Genetyka molekularna i genomika Prokaryota

58  Download (0)

Full text

(1)

Prokaryota

Genetyka molekularna i genomika

(2)

Prokaryota – nie są jedną grupą

Carl Woese (1928-2012)

(3)

Genomy bakterii i archeonów

Od 0,5 (mykoplazmy) do ~ 5 Mb

Wyjątkowo 9 Mb (Bradyrhizobium japonicum) – 13 Mb (Sorangium cellulosum)

archeony z reguły 1,5-2,5 Mb

Gęste upakowanie genów (~1 gen/kb)

Krótkie obszary międzygenowe i regulatorowe

Tylko sporadycznie występują introny

Kodowane białka krótsze, niż u Eukaryota

Tworzy z białkami upakowaną strukturę nukleoidu

(4)

Figure 8.6 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

Gęste upakowanie genomu E. coli

(5)

Gen prokariotyczny

Introny nieliczne, w mRNA praktycznie niespotykane

Łatwo zidentyfikować gen w sekwencji - otwarta ramka odczytu (ORF) od ATG do pierwszego STOP

(6)

Figure 8.1 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

Nukleoid bakterii

(7)

Figure 8.3 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

Upakowanie DNA

(8)

Organizacja genomu

Typowa – pojedynczy “chromosom” kolisty

Możliwe liczne warianty

Więcej cząsteczek kolistych

Cząsteczki liniowe

(9)

Chromosomy i plazmidy

Plazmidy mogą być koliste lub liniowe

Z reguły mniejsze od chromosomów, ale mogą być bardzo duże (megaplazmidy)

Plazmidy zwykle są opcjonalne, mogą też występować u wielu gatunków

Rozróżnienie – chromosomy zawierają geny metabolizmu podstawowego, niezbędne do życia, plazmidy – nie

chromidy - właściwości pośrednie

Figure 8.5 Genomes 3 (© Garland Science

2007)

(10)

Ewolucyjna zmienność Prokaryota

Przy podobnej liczbie genów ogromna różnorodność zestawu genów

Duże różnice między szczepami

np. E. coli O157:H7 vs. E. coli K12 - ~1300 genów w O nie w K i ~500 w K nie w O(!)

Częsty poziomy transfer genów (do kilkunastu procent genomu), nawet między odległymi gatunkami

Problem definicji gatunku

(11)

Chl Mt

Bacteria Eukarya Archaea

Z G R

P S

Horyzontalny transfer genów

(12)

Genomy bakterii są dynamiczne

Szczepy bakterii zaliczane do tego samego gatunku znacząco różnią się zawartością genów

Genom rdzeniowy (core genome) – wspólny dla wszystkich szczepów

Pangenom – zbiór wszystkich genów (nie występują jednocześnie)

(13)

Genom i pangenom

(14)

Genom, pangenom…

(15)

Co to jest Escherichia coli ?

Dla 61 zsekwencjonowanych szczepów:

W sumie 4157 do 5315 genów w genomie szczepu

Genom rdzeniowy – 933 geny

Reszta – geny “pomocnicze” wybrane spośród ~15 000 genów

Cały pangenom: ~ 16 000 genów

Zhaxybayeva & Doolittle (2011) Curr Biology 21(7): R242-R246

(16)

Mechanizmy HGT u bakterii

Transformacja

poprzez DNA

elektroporacja przez wyładowania atmosferyczne?

Koniugacja

z udziałem pili płciowych

Transdukcja

z udziałem fagów

GTA

Gene Transfer Agents – wirusopodobne cząstki wytwarzane przez α- proteobakterie

Nanorurki

(17)

Nanorurki u bakterii

Dubey & Ben-Yehuda (2011) Intercellular nanotubes mediate bacterial communication. Cell 144(4):590-600.

(18)

Nanorurki – pomiędzy gatunkami

Dubey & Ben-Yehuda (2011) Intercellular nanotubes mediate bacterial communication. Cell 144(4):590-600.

