,KonoplevaM,SamudioIJ,ShikamiM,Cabreira- HansenM,McQueenT,etal.MDM2antagonistsinduce p53-dependentapoptosisinAML:implicationsfor leukemiatherapy.Blood2005;106:3150–3159.http://dx.doi.

org/10.1182/blood-2005-02-0553.

[80] LongJ,ParkinB,OuilletteP,BixbyD,SheddenK,ErbaH, etal.Multipledistinctmolecularmechanismsinfluence sensitivityandresistancetoMDM2inhibitorsinadult acutemyelogenousleukemia.Blood2010;116:71–80.http://

dx.doi.org/10.1182/blood-2010-01-261628.

[81] SahaMN,JiangH,ChangH.Molecularmechanismsof nutlin-inducedapoptosisinmultiplemyeloma:evidence forp53-transcription-dependentand-independent pathways.CancerBiolTher2010;10:567–578.

[82] BoMD,SecchieroP,DeganM,MarconiD,BombenR, PozzatoG,etal.MDM4(MDMX)isoverexpressedin chroniclymphocyticleukaemia(CLL)andmarksasubset ofp53wild-typeCLLwithapoorcytotoxicresponseto Nutlin-3.BrJHaematol2010;150:237–239.http://dx.doi.org/

10.1111/j.1365-2141.2010.08185.x.

[83]ThompsonT,AndreeffM,StudzinskiGP,VassilevLT.1,25- dihydroxyvitaminD3enhancestheapoptoticactivityof MDM2antagonistnutlin-3ainacutemyeloidleukemiacells expressingwild-typep53.MolCancerTher2010;9:1158–

1168.http://dx.doi.org/10.1158/1535-7163.MCT-09-1036.

[84] Vilas-ZornozaA,AgirreX,Martín-PalancoV,Martín- SuberoJI,SanJosé-EnerizE,GarateL,etal.Frequentand simultaneousepigeneticinactivationofTP53pathway genesinacutelymphoblasticleukemia.PLoSOne2011;6:

e17012.http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0017012.

[85] PetersonLF,MitrikeskaE,GiannolaD,LuiY,SunH,Bixby D,etal.p53stabilizationinducesapoptosisinchronic myeloidleukemiablastcrisiscells.Leukemia2011;25:

761–769.http://dx.doi.org/10.1038/leu.2011.7.

[86] KurosuT,WuN,OshikawaG,KagechikaH,MiuraO.

Enhancementofimatinib-inducedapoptosisofBCR/ABL- expressingcellsbynutlin-3throughsynergisticactivation ofthemitochondrialapoptoticpathway.Apoptosis 2010;15:608–620.http://dx.doi.org/10.1007/s10495-010- 0457-0.

[87] LuK,WangX.Therapeuticadvancementofchronic lymphocyticleukemia.JHematolOncol2012;5:55.http://

dx.doi.org/10.1186/1756-8722-5-55.

[88] SecchieroP,diIasioMG,MelloniE,VoltanR,CeleghiniC, TiribelliM,etal.Theexpressionlevelsofthepro-apoptotic XAF-1genemodulatethecytotoxicresponsetoNutlin-3in

Bchroniclymphocyticleukemia.Leukemia2010;24:

480–483.http://dx.doi.org/10.1038/leu.2009.215.

[89] ZauliG,diIasioMG,SecchieroP,DalBoM,MarconiD, BombenR,etal.ExposureofBcellchroniclymphocytic leukemia(B-CLL)cellstonutlin-3inducesacharacteristic geneexpressionprofile,whichcorrelateswithnutlin-3- mediatedcytotoxicity.CurrCancerDrugTargets2009;9:

510–518.

[90] ZauliG,VoltanR,BoscoR,MelloniE,MarmiroliS,Rigolin GM,etal.DasatinibplusNutlin-3showssynergistic antileukemicactivityinbothp53wild-typeandp53 mutatedBchroniclymphocyticleukemiasbyinhibiting theAktpathway.ClinCancerRes2011;17:762–770.http://

dx.doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-10-2572.

