Synthese van menselijk calcitonine

I

SYNTHESE VAN

MENSELIJK CALCITONINE

J. HIRT

X - J OD

cn

(ksa \^j^ ^.xiy

H ^}^&

^ s n )

@

fhe\

mis) c

%. .4^

SYNTHESE VAN

MENSELIJK CALCITONINE

PROEFSCHRIFT

TER VERKRIJGING VAN DE GRAAD VAN DOCTOR IN DE TECHNISCHE WETENSCHAPPFN AAN DE TECHNISCHE HOGESCHOOL DELFT, OP GEZAG VAN DE RECTOR MAGNIEICUS PROF. IR. L. HUISMAN,

VOOR EEN COMMISSIE AANGEWEZEN DOOR IIET COLLEGE VAN DEKANEN TE VERDEDIGEN OP WOENSDAG 3 MEI 1978 TE 16.00 UUR

DOOR

JOHANNES HIRT

scheikundig ingenieur

geboren te Rotterdam

BIBLIOTH P 1795 6 C EEH 364

C1005

3

7220

4

; TU Delft 537220

III!

t

III

|"ii

liiiii

—-,

flilfli!'

Ill fi Mil,

II . l i i i i J i ill 1 il i' 11 lull li III \

111

1 1 h !: Il II h 1 1, liJiii i i r

iMmii

-yp^~ /

• ! ( i t l 0 r i 6 |

^ < . » t i U L ' .fj

SIR 10

. * /

>179

5

636

4

;

>0t-Aan mijn ouders

Aan Anneke

Het i n d i t p r o e f s c h n f t besrhreven onderzoek i s uitgevoerd onder auspicien van de S t i c h t i n g "Scheikundig Onderzoek in Nederland"

(SON) met f i n a n c i e l e steun van de Nederlandse Orgamsatie voor Zui ver-Wetenschappelijk Onderzoek (ZWO).

De synthese in oplossing van menselijk calcitomne is uitgevoerd in samenwerking met P. Kranenburg. Voor z i j n belangnjke aandeel in d i t onderzoek ben ik hem zeer e r k e n t e l i j k .

Inhoud

AFKORTINGEN

INLEIDING EN DOELSTELLING 1

1. INLEIDING 3

1.1 Algemeen gedeelte 3

1.2 Menselijk calcitonine 7

2. SYNTHESE VAN FRAGMENT 20-32 18

2.1 Fragmentsynthese 18

2.2 Stapsgewijze synthese 20

3. SYNTHESE VAN FRAGMENT 11-19 23

3.1 Fragmentsynthese 23

3.2 Stapsgewijze synthese 25

4. SYNTHESE VAN FRAGMENT 1-10 27

5. KOPPELING VAN DE FRAGMENTEN 29

5.1 Koppeling van de fragmenten 11-19 en 20-32 29

5.2 Koppeling van de fragmenten 1-10 en 11-32 29

6. MENSELIJK CALCITONINE 30

6.1 Verwijdering van de beschermende groepen en zuivering 30

Afkortingen

In de gebruikte afkortingen z i j n zoveel mogelijk de aanbevelingen van de lUPAC-IUB Commissie voor Biochemische Nomenclatuur gevolgd (Bio-chemistry 11(1972)1726). De aminozuren, behalve g l y c i n e , hebben de L-configuratie. Bmp Boc iBoc iBuOCOCl But Bzl DCCI DCHA DCU die DMF Dnp HOBt HOSu Mbh MRC NMet NMM Np pmr polymeer REMA THF Tfa TEA Tos Z Z(OMe) Ztf p -mercaptopropionzuur (desaminocysteine) tert-butyloxycarbonyl 1sobutyloxycarbonyl 1sobutylchloorcarbonaat t e r t - b u t y l benzyl dicyclohexylcarbodiimide dicyclohexylamine dicyclohexylureum dunnelaagchromatografie N,N-dimethylformamide 2,4-dini trofenyl 1-hydroxybenzotriazool N-hydroxysuccinimide 4,4'-dimethoxybenzhydryl Medical Research Council

normethionine (S-methylcystefne) N-methylmorfol ine

4 - m t r o f e n y l

proton magnetische resonantie

0-CH2-(polystyreen-2° divinylbenzeen) r e p e t i t i v e excess mixed anhydride tetrahydrofuran t n f l u o r a c e t a a t t n f l u o r a z i j n z u u r 4-tolueensulfonyl benzyloxycarbonyl 4-methoxybenzyloxycarbonyl

Inleiding en doelstelling

Menselijk c a l c i t o m n e heeft in Delft gediend als modelpeptide voor de bestudering van synthesemethoden: vaste fase synthese en synthese i n oplossing volgens de r e p e t i t i e v e overmaat gemengd anhydride methode.

I 1 H Cys G l y Asn Leu Ser Thr Cys M e t Leu Gly

-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Thr T y r Thr G i n A s p ~ Phe Asn Lys Phe -11 12 13 U 15 16 17 18 19

- H I S - Thr - Phe - Pro - G i n - Thr - A l a l i e - Gly Vol - Gly - A l a Pro - N H j 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

De aminozuursequentie van menselijk c a l c i t o m n e .

De mogelijkheden en beperkingen van de vaste fase peptide synthese wer-den door H. Hindriks ( P r o e f s c h n f t , D e l f t , 1973) onderzocht door de synthese van twee fragmenten (110 en 1132) van [Asn^ _]mensel i j k c a l -c i t o m n e . Bij de synthese van fragment 11-32 bleek dat in de buurt var proline op plaats 23 een aantal peptideketens van verdere groei waren uitgesloten. Na a f s p l i t s i n g van het peptide van het polymeer konden de kortere peptiden ( ~ 2332) worden gescheiden van het hoofdprodukt f r a g -ment 11-32. Na koppeling in oplossing met frag-ment 1-10 werden de be-schermende groepen a f g e s p l i t s t . Het gezuiverde produkt bezat een kwart van de biologische a c t i v i t e i t van een n a t u u r l i j k preparaat.

Om de moeilijkheden b i j de synthese van fragment 11-32 nader te onder zoeken heb i k , als eerste doel, de synthese van fragment 20-32 tweemaal uitgevoerd. De aminogroepen werden na ontscherming k w a n t i t a t i e f be-paald. Na de koppel ingsreactie werd het produkt zowel k w a l i t a t i e f als k w a n t i t a t i e f op nog aanwezige aminogroepen gecontroleerd.

beste-1. Inleiding

1.1 ALGEMEEN GEDEELTE

Uit de resultaten van doorstroomexpenmenten van het schil dkl l e r b i j -schildkllercomplex van honden concludeerden Copp et al (1,2) in 1961 dat er naast het sinds 1925 bekende parathyroid hormoon (3) nog een hormoon moest z i j n met eveneens een regulerende working op het calcium-gehalte in het bloed Dit hormoon noemden z i j calcitomne B i j een verhoogd calciumgehal te in het bloed (hypercalciemie) zou c a l c i t o m n e door de b i j s c h i l d k l i e r e n worden afgescheiden om het calciumgehalte te verlagen De waarnemingen van Copp et a l . werden bevestigd door Kumar et a l . (4)

Hirsch et al . (5) isoleerden u i t r a t t e s c h i I d k l l e r e n een f a c t o r , die het calciumgehalte in het bloed doet dalen Z i j gaven deze de naam t h y r o c a l c i t o m n e . Foster et al . (6) en Care (7) toonden door middel van doorstroomexpenmenten van de s c h i l d k l i e r van de g e i t , respectiev e l i j k respectievan het respectievarken, aan dat c a l c i t o m n e inderdaad door s c h i l d k l i e r -weefsel werd gemaakt. Sedert die t i j d heeft het calcitomne-onderzoek een grote vlucht genomen.

Calcitomne wordt geproduceerd in zogenaamde C-cellen ( 8 , 9 ) . Deze cellen z i j n in de embryonale ontwikkeling afkomstig u i t de neurale kam (10,11). Hieruit ontwikkelt zich ook het centrale zenuwstelsel en de achterkwab van de hypofyse. B i j zoogdieren groeien de C-cellen hoofd-z a k e l i j k de s c h i l d k l i e r in Daarnaast hoofd-z i j n hoofd-ze ook aangetroffen in de b i j s c h i l d k l i e r e n en in de thymus B i j lagere diersoorten, zoals vogels, vissen, reptielen en amfibieen, komen de C-cellen voor in aparte orga-nen, de ultimobranch^ale lichaampjes

Calcitomne i s u i t t a l van diersoorten geisoleerd, vervolgens gezui-verd en onderzocht op biologische a c t i v i t e i t . De aminozuursequentie (pnmaire structuur) werd opgehelderd van de calcitomnes van het

var-VARKEN H = Ser RUND H = Ser SCHA/ H = Ser \P 1 AAL ZALM ZALM ZALM MENS RAT

1 2 3

H H H H H H 1 = = = = Cys

Ser Ser Ser Ser Gly

Asn = = = = = = = = Leu = = = =

5 = = = = Ser = = = =

Thr = = = = =

Cys = = = = Val Val Val = Met = Val Val Val

= = = = Leu = = = = Gly Thr Tyr Thr Gin Asp Phe Leu Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gin Thr Ala Ser lie Gly Val Gly Ala Pro NHj NHj NH2 NHj NHj

Figuur 1-1 De aminozuursequenties van calcitomnes, afkomstig uit de aal , de zalm, de mens, de rat, het varken, het rund en het schaap. De disulfide-brug tussen de cysteines op de posities 1 en 7 is m e t aangegeven. = : aminozuurrest, identiek aan die in menselijk calcitomne. 10 15 20 25 30 32 = Lys Leu Ser = Glu Leu His = Leu Gin = Tyr = Arg = Asp Val = Ala = Thr = NHg = Lys Leu Ser = Glu Leu His = Leu Gin = Tyr = Arg = Asn Thr = Ser = Thr = NH2 = Lys Leu Ser = = Leu His = Leu Gin = = = Arg = Asn Thr = Ala = Val = NH2 = Lys Leu Ser = = Leu His = Leu Gin = = = Arg = Asn Thr = Ala = Val = NH2 Ser Ala Trp Arg Asn Leu Asn = = Arg = Ser Gly Met Gly Phe Pro Glu Thr = Ser Ala Trp Lys = Leu Asn Tyr = Arg = Ser Gly Met Gly Phe Pro Glu Thr = Ser Ala Trp Lys = Leu Asn Tyr = Arg Tyr Ser Gly Met Gly Phe Pro Glu Thr = 10 15 20 25 30 32

1.2 MENSELIJK CALCITONINE

Uit een extract van tumorweefsel van de s c h i l d k l i e r werden door middel van gelchromatografie en tegenstroomverdeling twee hoog actieve c a l c i -toninepeptiden geisoleerd: menselijk c a l c i t o m n e (humaan c a l c i t o m n e , HCT; f i g . 1-2) en het a n t i p a r a l l e l le dimeer van menselijk c a l c i t o m n e ( f i g . 1-3) (23). Beide peptiden hadden een biologische a c t i v i t e i t van 120 MRC eenheden/mg droog gewicht. Door toepassing van enzymatische en chemische methoden werden de aminozuursequenties opgehelderd (24).