(19)

Poziomy przepływ genów - bakterie

U Bacteria i Archaea poziomy przepływ informacji genetycznej jest powszechny

plazmidy i ruchome elementy genetyczne

dowolne fragmenty DNA

Równowaga pomiędzy naturalnymi barierami (np. system restrykcji- modyfikacji) a systemami ułatwiającymi wymianę DNA

(20)

Adaptacje dzięki HGT

Salinibacter (Bacteria) – geny umożliwiające przeżycie w

warunkach wysokiego stężenia soli:

wyspa genomowa: transpozazy + geny transporterów jonów i

aminokwasów

rodopsyny – wykorzystanie światła do transportu protonów i jonów

Uzyskane w HGT od Archaea i

innych Bacteria Zhaxybayeva & Doolittle (2011) Curr Biology 21(7):

R242-R246

(21)

Adaptacje dzięki HGT

Bacteroides plebeius – bakteria w

przewodzie pokarmowym człowieka

Niektóre szczepy zdolne do rozkładania polisacharydów

pochodzących z krasnorostów

B. plebeius uzyskał geny

umożliwiające rozkład tych

polisacharydów w HGT od bakterii morskich

głównie szczepy izolowane od mieszkańców Japonii, brak w

szczepach od mieszkańców USA

Zhaxybayeva & Doolittle (2011) Curr Biology 21(7):

R242-R246

(22)

Genomika porównawcza bakterii sposobem poznania ich fizjologii

Bakterie mają genomy podobnej wielkości, mieszczące 2000-6000 genów

Około połowy genomu tworzą rodziny podobnych genów

powstałych przez powielenie (duplikację) – tzw. rodziny paralogów

To, które geny są powielone świadczy o kierunku specjalizacji ewolucyjnej bakterii

(23)

Genomika porównawcza bakterii sposobem poznania ich fizjologii

H. influenzae – heterotrof pasożytniczy – powielone geny kodujące białka rozkładające różne związki organiczne

Methanococcus janaschii – chemoautotrof – powielone geny kodujące enzymy szlaków biosyntetycznych

Pseudomonas aeruginosa – patogen oporny na wiele leków i

szybko dostosowujący się do zmian środowiska – powielone geny kodujące białka usuwające antybiotyki, rozkładające substancje

organiczne, umożliwiające zagnieżdżanie się w powierzchniach.

(24)

Droga od DNA do białka

(25)

Centralna hipoteza (“dogmat”)

RNA może też ulegać replikacji

RNA może też być matrycą dla syntezy DNA

Przepływ informacji od RNA do białka pozostaje zawsze

jednokierunkowy

DNA

RNA

BIAŁKO

(26)

Ekspresja genów prokariotycznych

dominuje regulacja na poziomie transkrypcji

policistronowe jednostki

transkrypcyjne o wspólnej regulacji transkrypcyjnej – operony

mRNA szybko degradowane,

translacja zachodzi zasadniczo równocześnie z transkrypcją

(27)

Elementy systemów regulacji

Elementy cis

Znajdują się w obrębie tej samej cząsteczki, co element podlegający regulacji

Elementy cis w obrębie DNA

np. promotory, operatory, enhancery

Elementy cis w obrębie RNA

sekwencje wiążące białka regulujące translację, splicing, degradację itp.

(28)

Elementy systemów regulacji

Elementy trans

Odrębne cząsteczki oddziałujące z elementami cis i modulujące ekspresję

Białka regulujące transkrypcję (czynniki transkrypcyjne), aktywatory, represory itp.

Białka regulujące inne etapy ekspresji (aktywatory/represory translacji, splicingu itp.)

RNA regulatorowe (siRNA, miRNA itp.)

