OZNACZENIE JAKOŚCIOWE I ILOŚCIOWE
w HPLC
prof. Marian Kamiński
Wydział Chemiczny , Politechnika Gdańska
CEL
Celem rozdzielania mieszaniny substancji na poszczególne składniki, bądź rozdzielenia tylko wybranych substancji od innych, jest najczęściej ich ilościowe oznaczenie, tj. ustalenie zawartości lub masy w analizowanej próbce.
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest wykorzystywana do oznaczenia zawartości składników głównych występujących w próbce na poziomie stężeń w zakresie od 1 do 100 %,
składników pośrednich od 0.001 do 1%
składników śladowych substancji obecnych w analizowanej próbce poniżej 0.001%
OZNACZANIE JAKOŚCIOWE
Analiza jakościowa polega na identyfikacji pików odpowiadających poszczególnym składnikom
próbki.
Kurs HPLC 2007
OZNACZANIE JAKOŚCIOWE cd.
Zasady i prawidłowości:
- wpływ na retencję składu fazy ruchomej
- wpływ stosowanych warunków – temperatura, pH - ilość składników próbki ????
- czystość aparatury i eluentów
OZNACZANIE JAKOŚCIOWE
OZNACZANIE JAKOŚCIOWE cd.
Bezpośrednia identyfikacja:
UV-VIS UV-DAD
FLUORESCENCJA
SPEKTROMETR MAS – LC-MS
Kurs HPLC 2007
Oznaczenie ilościowe w HPLC
polega na ustaleniu zależności pomiędzy
sygnałem detektora, czyli powierzchnią pod pikiem lub ewentualnie wysokością piku, a stężeniem lub masą składnika, którego
zawartość zamierzamy oznaczyć.
WARUNEK OZNACZENIA ILOŚCIOWEGO:
1. rozdzielenie związków do podstawy
2. POWIERZCHNIA CZY WYSKOŚĆ ?
WARUNEK OZNACZENIA ILOŚCIOWEGO:
3. Zawsze dokonuje się dla tej samej (wybranej) długości fali
Metody oznaczania ilościowego:
z punktu
metoda wzorca zewnętrznego (metoda krzywej kalibracyjnej),
metoda wzorca wewnętrznego,
metoda dodatku wzorca (metoda fortyfikacji)
metoda prostej normalizacji lub normalizacji ze
współczynnikami korekcyjnymi
Metoda tzw. z punktu
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0 1 2 3 4 5
Stężenie analitu [mg/mL]
Powierzchnia/wysokość piku
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0 1 2 3 4 5
Stężenie analitu [mg/mL]
Powierzchnia/wysokość piku
Z dwóch punktów ?
Metoda wzorca zewnętrznego metoda krzywej kalibracyjnej external standard
Istotą metody wzorca zewnętrznego jest
wyznaczenie zależności pomiędzy powierzchnią (wysokością) piku dla każdej z oznaczanych
substancji i ich stężeniem lub masą.
Metoda wzorca zewnętrznego metoda krzywej kalibracyjnej external standard
W tym celu przygotowuje się roztwory kalibracyjne, tzn. roztwory
substancji oznaczanej albo mieszaniny analizowanych substancji w kilku różnych stężeniach . . . .
Metoda wzorca zewnętrznego metoda krzywej kalibracyjnej external standard
W tym celu przygotowuje się roztwory kalibracyjne, tzn. roztwory
substancji oznaczanej albo mieszaniny analizowanych substancji w kilku różnych stężeniach i każdy z przygotowanych roztworów dozowany jest do kolumny chromatograficznej .
Metoda wzorca zewnętrznego metoda krzywej kalibracyjnej external standard
. . . Na podstawie powierzchni lub wysokości pików, na uzyskanych chromatogramach wyznacza się przebieg krzywej kalibracyjnej bądź oblicza się wartości współczynników w równaniu kalibracyjnym dla każdej z oznaczanych substancji.
powierzchnia piku y = 10,2x - 0,4
R2 = 0,9989
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0 1 2 3 4 5
Stężenie analitu [mg/mL]
Powierzchnia/wysokość piku
Metoda wzorca zewnętrznego metoda krzywej kalibracyjnej external standard
Następnie dozowane do kolumny i rozdzielane są próbki, w których oznaczona ma być zawartość wybranych substancji.
Metoda wzorca zewnętrznego metoda krzywej kalibracyjnej external standard
Uzyskane powierzchnie pików substancji oznaczanych w
nieznanej próbce umożliwią oznaczenie ich zawartości, tj.
stężenia (masy).