H Cys G l y Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu G l y

-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Thr — T y r — Thr — G i n - A s p — Phe - Asn - Lys Phe 11 12 13 14 15 16 17 18 19

- H I S Thr - Phe - Pro - G i n - Thr - Ala - l i e - Gly Vol Gly - A l a P r o NH2 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

Figuur 1-2 De aminozuursequentie van menselijk c a l c i t o m n e .

Figuur 1-3 Schematische v o o r s t e l l i n g van het a n t i p a r a l l e l l e dimeer van menselijk c a l c i t o m n e .

Recent is er bewijsmatenaal gepubliceerd dat d i t u i t tumorweefsel ver-kregen c a l c i t o m n e identiek is aan het hormoon, dat u i t normaal weefsel afkomstig is ( 4 8 ) .

Inmiddels z i j n zowel menselijk calcitomne als een aantal analoga ge-synthetiseerd (tabel 1-2). Ook de structuur-werkingsrelatie werd be-studeerd. H i e r u i t kon het volgende worden geconcludeerd ( a c t i v i t e i t e n in v e r g e l i j k i n g met die van synthetisch menselijk c a l c i t o m n e van

CIBA-G E I CIBA-G Y ) :

1. Geringe veranderingen aan het C-terminale einde leidden t o t een sterke a c t i v i t e i t s d a l i n g

2. Acetylenng van cysteine of vervanging door p-mercaptopropionzuur (de-aminocysteine) gaf een gennge a c t i v i t e i t s v e r h o g i n g . Vervanging

1 7

van cysteine ' door normethionine (S-methylcysteine) leidde t o t een lage a c t i v i t e i t .

o 22 3. De analoga, waarbij methionine door valine en fenylalamne door

tyrosine zowel a f z o n d e r l i j k als gezamenlijk vervangen waren, vertoon-den een v i e r - t o t vijfmaal hogere a c t i v i t e i t

29 31

4. G e l i j k t i j d i g e vervanging van valine door alanine en alanine door valine, zoals in de zalmcalcitonines 2 en 3, leidde t o t een lage a c t i v i t e i t . Vervanging door r e s p e c t i e v e l i j k serine en threonine, zoals

i n zalmcalcitomne 1 , verhoogde de a c t i v i t e i t v i j f m a a l .

5. Interessant was de vervanging van de aromatische aminozuren tyrosine en fenylalamne op de posities 12, 16 en 19 door het al i f a t i s c h e leucine, zoals in de a a l - en zalmcalcitonines. Enkelvoudige vervanging leidde

12

slechts in een geval (leucine ) t o t een verhoging van de a c t i v i t e i t (vijfmaal) De-aminering van cysteine verdubbelde de a c t i v i t e i t van het

12

leucine -analogon. Het tnleucine-analogon vertoonde een tienvoudige Q

a c t i v i t e i t . Vervanging van methionine door valine in het t n l e u c i n e analogon gaf geen extra a c t i v i t e i t s v e r h o g i n g , vervanging van f e n y l a l a

-22

nine door tyrosine echter wel.

Menselijk c a l c i t o m n e is in oplossing gesynthetiseerd door werkgroepen i n de farmaceutische Industrie (CIBA-GEIGY, Basel, Zwitserland en ORGANON, Oss, Nederland). In beide synthesen werd fragment 1-10 met ge-sloten disulfidebrug gekoppeld aan fragment 11-32. Deze werkwijze is voor het eerst toegepast door de CIBA-GEIGY-groep in hun synthese van varkenscalcitonine (26). Een zelfde werkwijze is door de SANDOZ-groep (Basel, Zwitserland) toegepast i n hun synthesen van varkenscalcitonine ( 2 5 ) , de drie zalmcalcitonines (27,28) en analoga (60,61)

Het voornaamste verschil tussen de twee synthesen van menselijk c a l -c i t o m n e IS dat i n de aanpak van de CIBA-GEIGY-groep (29,62) de hydroxyl-functies van s e r i n e , threonine en tyrosine gedurende de gehele syn-these beschermd waren door de t e r t - b u t y l g r o e p en dat in de synsyn-these

c-j 1 — 7 }-N;Hj I I NQ/NH, 2 K3Fe(CN)s _]-N3H3+ H-[ 6 IpyOH c-| 25 2r]-N;Hi-f- H-| 29 sFj-NH; a z i d e m e t h o d e _{t azide methode} 2 90'/<. TFA Z-| n i r V N j H 3 + H-j 15 '» IS | - 0 H 2 - | 20 2U j - N ^ H j - f H - | 25 r | - N H , a z i d e m e l h o d s

^^

j7]-0H+ H-jj 1 DCCl/HOSu 2 H j / P d - C ri-OH + H-Ij DCCI/HOSU Boc-£T I 1 geconc HCl

"H:

1 azidemethode 2 H i / P d - C -32 | - K H , Q - N H , Q - N H , T-NH,

Figuur 1-5 Synthese van menselijk calcitonine door Greven en Tax (ORGANON)

(30)De procedure zoals beschreven voor de synthese van menselijk c a l c i t o -nine (29) werd door de CIBA-GEIGY-groep (51-54) ook toegepast b i j de syn-these van een aantal analoga (tabel 1-2).

Door Nozaki en Muramatsu (49) i s de synthese gepubliceerd van [Ser , Val^J-menselijk c a l c i t o n i n e ( f i g . 1-6, tabel 1-2). Het N-terminale de-capeptide correspondeerde met dat van de calcitonines van de a a l , de

EhN/MeOH 2-\ n - - K l-OMe Z - | n - - K [-N;H3 OBu Boc _ J I z-|_ll__!iiJ-® ElaN/MeOH OBu Boc Z - | 15 '819 | - 0 z z t t z t t Z-\ 2 0 1 ' - !5 - 21 _J<£) EtaN/MeOH Ztl Ztl Z-\ 20 ?i - - 2? 28 h O M e ]-OMe Z H 20 2' - 1 5 - 28 ] - 0 H B o c - | 29 32 | - ( p ) EljN/MeOH B o c - | 29 - 32 [-OMe B o c - | 2 9 32 [ - N H ;

Figuur 1-7 Plan voor de vaste fase synthese van fragmenten van de sequentie 11-32 van menselijk c a l c i t o n i n e (Hindriks, l i t . 63).

gesynthetiseerd. Na r i n g s l u i t i n g vond koppeling van de fragmenten 1-7 en 8-10 p l a a t s , waarna d i t produkt aan fragment 11-32 werd gekoppeld. Na a f s p l i t s i n g van de beschermende groepen werd het produkt gezuiverd.

Na de moeilijkheden die Hindriks (57; 8.1) ondervond b i j de

stapsge-r 15i

wijze opbouw van de sequentie 11-32 van [Asn J-menselijk calcitonine

via de vaste fase methode, trachtte hij (63) deze sequentie ook te

maken door koppeling in oplossing van goed gezuiverde via de vaste fase

methode gesynthetiseerde fragmenten (fig. 1-7). Ter vergelijking

zou-den deze fragmenten ook in oplossing worzou-den gesynthetiseerd.

OR Boc Z Bzl Bzl

Z-\ II K |"NjH;-Boc Z - | 15 '» 19 |-QMe Z - | 20 J' ?5 - ITI^OMe Z - | 29 3 7 ] - N H ;

T F A / C H , C I I

1

1,/Pd-C H , / P d - C H Bzl Bzl Z-| 11 - 1 ^ N ; H j + H-| 15 '119 [-OMe Z-j 20 ? ' — - » 2 B ' ] - 0 H + H-j 2 9 - 32 \-tiHi DCCl/HOBt a z I d e m e t h o d e 2\ 11 — n ' i T g ^ O M e Zl 2 0 " -z-{Tr r j - N i H j + H-[ 20 ;i azidemethode (R)(R)(R) OR Boc azidemethode R R R OR Boc r ] - N j H j -I- H-[20 ; Q-OMe Boc-jl Bzl Bzl Q - N H j H Br/TFA Q - N H j H - N H i J - N H ; HBr/TFA Boc Bzl Bzl |J~NH,

Figuur 1-8 Synthese van fragment 11-32 van menselijk c a l c i t o n i n e .

alaninederivaat wordt gevormd (71-73). Koppeling van glycine zou kunnen leiden t o t d i a c y l e r i n g (74,75). Boc-Gly-OH (69, 2.1) en Z-Gly-OH (2,2) werden echter zonder problemen gekoppeld. De reactie aan t y r o s i n e - , threonine-, s e r i n e - en histidinemethylester met onbeschermde zijketens is onderzocht door LLibke (71). B i j koppeling aan tyrosine en threonine traden geen nevenreacties op, b i j koppeling aan serine en h i s t i d i n e wel. Wij onderzochten de koppelingen van Z-Tyr-OH en Z-Thr-OH. Deze aminozuurderivaten werden zonder problemen in de peptideketen inge-bouwd. In het algemeen z i j n deze produkten meer wateroplosbaar dan de

Het verloop van de koppelingsreactie werd semi-kwantitatief gecon-t r o l e e r d door middel van een spogecon-t- of vlekgecon-tesgecon-t megecon-t fluorescamine op een s i l icagelplaatje (69,76).