[91] StühmerT,ChatterjeeM,HildebrandtM,HerrmannP, GollaschH,GereckeC,etal.Nongenotoxicactivationof thep53pathwayasatherapeuticstrategyformultiple myeloma.Blood2005;106:3609–3617.http://dx.doi.org/

10.1182/blood-2005-04-1489.

[92] OoiMG,HaydenPJ,KotoulaV,McMillinDW,Charalambous E,DaskalakiE,etal.InteractionsoftheHdm2/p53and proteasomepathwaysmayenhancetheantitumoractivity ofbortezomib.ClinCancerRes2009;15:7153–7160.http://dx.

doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-09-1071.

[93] SahaMN,JiangH,MukaiA,ChangH.RITAinhibits multiplemyelomacellgrowththroughinductionofp53- mediatedcaspase-dependentapoptosisand

synergisticallyenhancesnutlin-inducedcytotoxic responses.MolCancerTher2010;9:3041–3051.http://dx.

doi.org/10.1158/1535-7163.MCT-10-0471.

[94] KrajewskiM,OzdowyP,D'SilvaL,RothweilerU,HolakTA.

NMRindicatesthatthesmallmoleculeRITAdoesnot blockp53-MDM2bindinginvitro.NatMed2005;11:1135–

1136.http://dx.doi.org/10.1038/nm1105-1135.authorreply 1136-7.

[95] SahaMN,JiangH,YangY,ZhuX,WangX,SchimmerAD, etal.Targetingp53viaJNKpathway:anovelroleofRITAfor apoptoticsignalinginmultiplemyeloma.PLoSOne2012;7:

e30215.http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0030215.

[96] BykovVJN,IssaevaN,ShilovA,HultcrantzM,PugachevaE, ChumakovP,etal.Restorationofthetumorsuppressor functiontomutantp53byalow-molecular-weight compound.NatMed2002;8:282–288.http://dx.doi.org/

10.1038/nm0302-282.

[97] NahiH,MerupM,LehmannS,BengtzenS,MöllgårdL, SelivanovaG,etal.PRIMA-1inducesapoptosisinacute myeloidleukaemiacellswithp53genedeletion.BrJ Haematol2006;132:230–236.http://dx.doi.org/10.1111/

j.1365-2141.2005.05851.x.

[98] LambertJMR,GorzovP,VeprintsevDB,SöderqvistM, SegerbäckD,BergmanJ,etal.PRIMA-1reactivatesmutant p53bycovalentbindingtothecoredomain.CancerCell 2009;15:376–388.http://dx.doi.org/10.1016/j.ccr.2009.03.003.

[99] LehmannS,BykovVJN,AliD,AndrénO,CherifH,TidefeltU, etal.Targetingp53invivo:afirst-in-humanstudywithp53- targetingcompoundAPR-246inrefractoryhematologic malignanciesandprostatecancer.JClinOncol2012;30:3633–

3639.http://dx.doi.org/10.1200/JCO.2011.40.7783.

[100]NahiH,LehmannS,MollgardL,BengtzenS,SelivanovaG, WimanKG,etal.EffectsofPRIMA-1onchronic

lymphocyticleukaemiacellswithandwithout

hemizygousp53deletion.BrJHaematol2004;127:285–291.

http://dx.doi.org/10.1111/j.1365-2141.2004.05210.x.

[101]AliD,Jönsson-VidesäterK,DenebergS,BengtzénS,Nahi H,PaulC,etal.APR-246exhibitsanti-leukemicactivity andsynergismwithconventionalchemotherapeutic drugsinacutemyeloidleukemiacells.EurJHaematol 2011;86:206–215.http://dx.doi.org/10.1111/j.1600-0609.

2010.01557.x.

[102]SahaMN,JiangH,Mei-HsiC,ChangH.p53-independent anti-myelomaactivityofPrima-1met.ASHAnnuMeet AbstrBloodBlood2011;118:1826.

[103]BykovVJN,IssaevaN,ZacheN,ShilovA,HultcrantzM, BergmanJ,etal.Reactivationofmutantp53andinduction ofapoptosisinhumantumorcellsbymaleimideanalogs.J BiolChem2005;280:30384–30391.http://dx.doi.org/10.1074/

jbc.M501664200.