2.5 5 7.5 10
0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 450000
powierzchnia piku y = 10,2x - 0,4
R2 = 0,9989
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0 1 2 3 4 5
Stężenie analitu [mg/mL]
Powierzchnia/wysokość piku Cx
Warunki poprawnego stosowania metody wzorca zewnętrznego
zarówno roztwory wzorcowe, jak i analizowane próbki muszą być rozdzielane ("chromatografowane") w
tych samych warunkach temperatury, objętościowego natężenie przepływu eluentu, typu i wymiarów
kolumny chromatograficznej, z reguły tej samej kolumny, składu eluentu oraz takiego samego programu elucji.
UWAGA !
Ekstrapolacja przebiegu krzywej kalibracyjnej poza zakres wykonanej kalibracji, może być źródłem niedokładnych wyników oznaczeń ze względu na
nieliniowy przebieg odpowiedzi detektora !
powierzchnia piku
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0 1 2 3 4 5
Stężenie analitu [mg/mL]
Cx
Powierzchnia/wysokość piku
Metoda wzorca wewnętrznego internal standard
Jest to metoda polegająca na dodaniu do próbki znanej ilości składnika, tzw. wzorca wewnętrznego (IST), który
jest jednak inny od substancji oznaczanych i nie może być obecny w analizowanych próbkach przed jego
dodaniem.
W celu uzyskania krzywej kalibracyjnej do kilku roztworów wzorcowych o różnych stężeniach substancji oznaczanej dodaje się najczęściej stałą i znaną ilość wzorca wewnętrznego. Na podstawie uzyskanych chromatogramów roztworów wzorcowych wykreśla się zależność stężenia analitu w funkcji stosunku powierzchni piku analitu i wzorca wewnętrznego.
y = 10,2x - 0,4 R2 = 0,9989
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0 1 2 3 4 5
Stężenie analitu [mg/mL]
Cx powierzchnia piku
Stosunek powierzchni/wysokości piku analitu i wzorca wewnętrznego
Wymagania dotyczące wzorca wewnętrznego
musi być rozdzielony od innych składników występujących w próbce
czas retencji powinien być zbliżony do czasu retencji analitu(ów)
nie występuje w próbkach pierwotnych
właściwości fizyko-chemiczne są podobne do analitu. Jest to szczególnie istotne na etapie przygotowania próbek
(oczyszczania, wzbogacania czy derywatyzacji)
powinien być możliwie wysokiej czystości
stabilny chemicznie
odpowiedź detektora dla wzorca wewnętrznego powinna być zbliżona do odpowiedzi substancji oznaczanych
Metoda wzorca wewnętrznego
ma zastosowanie szczególnie w przypadku metod
analitycznych wymagających złożonej, wieloetapowej procedury przygotowania próbki (izolacja, wzbogacanie, derywatyzacja itp.), co może powodować straty analitów
pozwala również na uniezależnienie otrzymywanych wyników od wahań ilości dozowanej próbki
w praktyce metoda ta jest też bardziej pracochłonna niż metoda krzywej kalibracyjnej
WARUNEK OZNACZENIA ILOŚCIOWEGO:
rozdzielenie związków do podstawy A JEŚLI NIE DO PODSTAWY ???
2.5 5 7.5 10
0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 450000
Metoda dodatku wzorca standard addition
Metoda ta polega na dodaniu do próbki znanych ilości substancji oznaczanych (analitów), zwykle jest to od 50
do 150% oczekiwanej zawartości oznaczanej substancji.
Po zanalizowaniu tych roztworów, na podstawie uzyskanych chromatogramów, wykreśla się krzywe kalibracyjne, tj. zależność powierzchni piku analitu w
funkcji ilości analitu dodanej do próbki .
y = 120x + 22,5 R2 = 0,9931
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Ilość analitu dodanego do próbki [mg/mL]
powierzchnia pikuPowierzchnia / wysokośc piku
Metoda dodatku wzorca c.d.
Następnie przeprowadza się graficzną
ekstrapolację krzywej kalibracyjne do punkt przecięcia z osią odciętych i odczytuje się
wartość c
xy = 120x + 22,5 R2 = 0,9931
0 10 20 30 40 50 60 70 80
-0,2 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Ilość analitu dodanego do próbki [mg/mL]
Cx
powierzchnia pikuPowierzchnia / wysokośc piku
Metoda dodatku wzorca c.d.