De sequenties 11-19 en 20-32 werden zowel via fragmentkoppeling als door stapsgewijze synthese verkregen ( f i g . 18). De koppeling van f r a g -ment 11-19 aan 20-32 werd uitgevoerd via de azidemethode (77). In ver-band met de bescherming van de t h i o l f u n c t i e s van de cysteVnes op de po-s i t i e po-s 1 en 7 en de aanwezigheid van methionine op p o po-s i t i e 8 leek een stapsgewijze opbouw van de sequentie 1-10 ons niet wenselijk. Wij syn-thetiseerden de fragmenten 1-7 en 8-10 en koppelden evenals Greven en Tax (30) fragment 1-7 na oxidatieve r i n g s l u i t i n g aan het methionine bevattende t r i p e p t i d e 8-10 ( f i g . 1-9). De koppeling van de fragmenten 1-10 en 11-32 vond plaats via de DCCI/HOBt-methode (78).

Thr Phe Pro Gin B o c — O N p H - - O B 2 I

1

B2I - O H

H-.

1-\»^A Pd-C OH B o c •OH H-

1-Bzl - O H H-2 - - 0 H H — •OH H -\a,b •OH H a,b

y Vol Gly Ala Pro OMe •OMe •OMe •OMe Z - ^ O H H - | - N H

1°-'

D C C I / H O B I methode I HBr/TFA His 20 Thr 21 Phe 22 Pro 23 Gin 24 Thr 25 Ala 26 lie 27 Gly 29 Vol 29 Gly 30 Ala 31 Pro 32 a Koppeling via de o v e r m a a t g e m e n g d a n h y d r i d e m e t h o d e b Afsplitsing v a n de Z - g r o e p door h y d r o g e n o l y s e

c Afsplitsing van de B o c - g r o e p door T F A / C H ^ C I ^ ( 1 1 )

d Ook werd Z - H i s g e k o p p e l d via de a z i d e m e t h o d e

Figuur 2-1 Synthese van fragment 20-32 van menselijk c a l c i t o n i n e .

kend over de koppeling van histidinederivaten via de gemengd anhydride methode. Tilak et a l . (67) beschreven de koppeling van Boc-His(Bzl)-0H zonder toevoeging van een t e r t i a i r amine. Sakayima (79) koppelde Z-His(Z)-OH. Baugh et a l . (80) gebruikten Boc-His-OH b i j een vaste fase synthese. Er werd n i e t nagegaan of er b i j deze koppelingen racemisatie o p t r a d . Dat racemisatie b i j koppeling van histidinederivaten in belang-r i j k e mate kan optbelang-reden is d u i d e l i j k gewobelang-rden u i t ondebelang-rzoeken van Wind-ridge en Jorgensen (81,82), Lin et a l . (83) en Syrier en Beyerman (84).

In eerste i n s t a n t i e werd daarom h i s t i d i n e als N " -Z-derivaat via de azidemethode aan fragment 21-28 gekoppeld. Later is aan hetbovengenoem-de probleem op d i t Laboratorium een onhetbovengenoem-derzoek gewijd (85). Onhetbovengenoem-derzocht werden de koppelingen van Boc-His(Y)-OH en Z-His(Z)-OH aan het C-termi-nale pentapeptide H-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH^ van varkenssecretine,

waar-Phe Pro

c+

Boc-Boc 6 o c - f - 0 H H-B z l i' -OH H ^

1'.'

n Thr A l o lie G l y Vol Gly ALo Pi Z B o c - i - O H HB o c r O H H -i.Bzl I i ' - ' B o c - p O H H 4 - O H H - ^ 1 "Br/T HIS 20 Thr 21 Phe 22 Pro 23 G i n 24 Thr 25 Ala 26 l i e 27 G l y 2 8 Vol 29 Gly 3 0 A l o 31 Pro 32 o A f s p l i t s i n g v a n de Z - g r o e p d o o r h y d r o g e n o l y s e b K o p p e l i n g v i a d e o v e r m a a t g e m e n g d a n h y d r i d e m e t h o d e c A f s p l i l s m g v o n de B o c - g r o e p d o o r T F A / C H J C I , ( 1 1 ).

Figuur 2-2 Stapsgewijze synthese van fragment 20-32

van menselijk calcitonine.

chromatografie (zie 2.1). Het produkt was identiek aan het door

frag-mentkoppel ing verkregen produkt.

Om de wateroplosbaarheid van de C-terminale peptiden tot het

octapepti-destadium te verlagen werd het eindstandige primaire amide door de 4,4'

-dimethoxybenzhydrylgroep (86) beschermd. De sequentie 25-32werdnu

ge-synthetiseerd (fig. 2-3) uitgaande van Z-Pro-NH-Mbh. Vanwege de

zuurge-voeligheid van de Mbh-groep moest de Z-groep worden gebruikt voor

be-scherming van de aminofunctie, omdat deze groep selectief te

verwijde-ren was door hydrogenolyse.

Koppeling van Z-Ala-OH via de overmaat gemengd anhydride methode

leidde tot ongeveer 15% iBoc-Pro-NH-Mbh, dat door tritureren van het

produkt met ether kon worden verwijderd. De opbrengst aan dipeptide

be-3. Synthese van fragment 11-19

3.1 FRAGMENTSYNTHESE

Fragment 11-19 werd door koppeling van het tetrapeptide 11-14 aan het

pentapeptide 15-19 via de azidemethode (fig. 3-1) verkregen. De

syn-these van het pentapeptide 15-19 verliep zonder moeilijkheden.

Onze opzet was het tetrapeptide 11-14 te verkrijgen zonder

bescher-ming van de hydroxy!functies. Vanwege de azidekoppeling werd van

H-Gln-N„H„-Boc uitgegaan. We hebben tweemaal Z-Thr-OH met

onbescherm-de zijketen gekoppeld, terwijl Z-Tyr-OH zowel zononbescherm-der als met tijonbescherm-delij-

tijdelij-ke bescherming van de hydroxy!functie werd ingebouwd. Het zo verkregen

Z-ll-14-NpH„-Boc werd na vnjmaken van de hydrazidefunctie aan

H-15-19--OMe gekoppeld.

Omdat de ami nocomponent m e t volledig door gelchromatografie over

Sephadex LH-20 werd verwijderd, werd bij een tweede synthese het

pro-dukt gezuiverd door chromatografie over Bio-Rex 70 (H -vorm) met DMF/

methanol/water (2:2.1 v/v) als elutiemidde!. Na tritureren met

metha-nol was het produkt homogeen volgens die en had een correcte

aminozuur-samenstelling.

Om het verkregen fragment Z-ll-19-OMe geschikt te maken voor koppeling

met fragment H-20-32-NH„ stonden in pnncipe twee wegen open: basische

hydrolyse of hydrazinolyse van de methylester. Daar zich in de

peptide-keten Asp(OBu ) en asparagine bevonden, die gemakkelijk aanleiding

kden geven tot nevenreacties, werkden de bovengenoemde reacties eerst

on-derzocht aan Z-15-19-0Me

Uit de literatuur was bekend dat asparagine tijdens basische

hydroly-se stable! (87-91) is, mits dit aminozuur m e t C-terminaal voorkomt

(92-96) of in de combinaties -Asn-Gly- (97,98) of -Asn-Ser- (97,99).

Ook Asp (OBu ) blijkt in een aantal gevallen wel (100-104) en in een

r Tyr Thr Gl Z

1-(Bzl) ^OH H^ •OH H -| o , 4 ITFA/CHJI NjHjBoc b N,HJBOC NiHjBoc

Asp Phe A s n L y s Phe Z NjH,- Z ^ O H H Boc ^ N,H,- Z ' Z O H H ' -Z + O H H'

1-a 2 i d e m ( t h o d e ! ii: Boc - O H H - l - O M e la.b

Thr Tyr Thr Gin Asp Phe Asn Lys Phe 11 12 13 14 15 16 17 18 19

a K o p p e l i n g v i a d e o v e r m a a t g e m e n g d a n h y d r i d e m e t h o d e b A f s p l i t s i n g v o n d e Z en B z l - g r o e p e n d o o r h y d r o g e n o l y s e c K o p p e l i n g v i a d e D C C I / H O B I m e t h o d e

Figuur 3-1 Synthese van fragment 11-19 van menselijk c a l c i t o n i n e .

Thr Tyr Thr Gtn A s p P h e Asn Lys Phe

Bu' Z - ^ O H H

1-'

ZfOH H -a,b Bu - O H H-•OMe •OMe •OMe -OMe

Thr T y r Thr O I n Asp Phe Asn Lys Phe 11 12 13 14 15 16 17 18 19 0 K o p p e l i n g v i a de o v e r m a a t g e m e n g d a n h y d r i d e m e t h o d e

b A f s p l i t s i n g v o n d e Z - g r o e p d o o r h y d r o g e n o l y s e

Figuur 3-2 Stapsgewijze synthese van fragment 11-19 van menselijk c a l c i t o n i n e .

4. Synthese van fragment 1-10

Daar methionine m e t stabiel is tijdens de a f s p l i t s i n g van de z i j k e t e n -beschermende benzylgroepen door middel van natrium in vloeibare ammo-niak (115) werd fragment 1-7 met gesloten disulfidebrug gekoppeld aan het methionine bevattende t r i p e p t i d e 8-10 ( f i g . 4 - 1 ) .

Voor de synthese van fragment 810 werd gebruik gemaakt van de t e r t --butylgroep voor bescherming van de eindstandige carboxylgroep, zodat na koppeling van r e s p e c t i e v e l i j k Z-Leu-OH en Boc-Met-OH het beschermde t r i p e p t i d e door een behandeling kon worden ontschermd

Het tetrapeptide 4-7 werd via de r e p e t i t i e v e overmaat gemengd anhydride methode gesynthetiseerd De opbrengst bedroeg 85% na k r i s t a l l i -s a t i e Boc-A-sn-OH werd gekoppeld via de DCCI/HOBt-methode. B i j deze koppeling ontstond Tfa-4-7-0Me (ongeveer 30^) als b i j p r o d u k t , waarvan een goed interpreteerbaar massaspectrum (m/e 802) werd verkregen. Deze nevenreactie was door Fletcher et al.(116) beschreven en zou i n belangnjke mate kunnen optreden b i j DCCI-koppelingen i n aanwezigheid van t n f l u o r a c e t a a t anionen Toevoeging van HOBt zou deze reactie ech-t e r aanzienlijk ech-terugdringen.