[104]SahaMN,JiangH,ChangH.AnovelsmallmoleculeMIRA- 1inducescytotoxicityinmultiplemyelomacells harbouringwildtypeormutantp53.itle.ModPathol 2012;25:1534.

[105]HallekM,FischerK,Fingerle-RowsonG,FinkAM,BuschR, MayerJ,etal.Additionofrituximabtofludarabineand cyclophosphamideinpatientswithchroniclymphocytic leukaemia:arandomised,open-label,phase3trial.Lancet (LondonEngland)2010;376:1164–1174.http://dx.doi.org/

10.1016/S0140-6736(10)61381-5.

[106]HillmenP,SkotnickiAB,RobakT,JaksicB,DmoszynskaA, WuJ,etal.AlemtuzumabComparedWithChlorambucil AsFirst-LineTherapyforChronicLymphocyticLeukemia.

JClinOncol2007;25:5616–5623.http://dx.doi.org/10.1200/

JCO.2007.12.9098.

[107]EichhorstB,RobakT,MontserratE,GhiaP,HillmenP, HallekM,etal.Chroniclymphocyticleukaemia:ESMO ClinicalPracticeGuidelinesfordiagnosis,treatmentand follow-up.AnnOncol2015;26:v78–v84.http://dx.doi.org/

10.1093/annonc/mdv303.

[108]DregerP,ScheteligJ,AndersenN,CorradiniP,GelderM Van,GribbenJ,etal.PerspectivesManaginghigh-riskCLL duringtransitiontoanewtreatmentera:stemcell transplantationornovelagents?Blood2015;124:3841–

3849.http://dx.doi.org/10.1182/blood-2014-07-586826.

partners.

[109]PanZ,ScheerensH,LiS-J,SchultzBE,SprengelerPA, BurrillLC,etal.DiscoveryofSelectiveIrreversible InhibitorsforBruton'sTyrosineKinase.ChemMedChem 2007;2:58–61.http://dx.doi.org/10.1002/cmdc.200600221.

[110]AdvaniRH,BuggyJJ,SharmanJP,SmithSM,BoydTE,Grant B,etal.BrutonTyrosineKinaseInhibitorIbrutinib(PCI- 32765)HasSignificantActivityinPatientsWithRelapsed/

RefractoryB-CellMalignancies.JClinOncol2013;31:88–94.

http://dx.doi.org/10.1200/JCO.2012.42.7906.

[111]ByrdJC,FurmanRR,CoutreSE,FlinnIW,BurgerJA,Blum KA,etal.TargetingBTKwithIbrutinibinRelapsedChronic LymphocyticLeukemia.NEnglJMed2013;369:32–42.

http://dx.doi.org/10.1056/NEJMoa1215637.

[112]O’BrienS,FurmanRR,CoutreSE,SharmanJP,BurgerJA, BlumKA,etal.Ibrutinibasinitialtherapyforelderly patientswithchroniclymphocyticleukaemiaorsmall lymphocyticlymphoma:anopen-label,multicentre, phase1b/2trial.LancetOncol2014;15:48–58.http://dx.doi.

org/10.1016/S1470-2045(13)70513-8.

[113] ByrdJC,BrownJR,O’BrienS,BarrientosJC,KayNE,Reddy NM,etal.IbrutinibversusOfatumumabinPreviously TreatedChronicLymphoidLeukemia.NEnglJMed 2014;371:213–223.http://dx.doi.org/10.1056/NEJMoa1400376.

[114]O’BrienS,JonesJA,CoutreS,MatoAR,HillmenP.Efficacy andSafetyofIbrutinibinPatientswithRelapsedor RefractoryChronicLymphocyticLeukemiaorSmall LymphocyticLeukemiawith17pDeletion:Resultsfrom

thePhaseIIRESONATETM-17Trial.ASHAnnuMeetAbstr BloodBlood2014;124:327.