(29)

Podstawy regulacji genu

Regulacja pozytywna

czynnik trans jest aktywatorem – zwiększa ekspresję

Regulacja negatywna

czynnik trans jest represorem – osłabia ekspresję

(30)

Podstawy regulacji genu

Regulacja indukowalna

Sygnał zwiększa (indukuje) ekspresję

Regulacja reprymowalna

Sygnał zmniejsza (reprymuje) ekspresję

Możliwe są różne układy, np. regulacja negatywna indukowalna

Nie należy mylić pojęć: pozytywna/negatywna dotyczy aktywności

czynnika trans a indukowalna/reprymowalna – odpowiedzi na sygnał

(31)

Operony

Typowy dla bakteri i archeonów system ekspresji

Policistronowy transkrypt –

wspólna ekspresja wielu genów z jednego promotora

Przeważnie geny związane funkcją, ale są wyjątki

Figure 8.8 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

(32)

Regulacja

Polimeraza stosunkowo prosta, proste sekwencje promotorowe

Rdzeń katalityczny wspólny, kilka podejednostek sigma o różnej specyficzności odpowiadających za rozpoznanie promotorów

σ70 (RpoD) – główny czynnik sigma ("housekeeping”) – większość genów

σ54 (RpoN) – głód azotowy

σ38 (RpoS) – głód/faza stacjonarna

σ32 (RpoH) – szok cieplny

σ28 (RpoF) – wić

Aktywatory i represory wpływają na wiązanie polimerazy z DNA

(33)

Przykład – operon lac

W. S Klug, M.R Cummings “Concepts of Genetics” 8th edition, Prentice Hall, 2005

(34)

Operon lac – regulacja przez CAP

W. S Klug, M.R Cummings “Concepts of Genetics” 8th edition, Prentice Hall, 2005

(35)

Operon lac

Regulacja na poziomie inicjacji transkrypcji

Negatywna indukowalna – przez laktozę/represor lacI

Pozytywna – przez glukozę i cAMP/białko CAP

Białko to reguluje szereg operonów związanych z wykorzystywaniem źródeł węgla - regulon

(36)

Terminacja transkrypcji

Podczas transkrypcji cały czas konkurencja między kontynuowaniem a dysocjacją polimerazy

Zależy od związanych białek, struktury transkryptu

Terminatory

samodzielne

Rho zależne

(37)

Terminacja transkrypcji

Figure 12.8 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

samodzielne (rho-niezależne) rho-zależne

(38)

Regulacja na poziomie terminacji - antyterminacja

Antyterminacja

Regulacja pozytywna, czynnik trans wiążąc się z DNA znosi działanie terminatora

Typowy przykład – geny kaskady litycznej faga λ

Najwcześniejsze

Wczesne-opóźnione

Genomes 3 (© Garland Science 2007)

(39)

Regulacja na poziomie terminacji - atenuacja

Fakultatywna sekwencja terminatora na początku transkryptu, zależnie od warunków

Kinetyka translacji – dostępność naładowanego tRNA

Wiązanie specyficznych białek

Wiązanie ligandów drobnocząsteczkowych – ryboprzełączniki (niektóre)

(40)

Atenuacja – operon trp E. coli

Zależnie od dostępności załadowanego tRNATrp sekwencja lidera mRNA

przyjmuje różne konformacje

tRNATrp dostępny tRNATrp niedostępny

W. S Klug, M.R Cummings “Concepts of Genetics”

8th edition, Prentice Hall, 2005

(41)

Operon trp u Bacillus subtilis

Białko TRAP wiąże naładowany tRNATrp

Kompleks TRAP z tRNATrp wiąże mRNA

Dodatkowo białko AT (anty-

TRAP) wiąże TRAP gdy bardzo mało naładowanego tRNATrp

tRNATrp dostępny

W. S Klug, M.R Cummings “Concepts of Genetics” 8th edition, Prentice Hall, 2005

(42)

Ryboprzełączniki

Wiązanie związków drobnocząsteczkowych bezpośrednio z mRNA zmienia konformację, wpływając na ekspresję

Atenuacja

Dostępność miejsca wiązania rybosomu

(43)

Ryboprzełącznik TPP – operon thi E. coli

Odpowiada za biosyntezę tiaminy

SD- Shine-Dalgarno

TPP- pirofosforan tiaminy

Winkler et al. (2002) Nature 419, 952-956

(44)

Transdukcja sygnału – systemy dwuskładnikowe

Systemy umożliwiające regulację genów w odpowiedzi na czynniki zewnętrzne (transdukcja

sygnału)