De laatste twee aminozuren werden weer via de overmaat gemengd anhy-dride methode gekoppeld. Het produkt werd na k n s t a l l i s a t i e omgezet in het hydrazide door hydrazinolyse van de methylester in DMF/butanol (1:1 v/v) (114). De benzylgroepen werden verwijderd door natrium in v l o e i -bare ammoniak (117) volgens de extractieprocedure van Nesvadba en Roth (118). Bij deze reactie werd ureum toegevoegd als protondonor om de vorming van natnumamide te verhinderen (119). De disulfidebrug werd gesloten door o x i d a t i e met kallum-hexacyanoferraat ( I I I ) (120,121). Het produkt werd gezuiverd door chromatografie over AG 11A8.

Koppeling van de fragmenten 1-7 en 8-10 vond plaats via de azideme-thode (77), waarna het produkt door chromatografie over Merckogel OR--PVA 20000 met DMF als eluens werd gezuiverd.

5. Koppeling van de fragmenten

5.1 KOPPELING VAN DE FRAGMENTEN 11-19 EN 20-32

Door middel van de azidemethode (77) werden gekoppeld Z-11-19-N„H, (on-beschermde OH-functies, 3.1) en H-20-32-NH„ ( 2 . 1 ) , beide door fragment-synthese gemaakt en Z - l l - i g - N ^ H , (beschermde OH-functies, 3.2) en H-20--32-NHp (2 2 ) , beide door stapsgewijze synthese gemaakt ( f i g . 1-8). De zuivering vond plaats door chromatografie over Merckogel OR-PVA 20000 met DMF als eluens. Door d i t systeem werd het produkt goed gescheiden van de uitgangsstoffen, hetgeen m e t het geval was b i j zuivering over Sephadex LH-20.

De opbrengsten van de azidekoppelingen waren r e s p e c t i e v e l i j k 86 en 79%. Beide produkten waren homogeen volgens d i e , maar bevatten volgens de aminozuuranalyse nog enkele procenten van het fragment 11-19.

5.2 KOPPELING VAN DE FRAGMENTEN 1-10 en 11-32

Na de verwijdering van de Z-groep van Z-ll-32-NHp door hydrogenolyse werd d i t produkt via de DCCI/HOBt-methode (78) gekoppeld met Boc-1--10-OH ( f i g . 1-9). De zuivering vond plaats door chromatografie over Merckogel OR-PVA 20000 (DMF), waarbij de banden van produkt 1-32 en fragment 11-32 eikaar g e d e e l t e l i j k overlapten. B i j chromatografie over Sephadex LH-20 t r a d er in het geheel geen scheiding tussen deze twee stoffen op.

2,5 , Leu 3,5%; Tyr 2,8%; Phe 3,0%; His 1,0%; Lys * 3% (moeilijk te be-palen, bevindt zich op een piek veroorzaakt door de Tnsbuffer)

6.2 BIOLOGISCH ONDERZOEK

De biologische activiteit van net synthetische preparaat werd bepaald door Prof Dr. G Milhaud, Service de Medecine Nucleaire, Hdpital Saint-Antoine, P a n s , France.

De daling van het calciumgehal te in het bloed van jonge ratten, ver-oorzaakt door intraveneuze toedi^ning van een oplossing van het prepa-raat (58), werd bepaald. Ten opzichte van de Medical Research Council Standard A werd een activiteit gevonden van 99(84-111) MRC eenheden/mg droog gewicht of 116(99-131) MRC eenheden/mg peptide (p=0,95)

Voor het uitvoeren van de bepaling ben ik Professor G. Milhaud zeer erkentel ijk.

A: Chloroform - methanol 9:1 B: Chloroform - methanol 4:1 C: Chloroform - methanol 2:1 D: Chloroform - methanol 1:1 E: Chloroform - methanol - azijnzuur 85:10:5

F. Chloroform - methanol - pyridine 85:10:5 G: Chloroform - methanol - 17% ammonia 4:3:1 H: Chloroform - methanol - 17% ammonia 2:2:1 J : Diisopropylether - chloroform - azijnzuur 6:3:1 K: Isopropylalcohol - ethylacetaat - water 4:3:3 L: tert-Amylalcohol - isopropylalcohol - water 51:21:28

M: Butanol - azijnzuur - water 4:1:1 N: Butanol - pyridine - azijnzuur - water 16:3:1:4

0: Ethylacetaat - aceton - water 72:24:4 P: Ethylacetaat - pyridine - water 2:1:1 R: Ethylacetaat - pyridine - water (bovenfase) 2:1:2

S: Ethylacetaat - pyridine - azijnzuur - water 62:21:6:11 T: Ethylacetaat - pyridine - azijnzuur - water 5:1:1:1 Na die en elektroforese werden de vlekken zichtbaar gemaakt op een of meerdere van de volgende mameren: (a) belichten met u l t r a v i o l e t l i c h t

(254 nm), (b) besproeien met een 0,015% fluorescamine-oplossing i n ace-ton en belichten met u l t r a v i o l e t l i c h t (360 nm), (c) besproeien met ninhydnnreagens (Merck) en enkele minuten v e r h i t t e n b i j 100 , (d) be-sproeien met Reindel-Hoppe reagens (een mengsel van o - t o l i d i n e en ka-liumjodide) na c h l o r e n n g , (e) besproeien met Pauly-reagens (een op-lossing van gediazoteerd s u l f a n i l z u u r ) gevolgd door enkele minuten v e r h i t t e n b i j 100°.

Voor gelchromatografie in waterig milieu werd gebruik gemaakt van de Sephadex G-serie (Pharmacia Fine Chemicals). Gelchromatografie in DMF werd uitgevoerd met Sephadex LH-20 en Merckogel OR-PVA 20000 (Merck).

Verdelingschromatografie op Sephadex G-25 werd uitgevoerd volgens Yamashiro (22). De kolom werd gepakt met een suspensie van Sephadex in 20% azijnzuur. Na 1,3 x kolomvolume onderfase en 0,25 x kolomvolu-me bovenfase werd het monster, opgelost in 4-8 ml bovenfase,

opge-ALGEMENE WERKWIJZEN

a. Verwijdering DCHA

Het vnjmaken van aminozuurderivaten u i t hun DCHA-zouten geschiedde door een extractieprocedure met ethylacetaat of chloroform als oplos-middel en een watenge oplossing van NaHSO, volgens Spangenberg et al . (129).

b. A f s p l i t s i n g N-beschermende groepen

Z-groepen werden verwijderd door hydrogenolyse in methanol of metha-nol/DMF bij kamertemperatuur en atmosfensche druk. Als katalysator werd 10 gewichtsprocenten Pd-C (10% Pd) toegevoegd. De reactie werd met die gevolgd. De katalysator werd verwijderd door filtratie over een glasfilter.

De Boc-groepen werden afgesplitst door het produkt op te lossen in TFA/CHpCl„ (1:1 v/v) en de oplossing gedurende 30 min bij kamertem-peratuur te bewaren. De reactie werd met die gecontroleerd. De op-lossing werd in vacuum ingedampt en het residu werd in vacuum boven KOH gedroogd.

c. Overmaat gemengd anhydride koppelingen

De koppelingen werden uitgevoerd in een dubbelwandig reactievat, dat door een cryostaat op constante temperatuur werd gehouden.

Aan een geroerde oplossing van 1,3 equiv. N-beschermd aminozuur en 1,3 equiv. NMM in THF of DMF werd bij -15°±1° 1,2 equiv. isobutyl-chloorcarbonaat toegevoegd. Na een activenngstijd van 1 min werd een oplossing van de aminocomponent (1 equiv.) inDMF (geneutraliseerd met NMM tot pH=7 + 1 equiv. NIIM) erbij gevoegd. De koppeling werd uitge-voerd bij -15 ±1 . De pH van het reactiemengsel werd op 7-8 gehouden.

7.2 SYNTHESE VAN FRAGMENT 20-32

7.2.1 Fragmentsynthese

Koppelingsgegevens behorende bij de synthesen van Z-Val-Gly-Ala-Pro-NH,

(4), Z-His-Thr(Bzl)-Phe-Pro-Gln-Thr(Bzl)-Ala-Ile-Gly-OMe (11) en Z-His

(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Pro-Gln-Thr(Bzl)-Ala-Ile-Gly-OMe (12) zijn samengevat

in tabel 7-2. De fysische eigenschappen en analytische gegevens van de

tussen- en eindprodukten zijn vermeld in de tabellen 7-3 en 7-4.

Z-His-Thr(Bzl)-Phe-Pro-Gln-Thr(Bzl)-Ala-Ile-Gly-OH (13)

Aan een oplossing van 0,36 g (0,277 mmol) Z-20-28-0Me (11) in 30 ml dioxan/HgO (4:1 v/v) werd 1,1 ml 0,5 N NaOH toegevoegd. Na 10 min werd met 1 N HCl aangezuurd t o t pH 3-4. De oplossing werd, na indampen t o t ongeveer 10 m l , toegevoegd aan 50 ml 0,01 N HCl. Het neerslag werd af-g e f i l t r e e r d en af-gedrooaf-gd. Opbrenaf-gst 0,36 af-g ; smeltpunt 215-6° ( o n t l . ) ; [ a ] Q ° 16°, [ a ] 5 7 g 18° (c=l in DMF); Cl'gehalte 94%; homogeen v o l -gens die (R^K 0,60; R^P 0,49; R^T 0,24).

Aminozuuranalyse: Thr (2) 1,94; Glu (1) 0,99; Pro (1) 0,96; Gly (1) 1,05; Ala (1) 1,05; He (1) 1,06; Phe (1) 0,97; His (1) 0 , 9 1 .

Z-His-Thr(Bzl)-Phe-Pro-Gln-Thr(Bzl)-Ala-Ile-Gly-OH (13**)

Aan een oplossing van 1,66 g (1,15 mmol) Z-20-28-0Me (12) in 125 ml

dioxan/HpO (4:1 v/v) werd 9,2 ml 0,5 N NaOH toegevoegd. Na 10 min werd

4 ml 1 N HCl toegevoegd. Vervolgens werd de oplossing, na indampen tot

klein volume, aangezuurd tot pH 3 en toegedruppeld aan 200 ml 0,01 N

HCl. Het neerslag werd afgefiltreerd en gedroogd. Opbrengst 1,29 g.