[115]LannuttiBJ,MeadowsSa,HermanSEM,KashishianA, SteinerB,JohnsonAJ,etal.CAL-101,ap110deltaselective phosphatidylinositol-3-kinaseinhibitorforthetreatment ofB-cellmalignancies,inhibitsPI3Ksignalingandcellular viability.Blood2011;117:591–594.http://dx.doi.org/10.1182/

blood-2010-03-275305.

[116]EngelmanJA,LuoJ,CantleyLC.Theevolutionof phosphatidylinositol3-kinasesasregulatorsofgrowth andmetabolism.NatRevGenet2006;7:606–619.http://dx.

doi.org/10.1038/nrg1879.

[117]FurmanRR,SharmanJP,CoutreSE,ChesonBD,PagelJM, HillmenP,etal.Idelalisibandrituximabinrelapsed chroniclymphocyticleukemia.NEnglJMed2014;370:997–

1007.http://dx.doi.org/10.1056/NEJMoa1315226.

[118]O’BrienSM,LamannaN,KippsTJ,FlinnI,ZelenetzAD, BurgerJA,etal.Aphase2studyofidelalisibplusrituximab intreatment-naiveolderpatientswithchronic

lymphocyticleukemia.Blood2015.http://dx.doi.org/

10.1182/blood-2015-03-630947.

[119]HillmenP,SkotnickiAB,RobakT,JaksicB,DmoszynskaA, WuJ,etal.Alemtuzumabcomparedwithchlorambucilas first-linetherapyforchroniclymphocyticleukemia.JClin Oncol2007;25:5616–5623.http://dx.doi.org/10.1182/blood- 2015-03-630947.

[120] LeibaM,JakubikovaJ,KlippelS,MitsiadesCS,HideshimaT, TaiY-T,etal.Halofuginoneinhibitsmultiplemyeloma growthinvitroandinvivoandenhancescytotoxicityof conventionalandnovelagents.BrJHaematol2012;157:718–

731.http://dx.doi.org/10.1111/j.1365-2141.2012.09120.x.

[121]KojimaK,BurksJK,ArtsJ,AndreeffM.Thenovel tryptaminederivativeJNJ-26854165induceswild-typep53- andE2F1-mediatedapoptosisinacutemyeloidand lymphoidleukemias.MolCancerTher2010;9:2545–2557.

http://dx.doi.org/10.1158/1535-7163.MCT-10-0337.

[122]BugginsAGS,PepperCJ.TheroleofBcl-2familyproteinsin chroniclymphocyticleukaemia.LeukRes2010;34:837–842.

http://dx.doi.org/10.1016/j.leukres.2010.03.011.

[123]O’BrienSM,ClaxtonDF,CrumpM,FaderlS,KippsT, KeatingMJ,etal.PhaseIstudyofobatoclaxmesylate (GX15-070),asmallmoleculepan-Bcl-2familyantagonist, inpatientswithadvancedchroniclymphocyticleukemia.

Blood2009;113:299–305.http://dx.doi.org/10.1182/blood- 2008-02-137943.

[124]RobertsAW,SeymourJF,BrownJR,WierdaWG,KippsTJ, KhawSL,etal.Substantialsusceptibilityofchronic lymphocyticleukemiatoBCL2inhibition:Resultsofa phaseIstudyofnavitoclaxinpatientswithrelapsedor refractorydisease.JClinOncol2012;30:488–496.http://dx.

doi.org/10.1200/JCO.2011.34.7898.

[125]AndersonMA,TamCC,SeymourJF,BellA,Westerman DA,JunejaS,etal.SelectiveBcl-2InhibitionWithABT-199 IsHighlyActiveAgainstChronicLymphocyticLeukemia (CLL)IrrespectiveOfTP53MutationOrDysfunction.ASH AnnuMeetAbstrBloodBlood2013;122:1304.

[126]WoyachJA,LozanskiG,RuppertAS,LozanskiA,BlumKA, JonesJA,etal.Outcomeofpatientswithrelapsedor refractorychroniclymphocyticleukemiatreatedwith flavopiridol:impactofgeneticfeatures.Leukemia 2012;26:1442–1444.http://dx.doi.org/10.1038/leu.2011.375.