Innym sposobem określenia zawartości substancji oznaczanej w próbce bez dodatku wzorca jest
graficzne wyznaczenie przebiegu nowej linii kalibracyjnej typu f(x)=a
1x, o tym samym współczynniku nachylenia prostej, co krzywa
kalibracyjna.
y = 120x + 22,5 R2 = 0,9931
0 10 20 30 40 50 60 70 80
-0,2 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Ilość analitu dodanego do próbki [mg/mL]
Cx powierzchnia pikuPowierzchnia / wysokośc piku
Metoda prostej normalizacji
Metoda prostej normalizacji nie jest metodą kalibracji.
Nie stosuje się w niej odniesienia do znanej ilości wzorca.
Metoda ta umożliwia oszacowanie względnych ilości substancji np. zawartości zanieczyszczeń w
badanej próbce.
Na podstawie chromatogramu oblicza się sumaryczną powierzchnię pików, którą traktuje się jak 100% ...
A1
A3 A2
A4
A1+A2+A3+A4 = 100%
1%
51%
1%
47%
a następnie oblicza się udział powierzchni określonego piku względem sumy powierzchni wszystkich lub tylko
wybranych pików na chromatogramie.
Metoda prostej normalizacji opiera się na założeniu, że współczynniki odpowiedzi dla każdego składnika próbki są takie same, tzn. takie same stężenia różnych substancji odpowiadają takim samym powierzchniom ich pików chromatograficznych.
ALE ...
Taką charakterystyką cechuje się detektor FID stosowany w chromatografii gazowej do oznaczania
węglowodorów.
W chromatografii cieczowej metoda uproszczonej normalizacji nie ma zastosowania.
Detektory stosowane w HPLC charakteryzują się
zróżnicowaną czułością względem substancji.
Korzystne może być stosowanie metody prostej normalizacji, gdy wykorzystywany jest detektor
refraktometryczny lub detektor światła
rozproszonego. Detektory te wykazują zbliżoną odpowiedź dla różnych substancji o zbliżonej
strukturze i masie cząsteczkowej.
Metoda normalizacji ze
współczynnikami korekcyjnymi
Metoda ta polega na określeniu względnej powierzchni piku substancji badanej względem wybranych bądź wszystkich pików na chromatogramie z uwzględnieniem
współczynników korekcyjnych, uwzględniających zróżnicowaną odpowiedź detektora dla różnych
składników próbki.
Na chromatogramie mieszaniny o znanych
zawartościach substancji badanych oblicza się pola powierzchni pików, a następnie oblicza się względny udział procentowy poszczególnych substancji metodą prostej normalizacji. W dalszej kolejności oblicza się wartość współczynnika korekcyjnego dla danej
substancji korzystając z równania
Wyznaczanie współczynników korekcyjnych
) (
) (
obliczone c
znane R c
i i
fi
ci (znane) – zawartość składnika i w roztworze wzorcowym,
ci (obliczone) – udział składnika i w rozworze wzorcowym obliczony metodą prostej normalizacji
Detekcja w HPLC i TLC
Detektor chromatograficzny – przepływowy instrument analityczny o znikomej objętości naczyńka pomiarowego;
Nie istnieje dotychczas w pełni uniwersalny detektor w LC, stąd stosuje się wiele różnych;
Znaczenie bardzo dobrej dynamiki oraz liniowości odpowiedzi detektora we współczesnej HPLC;
Techniki wizualizacji w przypadku TLC oraz technika derywatyzacji post-kolumnowej w przypadku HPLC
Detektory:
UV (200-400nm)/ UV-VIS (200-800 nm) i szczególne znaczenie detektora typu DAD (diode array detector)
RID (refractive index detector)
LLSD (laser light scattering detector)
FLD (fluorescence detector)
El-D (electrochemical detector, typ amperometryczny)
CD (coductometric detector - supresja jonów eluentu)
LC-MS, LC-MS-MS (mas - spectrometry)
inne (FTIR, NMR, LC-FID, radiometryczny, polarymetryczny, pomiaru momentu dipolowego, ....)
Nowoczesna detekcja i detektory - UV-DAD, LC-MS, GC-MS -
Pojęcie absorpcji światła, prawo absorpcji światła: [- lg(I/Io)]= lg(Io/I)=ABS=k * c * l
Widmo, jakie informacje niesie widmo ?
Chromatogram detektora UV-DAD - kilkadziesiąt chromatogramów jednocześnie
Najwygodniejsze - odwzorowanie poziomicowe
Wnikliwa analiza przebiegu widma umożliwia identyfikację substancji o charakterystycznym przebiegu widma - jednocześnie - na podstawie retencji i cech widma
Problem – widmo „własne” składników eluentu