Uit de waterlaag werd nog 0,13 g produkt gewonnen. De produkten waren

licht verontreinigd volgens die.

Aminozuuranalyse: Thr (2) 1,84; Glu (1) 0,99; Pro (1) 1,05; Gly (1)

0,99; Ala (1) 1,03; H e (1) 0,98; Phe (1) 0,97; His (1) 0,82.

Tabel 7-3 Synthese van de fragmenten 29-32 en 20-28, fysische eigenschappen en analytische gegevens

Smpt. Oplos- % C % H % H

Seq.^ Formule Mol.gew. [ « ] Q C ^ ' J S Z S ^°"'^- '-^t- K n s t . / p r e c . ( o n t l . ) middel ber. gev. ber. gev. ber. gev.

- ''13"l6'^2°3 248,3 89-90 -34 -36 2,0 EtOH 62,89 62,6 6,50 6,4 11,29 11,5 EtOAc/p.e. 40-60 94 -33,8 2,0 EtOH 130

- '-16"2l'^3°4 ^^^''' 169-170 -88 -92 2,0 MeOH 50,17 60,3 6,63 6,7 13,16 13,4 EtOAc en iPrOH 168-9 -94 2,0 MeOH 29

2* C,,H,,N,0. 319,4 168-9 -88 -92 2,0 MeOH MeOH en iProH

- 16 Zl 3 4 1 ) ) ) 4 C . , H „ N , 0 , 475,5 207-9 -32 -34 2,0 DMF 58,09 58,2 6,99 7,0 14,73 14,8 THF/ether/H,0 209-11 -31 2,0 DMF 29 5 C,,H„.N,0. 336,4 124-5 -25 -27 2,0 HOAc 60,70 60,7 7,19 7,3 8,33 8,5 EtOAc - 1/ 2 4 £: b 127-130 -26,6 2,0 HOAc 131

i C^QH^gNjOg 407,5 193-4 -55 -58 0,9 MeOH 58,95 59,1 7,17 7,2 10,31 10,3 EtOAc/hexaan 189-190 -59 1,0 MeOH 29 2 C2gH^^N^0g 564,7 182-3 -35 -37 0,9 HOAc 59,55 60,0 7,85 7,9 9,92 10,3 MeOH/H^O 8 C„Hc,N,0,„.H-0 710,8 221-2 -33 -35 0,7 HOAc 55,76 55,5 7,66 7,5 11,83 11,7 MeOH/H,0 - 33 52 6 10 2 2 - 5 - 5 0,8 DMF 9. C^^Hg7Ng0j2^H20 955,1 229-230 -50 -53 0,9 HOAc 59,10 58,9 7,28 7,4 11,73 11,8 MeOH/H^O -27 -28 0,7 DMF 10 CggHgjNgOj,^ 1128,3 221-2 -20 -21 1,0 DMF 61,74 61,8 7,24 7,6 11,18 11,1 MeOH/H^O — ' - 6 7 V l 2 ° 1 5 - ^ 2 ° 1317,5 204-5 -16 -16 1,2 DMF 61,08 61,0 6,73 6,9 12,76 13,0 MeOH/H^O

Z-His-Thr(Bzl)-Phe-Pro-Gln-Thr(Bzl)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 (14)

Z-29-32-NH„ (4) (0,53 g, 1,1 mmol) werd opgelost in 50 ml MeOH en 10 ml DMF en gehydrogenolyseerd over 0,1 g Pd-C. Na filtratie werd de oplos-sing tot droog ingedampt. Het residu werd met 1,29 g (1 mmol) Z-20-28--OH (13**) en 0,27 g (2 mmol) HOBt opgelost in 18 ml DMF. De oplossing . werd, na toevoegen van 0,23 g (1,1 mmol) DCCI, 20 uur geroerd bij 40 . Het reactiemengsel werd uitgegoten in 100 ml 0,5 M KHCO.,. Het neerslag werd afgefil treerd en gedroogd. Opbrengst 1,76 g.

Het produkt werd opgeroerd met DMF. Na filtratie werd gechromatogra-feerd (in drie porties) over Merckogel OR-PVA 20000 (2,5x90 cm) met DMF als elutiemidde]. Opbrengst 1,25 g; licht verontreinigd volgens die (R^C 0,54; R^N 0,50; R^S 0,38).

Aminozuuranalyse: Thr (2) 2,00, Glu (1) 1,03; Pro (2) 1,96; Gly (2) 1,99; Ala (2) 2,03; Val (1) 0,96; H e (1) 1,03; Phe (1) 0,99; His (1) 0,85.

H-His-Thr-Phe-Pro-61n-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 (15)

Z-20-32-NH2 (14) (0,81 g) werd opgelost i n 50 ml TFA. Gedurende 1 uur werd HBr doorgeleid. De oplossing werd ingedampt t o t klein volume, ver-dund met 50 ml TFA en vervolgens t o t droog ingedampt. Het residu werd opgeroerd met 20 ml 0,1 M HOAc, waarna onopgelost materiaal (0,14 g) werd a f g e f i l t r e e r d . Na ionenwisseling over een kolom (2x7 cm) AG 2-X8

(OAc -vorm) werd de oplossing gevriesdroogd. Opbrengst 0,62 g. Het produkt werd i n twee porties verdeeld en gezuiverd door middel van verdelingschromatografie over Sephadex G-25 medium (kolom 2,5x35 cm; V =60 ml; el utiesnelheid 15 ml/uur; R^: produkt 0,21) met het sys-teem BuOH/HOAc/H^O (4:1:5 v / v ) . Opbrengst 0,20 g; homogeen volgens die (R^G 0,60; R^N 0,10) en papierelektroforese b i j pH=l,9 (40 V/cm; 2 uur; R^ t . o . v . His 0 , 4 1 ) ; [ a j ^ ^ - 4 0 ° , [ c c l g ^ g -42° (c=0,5 in DMF).

Aminozuuranalyse: Thr (2) 2,03; Glu (1) 1,02; Pro (2) 1,96; Gly (2) 2,00; Ala (2) 2,04; Val (1) 0,97; He (1) 1,01; Phe (1) 1,01; His (1) 0,97. Het peptidegehalte was 88%. Berekend op v r i j peptide: [ a ] ^ . - 4 5 ° ,

Z-Pro-NH-Mbh, zijn samengevat in tabel 7-7. De fysische eigenschappen

en analytische gegevens van de tussenprodukten en van het eindprodukt

zijn vermeld in de tabellen 7-8 en 7-9.

Tabel 7-6 Stapsgewijze synthese van fragment 20-32, analytische gegevens Seq. R ^ Dunnelaagchromatografie R^B Rf Rfi RfK R^P Thr Glu Aminozuuranalyse

Pro Gly Ala Val lie Phe His

16 17 18 19' 20 21 22 23* 0,19 0,17 0,13 0,35 0,43 0,10 0,36 0,08 0,51 0,32 0,41 ,d,e 0,62 0,74 0,55 0,28 0,64 0,74 0,61 0,39 0,71 0,23 0,60 0,96 (1) 0,99 (1) 1,01 (1) 1,03 (1) 0,31 0,34 0,27 0,23 0,12 0,25 0,64 0,78 0,97 (1) 0,59 0,95 (1) 0,97 (1) 0,65 0,63 0,98 (1) 0,98 (1) 0,83 0,56 1,80 (2) 1,00 (1) 0,20 0,68 0,59 1,80 (2) 0,99 (1) (0,49)(0,03)(0,63)(0,45) 0 , 9 3 (1) 0,96 (1) 1,96 (2) 1,94 (2) 1,98 (2) 1,94 (2) 1,96 (2) 1,96 (2) 1,99 (2) 1,96 (2) 2 , 0 8 (2) 2,06 (2) 2,07 (2) 2,07 (2) 2,02 (2) 0 , 9 9 (1) 1,00 (1) 0 , 9 8 (1) 1,01 (1) 1,03 (1) 1,06 (1) 1,05 (1) 1,06 (1) 1,05 (1) 1,05 (1) 0,99 (1) 0,94 (1) 0,98 (1) 0,79 (1)

De sequenties zijn weergegeven in tabel 7-5. b c

De loopvloeistoffen zijn vermeld onder Algemene gegevens (7 1). Gezuiverd door

^^g -60" (c=l i n HOAc). k r i s t a l l i s a t i e u i t MeOH/H^O, smpt. 232-4° ( o n t l . ) , [ a ] ^ ^ -^^"'L^^jg -17° ( c = l , l i n D M F ) , [ a ] p ^ " 5 8 ° . [ a j ^

Ber. voor C ^ 2 " 6 7 V i r ^ 2 ° ( ^ 9 2 , 1 ) : C 56,55, H 7,80; N 14,13%. Gev. C 5 6 , 5 , H 8 , 0 , N 14,0%. '^ Tussen haakjes z i j n de R^-waarden ver-meld van 23, waarvan de N^'"-Boc-groep was verwijderd door NaOH. ^ R,S 0,71 ( 0 , 2 4 ) .

Tabel 7-8 Stapsgewijze synthese van fragment 25-32, fysische eigenschappen en analytische gegevens Seq.^ 24 25 26 2Z 28 29 19" Forrpule ':3l"35''306 S 3 " 3 8 % ° 7 '•38"47'*5°8 ^ 4 0 " 5 0 \ 0 9 ':46"6lN70lO ' ^ 4 6 " 6 8 V l l ' ^ 4 2 " 6 7 V l l Mol.gew. 646,6 602,7 701,8 758,9 872,0 909,1 874,0 Smpt. ( o n t l . ) 137-8 169-171 160-1 141-3 248 228-9 230-1 [ a ] n -70 -77 -26 -30 -26 -34 -18 [ 1 ^ 5 7 8 -74 -81 -28 -31 -27 -35 -19 Cone. 1,3 1,1 1,2 0,9 1,0 1,0 1,0 Oplos-middel MeOH MeOH DMF DMF DMF DMF DMF

%

ber 68,24 65,77 65,03 63,30 63,36 60,77 57,71 C gev. 68,0 65,9 64,9 63,1 63,2 61,3 57,9 1 ber. 6,47 6,36 6,75 6,64 7,05 7,54 7,73 H gev. 6,6 6,6 6,8 6,9 6,9 7,6 7,8 1 N ber. 7,70 1,30 9,98 11,08 11,25 12,33 14,43 gev. 7,5 9,1 10,1 10,8 11,0 12,0 14,4 K n s t . / p r e c .

f

EtOAc/hexaan MeOH/dnsopropyl ether MeOH/HjO MeOH/H^O MeOH/HjO MeOH/H^O

De sequenties zijn weergegeven m tabel 7-7. 7-7.