Sensor– domena wiążąca ligand + domena kinazy histydynowej

(HK) – autofosforylacja w odpowiedzi na sygnał

Efektor (RR – response regulator) – fosforylowany przez aktywny

sensor (w asparaginie) reguluje transkrypcję

West & Stock (2001) . Trends Biochem. Sci., 26, 369-376

(45)

Globalne systemy regulujące - regulony

Skoordynowana regulacja działania wielu operonów

Represja kataboliczna (aktywator CAP)

zależny od poziomu glukozy poziom cAMP

Odpowiedź ścisła

brak składników odżywczych, alarmon ppGpp, interakcja z polimerazą RNA, wybór podjednostki σ38 (RpoS)

Odpowiedź SOS

uszkodzenia genomu, białko RecA – indukowana aktywność proteazy, tnie m. in. represor LexA

(46)

Życie społeczne bakterii – quorum sensing

Mechanizm wyczuwania liczebności

Ekspresja zależna od gęstości bakterii

Komórki wydzielają cząsteczki sygnałowe – autoinduktory (peptydy, związki laktonowe, pochodne S-AM)

sygnał w postaci dyfundującej niewielkiej cząsteczki (gram-)

sygnał w postaci dużej cząsteczki (gram+)

Przekroczenie progowego stężenia autoinduktorów – aktywacja systemu dwuskładnikowego, zmiana ekspresji

(47)

Quorum sensing Vibrio fischeri

Bioluminescencja tylko przy dużej gęstości

w planktonie - nie

w symbiozie z głowonogiem - tak

Produkowany przez enzym LuxI autoinduktor wiąże aktywator LuxR, co aktywuje operon lucyferazy

http://www.che.caltech.edu/groups/fha/quorum.html

(48)

Quorum sensing - biofilmy

Tworzenie biofilmu – kluczowe dla patogenezy, oporności na antybiotyki

Np. Pseudomonas aeruginosa – przewlekłe infekcje w płucach

Infekcje oportunistyczne, np. u chorych na mukowiscydozę

Fuqua & Greenberg (2002) Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, 685-695

(49)

Kod genetyczny

Trójkowy

20 aminokwasów

kodony po 3 nukleotydy: 43=64 możliwości (dwa: za mało)

Dowody: badanie mutantów insercyjnych i delecyjnych (3 kolejne insercje lub delecje przywracały funkcje)

(50)

Kod genetyczny

Nienakładający się

Dowody:

załóżmy sekwencję GTACA: jeden kodon: TAC, pozostałe: GTA i ACA

(nakładanie 2 nukleotydów). Przy danym kodonie “centralnym”, możliwe tylko 42 = 16 różnych kombinacji trzyaminokwasowych. W naturze

natomiast występują wszystkie możliwe kombinacje trzyaminokwasowe (202=400).

Pojedyncza zmiana nukleotydowa w sekwencji kodującej zmienia tylko jeden aminokwas, a nie dwa sąsiednie

(51)

Kod genetyczny

Bezprzecinkowy

Zdegenerowany

3 kodony STOP, pozostałe 61 kodonów koduje 20 aminokwasów

(52)

Kod genetyczny

(53)

Uniwersalność kodu

Kod genetyczny jest zasadniczo taki sam u wszystkich organizmów na Ziemi

Nieznaczne odstępstwa przez ewolujcję pojedynczych tRNA

kody organellarne (np. UGA - Trp a nie stop w mitochondriach)

niektore orzęski

nieliczne grzyby (CUG Ser a nie Leu u Candida)

(54)

Regularności w kodzie

Trzecia pozycja kodonu najmniej znacząca

(np. UCx – Ser)

ale nie zawsze nieznacząca (mp. UGG – Trp, UGA – STOP)

Aminokwasy o podobnych właściwościach często z podobnymi kodonami

Np.

AAA, AAG: lizyna; AGA, AGG: arginina

UCx: seryna; ACx: treonina

(55)

Parowanie wobble

W 3 pozycji kodonu (1 antykodonu) dozwolone parowanie G-U oraz I-U/A/A (I – inozyna)

tzw. zasada tolerancji Cricka

(56)

Translacja

(57)

Nobel 2009 - chemia

(58)

Figure

Updating...

References

Related subjects :