Temperaturen tussen 20 en 24 Het produkt werd getritureerd met ether; zie tabel

Tabel 7-9 Stapsgewijze synthese van fragment 25-32, analytische gegevens

Seq.^ 24 25 26 27 28 29 19" Rf.A 0,70 0,53 0,49 0,30 0,27 0,23 0,09 Dunnelaagchromatografie R,B 0,78 0,71 0,72 0,66 0,75 0,62 0,43 R,E 0,91 0,66 0,63 0,56 0,59 0,54 0,27 R,F 0,75 0,73 0,51 0 , 8 3 0,56 0,20 R,0 0,60 0,38 0,35 0,20 RfS 0,80 0,74 0,83 0,74 0 , 4 3 Thr 1,08 (1 Pro 0,96 (1 0,97 (1 1,06 (1 0,99 (1 1,00 (1 ) 0,97 (1 Ami noz Gly 0,99 (1) 1,01 (1) 1,91 (2) 1.98 (2) 2,00 ( 2 ) 1,99 (2) u u r a n a l y s e Ala 1.05 (1) 1,02 (1) 1,03 (1) 1,02 (1) 2,01 (2) 2.01 (2) Val 1,00 (1 0,99 (1 1,00 (1 1,00 (1 1,01 (1 H e > 1.01 (1) ) 0,99 ( 1 ) ) 1.02 (1)

Tabel 7-10 Synthese van de fragmenten 15-19 en 11-14, koppelingen Sequentie H-Phe-OMe.HCl Z-Lys(Boc)-Phe-OMe Z-Asn-Lys(Boc)-Phe-OMe Z-Phe-Asn-Lys(Boc)-Phe-OMe Z-Asp(OBu')-Phe-Asn-Lys(Boc)--Phe-OMe Boc-N^Hj Z-Gln-N^Hj-Boc Z-Thr-Gln-N.Hj-Boc Z-Tyr-Thr-Gln-NjHj-Boc Z-Tyr(Bzl)-Thr-Gln-N2H2-Boc Z-Thr-Tyr-Thr-Gln-N^H^-Boc Z-Thr-Tyr-Thr-Gln-N^H^-Boc D 30 31 32 33 E 3^ 35 36 37 38 38" Beschermd Z-Lys(Boc)-OH'' Z-Asn-OH*" Z-Phe-OH Z-ASP(0BU')-0H'' Z-Gln-OH Z-Thr-OH Z-Tyr-OH Z-Tyr(Bzl)-OH Z-Thr-OH Z-Thr-OH Gemengd a aminozuur 9 2,31 2,56 5,77 2,02 0,19 1,22 0,15 0,57 mmol 7,8 8,7 8,55 6,75 32,0 8,0 0,6 3,0 0,6 2,25 ihydnde NMM ml 0,87 0,95 0,75 3,55 0,9 66 ul 0,33 66 ul 0,25 iBuOCOCl ml 0,96 1,06 0,84 3,99 1,00 74 ul 0,37 74 ul 0,28 mmol 7,2 7,98 6,30 30,0 7,5 0,56 2,8 0,56 2,1 THF ml 10 6 10 15 10 2 4 2 4 Aminocomponent g mmol 0 30 31 32 E 34 35 35 36

IZ

1,29 4,28 3,74 3,61 2,64 1,96 0,20 0,99 1,5 6,0 7,9 5,7 4,5 20,0 5,0 0,4 2,0 ~0,4 •^ 1,5 DMF ml 6 15 10 5 sJ 1 4 2" 5" Reactie-tijd min 30 45 120 120 30 30 45 75 45 Opbrer g 2,84^ 4,30 4,38 3,64y 6,3" 1,83^

)'

2,0'" 0,33t^ 1,22'-gst'^ 1 87 83 96 83 80 74 >100 • 100 »100

Koppelingen volgens de REMA-methode werden uitgevoerd volgens de Algemene werkwijzen ( 7 . 1 ) . De N-beschermende groepen werden ver-w i j d e r d volgens de Algemene ver-werkver-wijzen (7.1) Opbrengst per k o p p e l i n g . Vrijgemaakt u i t DCHA-zout volgens de Algemene ver-werkver-wijzen

( 7 . 1 ) . ^ Produkt scheidde zich af als o l i e na toevoegen van NaCl-oplossing; e x t r a c t i e met CHCl,, produkt gezuiverd over A K O , met CHClj als eluens. ^ DCCI/HOBt-koppeling: 40 ml CH^CI^ + 10 ml DMF, 1,61 g (11,9 irmol) HOBt, 1,79 g (8,7 mmol) DCCI, I uur b i j -10° en 18 uur b i j 4 . Na indampen t o t k l e i n volume werden 7 ml 2 M KHCO, en 100 ml NaCl-oplossing toegevoegd. Het a f g e f i l t r e e r d e en ge-droogde neerslag werd opgeroerd met DMF. Na f i l t r a t i e werd de oplossing ingedampt. Het produkt werd g e k r i s t a l l i s e e r d u i t MeOH/H„0. 5 Na z u i v e r i n g door k r i s t a l l i s a t i e u i t MeOH/H,0. ^ Na k r i s t a l l i s a t i e u i t MeOH/ether. 5,02 g (64"i) •• THF. '' Produkt scheidde z i c h als o l i e a f ; e x t r a c t i e met EtOAc. Gezuiverd door k r i s t a l l i s a t i e u i t MeOH/ether. Reactiemengsel ingedampt. Het residu werd opgelost i n EtOAc en deze oplossing werd met weinig water gewassen. Het p r o d u k t , dat l i c h t v e r o n t r e i n i g d was volgens d i e , werd d i r e c t ingezet voor de volgende koppeling. P r e c i p i t a t i e door NaCl-oplossing; produkt bevatte NaCl; l i c h t v e r o n t r e i n i g d volgens d i e . " + 1 ml H^O. P P r e c i p i t a t i e door NaCl-oplossing, l i e h t v e r o n t r e i n i g d volgens d i e , homogeen na k r i s t a l l i s a t i e u i t MeOH/H^O: 0,14 g (45% berekend op 35). Produkt scheidde zich als o l i e af na toevoegen van NaCl-oplossing; opwerking met CHCl,. Na k r i s t a l l i s a t i e u i t MeOH/H_0 bevatte

Tabel 7-12 Synthese van de fragmenten

15-19 en 11-14, analytische gegevens

Dunnelaagchromatografie

Seq.^

3C 31 32 3_3^ 34 35 36

3Z

38

is*^^

R^A 0,34 0,45 0,53 0,10 0,07 0,16 R^B 0,75 0,65 0,71 0,75 0,53 0,44 0,42 0,56 0,33 0,33 R,E 0,76 0,49 0,60 0,72 0,40 0,35 0,57 0,15 0,15 R^J 0,30 0,06 R^O 0,68 0,48 0,39 0,51 0,35 0,20 0,20 0,24 0,19 0,19

De sequenties zijn weergegeven in tabel

7-10, De loopvloeistoffen zijn vermeld

onder Algemene gegevens (7.1). '' Asp (2)

2,01; Phe (2) 2,00; Lys (1) 0,99. ^ Thr

(2) 1,93; Glu (1) 1,00; Tyr (1) 0,86.

sing werd toegevoegd aan 70 ml H„0. Het neerslag werd afgefiltreerd en

in vacuum gedroogd. Opbrengst 0,95 g. Volgens die bevatte dit produkt

nog een geringe hoeveelheid aminocomponent. De aminocomponent werd

ver-wijderd door het produkt te chromatograferen over een kolom (2x15 cm)

Bio-Rex 70 (H'*'-vorm) met DMF/MeOH/HpO (2:2:1 v/v) als eluens. Opbrengst

0,87 g. Na tritureren met MeOH werd 0,65 g (53%) produkt verkregen dat

homogeen was volgens die (R,C 0,63; R^M 0,74; R^S 0,45); smeltpunt

212-3° (ontl.);[a]p° -17°, [ a j ^ ^ g -18° (c=0,8 in DMF).

^72^98'^12'^21 Berekend: C 58,92 H 6,73 N 11,465^

(1467,6) Gevonden: C 58,5 H 6,9 N 11,5%.

Aminozuuranalyse: Asp (2) 2,03; Thr (2) 1,89; Glu (1) 0,98; Tyr (I)

0,87; Phe (2) 1,99; Lys (1) 1,00.

label 7-13 Stapsgewijze synthese van fragment 11-19, koppelingen

Gemengd anhydride Aminocomponent

Reactie-Sequentie Beschermd aminozuur NMM iBuOCOCl DMF DMF tijd Opbrengst*^

mmol ml ml mmol ml g mmol ml

Z-Asp(OBu*)-Phe-Asn-Lys(Boc)--Phe-OMe'' 33 Z-Gln-Asp(OBu*)-Phe-Asn-Lys(Boc)--Phe-OMe 41 Z-Gln-OH 0,53 1,95 0,22 0,24 1,80 4 33 1,46 1,50 15 30 1,64 99 Z-Thr(Bu'^)-Gln-Asp(OBu'^)-Phe--Asn-Lys(Boc)-Phe-OMe 42 Z-Thr(Bu*^)-OH^ 1,90 0,21 0,22 1,63 4 41 1,50 1,36 10 60 1,57 92 Z-Tyr{Bu')-Thr(Bu'^}-Gln-Asp(OBu^)--Phe-Asn-Lys(Boc)-Phe-OMe 43 Z-Tyr(Bu'^)-OH^ 1,58 0,18 0,18 1,36 4 42 1,42 1,13 10 75 1,57 94 Z-Thr(Bu*)-Tyr(Bu*)-Thr(Bu*)- -Gln-Asp(OBu*)-Phe-Asn--Lys(Boc)-Phe-OMe 44 Z-Thr(Bu*)-OH^ 1,33 0,15 0,15 1,14 4 43 1,40 0,95 10 60 1,50 97

Koppelingen volgens de REMA-methode werden uitgevoerd volgens de Algemene werkwijzen (7.1). De N-beschermende groepen werden verwijderd volgens de Algemene werkwijzen (7.1). *" Opbrengst per koppeling. Zie de tabellen 7-10, 7-11 en 7-12. ^ Vrijgemaakt uit DCHA-zout volgens de Algemene werkwijzen (7.1).

7.4 SYNTHESE VAN FRAGMENT 1-10

Koppel ingsgegevens behorende b i j de synthesen van Boc-Met-Leu-Gly-OBu'' (47) en Boc-Cys(Bzl)-Gly-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-Cys(Bzl)-OMe (53) z i j n samengevat i n tabel 7-16. De fysische eigenschappen en analytische gegevens van de tussen- en eindprodukten z i j n vermeld i n de tabellen 7-17 en 7-18.

Boc-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-Cys(Bzl )-OMe (51)

Boc-4-7-0Me (50) (6,13 g, 7,6 mmol) werd opgelost in 40 ml TFA/CHgCl^

(1:1 v/v). De oplossing werd na 30 min in vacuum ingedampt. Na

toevoe-gen van tolueen werd opnieuw tot droog ingedampt. Het residu werd in

vacuum gedroogd.

Het residu werd opgelost in 10 ml DMF en de aminogroep werd

vrijge-maakt door NMM. Aan deze oplossing werden 1,95 g (8,4 mmol) Boc-Asn-OH

en 1,54 g (11,4 mmol) HOBt toegevoegd Nadat bij -10° een oplossing

van 1,73 g (8,4 mmol) DCCI in 3 ml Df1F was toegevoegd, werd de

oplos-sing nog I2 uur bij -10° geroerd en vervolgens 15 uur bij 4 bewaard.

Aan het reactiemengsel werd 15 ml DMF toegevoegd omdat het vast was

geworden. Na nog 28 uur bij kamertemperatuur werd het reactiemengsel,

ondanks een forse fluorescamine positieve vlek op dunnelaag,

gefil-treerd en toegedruppeld aan 300 ml water en 20 ml 2 M KHCO,. Het

neer-slag werd afgefiltreerd, gewassen met water en in vacuum gedroogd.

Op-brengst 6,48 g. Dit produkt bevatte volgens die vier componenten. R^^E

0,40 (aminocomponent, flu + ) , 0,60 (51), 0,66 (DCU) en 0,78 (', UV +,

na enige run verhitten bij 100 nog flu - ) . Aminozuuranalyse. Asp (1)

0,54; Thr (1) 0,89, Ser (1) 0,75; Leu (1) 1,00, Cys(Bzl) (1) 0,92.

Het produkt werd met 1,95 g (8,4 mmol) Boc-Asn-OH en 1,54 g (11,4

mmol) HOBt opgelost in 25 ml DMF. Bij -10° werd 1,73 g (8,4 mmol) DCCI

toegevoegd. Na nog 1 uur roeren bij -10 was de aminocomponent volgens

die afwezig. Het reactiemengsel werd 21 uur bij 4 bewaard en

vervol-gens na filtratie toegedruppeld aan 300 ml water en 20 ml 2 M KHCO,.

Het neerslag werd afgefiltreerd, gewassen met water en in vacuum

ge-Tabel 7 17 Synthese van de fragmenten 8-10 en 1-7, fysische eigenschappen en a n a l y t i s c h e gegevens

Seq Formule Mol gew

LO C^3"58'*4°95 ^ C„H„N,OjiS if CggH^sVu^Z 1 1 " •" Smpt ( o n t l ) lo.2l°\:a-\l% cone

Oplos-middel ber ber gev gev

475,6 116 8 50 -52 2,4 MeOH 55,55 55,7 8,69 8,7 8,84 8,6 EtOAc/hexaan 807.0 127-9 -10 -10 1,1 DMF 63,99 64,2 7,24 7,4 6,94 7,2 MeOH 921.1 197-8 -20 -21 0,9 DMF 61,28 61,3 7,00 6,9 9,13 9,1 MeOH

198-200 -23 24 1,1 DMF 60,49 60,1 6,71 6,7 9,57 9,7 MeOH/H,0

De sequenties z i j n weergegeven i n tabel 7-16 S ber 6 , 7 4 , gev 6,4" ^ S ber 5 , 4 8 , gev 5,2%

Tabel 7-18 Synthese van de fragmenten 8-10 en 1-7, analytische gegevens

Seq

Dunnelaagchromatcgrafie Aminozuuranalyse

R,A R,B R,E RfF R,J R,0 Asp Ser Gly Met t e u Cys(Bzl)

46 0,70 0,81 0,76 0,54 0,71 4j'= 0,65 0,75 0,70 0,81 0,49 0,70 ;o,09)(U,22)(0,66)(0,28)(0,30)(0,30) 0,89 0,91 0,92 0,71 0,82 0,83 0,85 0,50 0,81 0,41 0,77 1,02 (1) 1,00 (1) 0,98 (1) 0,77 0,81 0,46 0,60 0,40 0,65 0,61 0,50 0,39 0,71 0,78 0,65 0,92 (1) 0,82 (1) 0,98 (1) 0,98 (1) 0,90 (1) 0,39 0,98 (1) 0,97 (1) 0,89 (1) 1,01 (1) 0,99 (1) 0,97 (1) 0,91 (1) 1,00 (1) 1.00 (1) 0,84 (1) 1,02 (1) 0,84 (1) 1,02 (1) 0,86 (1) 1.01 (1) U ' S (2)

Aminozuuranalyse: Asp (1) 1,02; Thr (1) 1,03; Ser (1) 0,97; Gly (1)

1,00; Leu (1) 0,99; Cys(Bzl) (2) 1,77.

Boc-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-N2H3 (55)

In een apparaat volgens Nesvadba en Roth (118) werd aan 250 ml van

na-trium gedestilleerde ammoniak toegevoegd: 0,45 g (0,4 mmol)

Boc-1-7--N.Hg (54) en 96 mg (1,5 mmol) ureum. De toevoegsnelheld van de

Na/NH-,--oplossing (0,2 g Na op filter) werd geregeld door het reactievat te

verwarmen of af te koelen. De reactie duurde 30 min. Het reactiemengsel

werd in een rondbodem overgezogen, waarna de ammoniak werd verwijderd

met behulp van een rotatieverdamper. Het residu werd opgelost in 40 ml

DMF en 600 ml zuurstofvrij gedestilleerd water. De pH werd met HOAc op

5,8 gebracht. Aan de oplossing werd onder roeren en doorleiden van N„

langzaam 80 ml 0,01 M K2Fe(CN)g toegevoegd. De pH werd met ammonia op

6,8 gehandhaafd. Anionenwisseling vond plaats over een kolom (5x5 cm)

AG 2-X8 (200-400 mesh, Cl'-vorm). Nadat het eluaat was gevriesdroogd,

werd het produkt gezuiverd door chromatografie over een kolom (2,5x90

cm) AG 11A8 (50-100 mesh) met gedestilleerd water als eluens (45 ml/

uur). Opbrengst 97 mg, homogeen volgens die (R^K 0,66; R^L 0,50; R^M

0,41; R^N 0,58);[a]p^ -42°, [ a ] g ^ g -43° (c=0,8 in DMF).

Aminozuuranalyse: Asp (1) 1,01; Thr (1) 0,97; Ser (1) 0,91; Gly (1)

0,99; Leu (1) 1,00.

I 1

Boc-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-OH (56)

Boc-8-lO-OBu* (47) (87 mg, 0,2mmol) werd opgelost in 5 ml TFA/H2O (9:1

v/v). Na 30 min werd de oplossing tot droog ingedampt. Het residu werd

opgelost in 1 ml DMF.

Aan een oplossing van 97 mg (0,12 mmol) B0C-I-7-N2H2 (55) in 3 ml DMF

werd bij -20° 290 M1 1,16 N (0,33 mmol) HCl/dioxan en bij -25° 100 ^1

(0,15 mmol) tert-BuNOp/DMF (1:4 v/v) toegevoegd. Na 10 min roeren bij

-10 werd afgekoeld tot -15 , waarna de aminocomponent werd toegevoegd.

7.5 KOPPELING VAN DE FRAGMENTEN

7.5.1 Koppeling van de fragmenten 11-19 en 20-32

Gekoppeld werden de fragmenten Z-ll-ig-N^H^ (40) en H-20-32-NH2 (15),

beide door fragmentsynthese verkregen en Z-ll-ig-NpH., (45) en

H-20-32--NHjj (1^ ) , beide door stapsgewijze synthese verkregen.

Z-Thr-Tyr-Thr-Gl

n-Asp(OBu*)-Phe-Asn-Lys(Boc)-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln--Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 (57)

Aan een oplossing van 118 mg (0,08 mmol) Z-II-I9-N2H2 (40) in 3 ml DMF werd b i j -20° 0,15 ml 1,4 N (0,21 mmol) HCl/dioxan en b i j -15° 66 ^1 (0,10 mmol) tert-BuNOp/DMF (1:4 v/v) toegevoegd. Na 10 min roeren b i j -10° werd een oplossing van 95 mg (0,067 mmol) H-20-32-NH2 (15) i n 3 ml DMF toegevoegd, d i r e c t gevolgd door 36 ^i^ (0,21 mmol) Et(iPr)2N. Na 5 uur werd nog 12 ul (0,07 mmol) Et(iPr)2N toegevoegd. Het r e a c t i e -mengsel werd na 28 uur b i j 4 d i r e c t gechromatografeerd over een kolom

(2,5x90 cm) Merckogel OR-PVA 20000 met DMF als eluens (15 m l / u u r ) . Op-brengst 157 mg (86%); homogeen volgens die (R^G 0,60; R.R 0,34; R^S 0,05).

Een analysemonster werd geprecipiteerd in MeOH/H„0. Smeltpunt 207 (ontl . ) ; [ a ] p ^ - 2 8 ° , [ 0 3 5 7 3 -29° (c=l in DMF).

Aminozuuranalyse: Asp (2) 2,24; Thr (4) 4,02; Glu (2) 2,10; Pro (2) 1,89; Gly (2) 1,97; Ala (2) 2,00; Val (1) 0,94; He (1) 0,98; Tyr (1) 0,95; Phe (3) 3,14; His (1) 0,97; Lys (1) 1,06.

Z-Thr(Bu^)-Tyr(Bu^)-Thr(Bu^)-Gln-Asp(OBu^)-Phe-Asn-Lys(Boc)-Phe-His--Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 (58)

Aan een oplossing van 293 mg (0,179 mmol) Z-II-I9-N2H2 (45) in 4 ml

DMF werd bij -20° 0,35 ml 1,4 N (0,49 mmol) HCl/dioxan en bij -15°

0,15 ml (0,23 mmol) tert-BuN02/DMF (1:4 v/v) toegevoegd. Na 10 min

grafeerd over Merckogel. Er werd 45 mg Boc-l-32-NHp (fractie E)

geVso-leerd. Die: R^M 0,60; R^N 0,60; R^R 0,34.

Aminozuuranalyse: Asp (3) 3,42; Thr (5) 5,21; Ser (1) 1,28; Glu (2)

1,97; Pro (2) 2,05; Gly (4) 4,43; Ala (2) 2,00; Val (1) 0,97; Met (1)

1,08; H e (1) 1,05; Leu (2) 2,50; Tyr (1) 0,86; Phe (3) 3,02; His (1)

0,87; Lys (1) 0,97.

8. Vaste fase synthese van fragment 20-32

8 . 1 I N L E I D I N G

Bij de vaste fase synthese van fragment 11-32 van menselijk calcitonine ( f i g . 81) constateerde Hindriks (57) dat vanaf Ala^^ t o t His^° de i n

-20

bouw van aminozuren daalde t o t ongeveer 60%. Na His bleef de inbouw op hetzelfde niveau. Een d e r g e l i j k verschijnsel is ook beschreven door M e r r i f i e l d (137) en door Westall en Robinson (138).

I 1 H Cys G l y — Asn Leu Ser Thr C y s M e l Leu Gly

-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Thr T y r — Thr G i n A s p Phe A s n Lys Phe -11 12 13 14 15 16 17 18 19

- H I S - Thr - P h e - P r o - G i n - Thr - A l a - l i e - Gly - V o l - Gly - A l a - P r o - N H j 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

Figuur 8-1 De aminozuursequentie van menselijk calcitonine.

Wij herhaalden de synthese van fragment 20-32, waarbij de

ontscherming-en koppelingstappontscherming-en op graad van omzetting werdontscherming-en gecontroleerd. Van de

in de literatuur (139) beschreven methoden ter bepaling van de

resteren-de aminogroepen na resteren-de koppeling kozen we:

1. als kwalitatieve methode de ninhydrintest van Kaiser et al. (140).

Een monster peptide-polymeer werd na goed uitwassen van de reagentia

(139) gedurende vijf minuten met een ninhydrinoplossing op 100

Ver-warmd. Violetkleuring van het polymeer gaf de aanwezigheid van

amino-groepen aan. Bij H-Asp(OBzl)- en H-Pro- als N-terminale aminozuren zou

bruinkleuring optreden.

2. als kwantitatieve methode de pyridiniumchloridemethode van Dorman

(141). De resterende aminogroepen van de totale hoeveelheid

peptide-polymeer werden met behulp van pyridiniumchloride in het

overeenkom-Tabel 8-1 Eerste vaste fase synthese van fragment 20-32 van

menselijk calcitonine:

Z-His(Z)-Thr(Ztf)-Phe-Pro-Gln-Thr(Ztf)--Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-polymeer^

-

^

-Vrije aminogroepen

Aantal Tijd

mmol Mmol

equiv. uren onge- ge-

%

corr. corr.

Positie

Koppeling c.q.

Ontsche>"ming

32 31 Boc-Pro-polymeer HCl/HOAc 1,4 N 1 Boc-Ala-OH 2 Boc-Ala-OH 2 1

n

1 1,59 20^ 0 1,3 0,1 HCl/HOAc 1,4 N 30 1 Boc-Gly-OH 2 2 Boc-Gly-OH 1 HCl/HOAc 1,4 N

29 1 Boc-Val-OH 2

2 Boc-Val-OH 1

HCl/HOAc 1,4 N

28 1 Boc-Gly-OH

2 Boc-Gly-OH

HCl/HOAc 1,4 N

27 1 Boc-Ile-OH 2 Boc-Ile-OH HCl/HOAc 1,4 N 26 1 Boc-Ala-OH 2 2 Boc-Ala-OH 1 HCl/HOAc^' 1,4 N

1,57

1,45

1,46

n

1,39

0,74

56

5

54 ,g,h

0,4

0,1

3,9

0,3

2

1

2

1

i

I

n

n

1,44

25

3

140

18

1,7

0,2

9,7

1,2

3,9

0,6

Vervolg van tabel 8-1 Positie 21 20 Koppeling c.q. Ontscherming° 1 Boc-Thr(Ztf)-OH 2 Boc-Thr(Ztf)-OH 3 Boc-Thr(Ztf)-OH acetylimidazool 1 HCl/HOAc 1,2 N 2 HCl/HOAc 1,2 N 1 Z-His(Z)-OH 2 Z-His(Z)-OH Aa eq 2 1 1 10 2 1 i t a l d LllV. T i j d uren 4 15 22

i

31 16 V r i j e mmol onge-c o r r . 0,22 0,30 e aminogroepen pmol ge-c o r r . 94 31 29P )S,P )S,P )S,g % 31,4 10,4 9,7 t

Uitgegaan van 1,60 g Pro-polymeer, belading 0,94 mmol Pro/g Boc--Pro-polymeer. De colorimetrische bepaling van proline met natnum-1,2--naftochinon-4-sulfonaat werd uitgevoerd door T.S. L i e ; zie (146).

Tenzij anders vermeld werden de koppelingen uitgevoerd m.b.v. DCCI (1,1 equiv. t . o . v . het te koppelen aminozuurderivaat) in CH^CK- Twee behandelingen. 5 en 25 min. N-beschermd aminozuur t . o . v . het na ont-scherming bepaalde aantal v r i j e aminogroepen. ° Potentiometnsch be-paald met resp. 0,2 en 0,01 M AgNO,. Blancowaarde 32 umol. ^

Nin-h

h y d r i n t e s t n e g a t i e f . Verkregen 2,04 g Boc-26-32-polymeer. ^ Door-1^

gegaan met 1,34 g Boc-26-32-polymeer ( 0 , 9 1 mmol p e p t i d e ) . CH2CI2/ DMF 1 : 1 . ^ CH2CI2/DMF 2 : 1 . "^ Blancowaarde 28 u m o l . " N i n h y d r i n t e s t p o s i t i e f . ^ N i n h y d r i n t e s t zwak p o s i t i e f . ^ Na Et,N/DMF-behandeling DMF. werd de Dormanprocedure u i t g e v o e r d . u i t g e v o e r d . Opbrengst 1,61 g p e p t i d e - p o l y m e e r Geen Dormanprocedure

HIS I Thr [ Phe [ Pro | Gin | Thr | Ala | lie | G i 7 T v a l Toiy I Ala [ Pro

1 40 m m o l 1 20

> S e q u e n t , e 32

Figuur 8-2 Vrije aminogroepen na de ontschermingstap bij

de vaste fase synthese van fragment 20-32 van menselijk

calcitonine. (x) eerste synthese; (o) tweede synthese.

Zie ook de tabellen 8-1 en 8-2.

Vervolg van tabel 8-2 Positie 25 24 23 22 21 20 Koppeling c . q . Ontscherming 1 Boc-Thr(Ztf)-OH 2 Boc-Thr(Ztf)-OH 3 Boc-Thr(Ztf)-OH HCl/HOAc 1,2 N 1 Boc-Gln-ONp/DMF 2 Boc-Gln-ONp/DMF 1 TFA/CH2Cl2^ 1:1 2 TFA/CH2Cl2'^ 1:1 1 Boc-Pro-OH 2 Boc-Pro-OH 3 Boc-Pro-OH 4 Boc-Pro-OH HCl/HOAc 1,2 N 1 Boc-Phe-OH 2 Boc-Phe-OH 3 Boc-Phe-OH 1 HCl/HOAc 1,2 N 2 HCl/HOAc 1,2 N Pyr.HCl/CH2Cl2 0,3 M 1 Boc-Thr(Ztf)-OH 2 Boc-Thr(Ztf)-OH HCl/HOAc 1,2 N 1 Boc-His(Dnp)-OH 2 Boc-His(Dnp)-OH Aantal . d equiv. 2 1 1 4 3 2 1 1 1 2 1 1 2 1 2 1 T i j d uren

n

17 5 20 23 2 16 5 24 1 | 2 19 4 18 2

3J

V r i j e mmol onge-corr. 0,84 0,71 0,77 0,79 0,42 0,42 0,27^ 0,25 ami nogr Mmol ge-corr. 380 189 17 20 129 179 21^ 179 8

zs"^

189 14 22^ jf 149 ,n,k )n>g e oepen

%

42 2,0 1,9 3,3 1,4 23 2,7 2,2 1.0 3,2 2,3 1,8 • 8,1 5,2

Tabel 8-3 Aminozuuranalyses van peptide-polymeren

Thr Glu Pro Gly Ala Val He Phe His

Eerste synthese Boc-26-32-pol 1,06 1,97 2,16 1,01 0,84 Z-20-32-P01 0,84 0,74 1,72 2,04 2,10 1,00 0,85 0,33 0,16 Tweede synthese H-22-32-P01 0,73 0,80 2,01 2,09 2,11 0,96 0,84 0,34 Boc-20-32-pol ^ 0,98 0,80 1,94 2,07 2,10 0,97 0,86 0,37 0,71 0,78 1,88 2,13 2,08 0,96 0,84 0,35 0,07

^ Hydrolysecondities HCl/HOAc, 110°, 24 uur Analyse voor en na af-s p l i t af-s i n g van de Dnp-groep met mercaptoethanol.

22 Een opmerkelijk verschijnsel was dat b i j de koppeling van Boc-Phe -OH het aantal aminogroepen sterk daalde t e r w i j l volgens de aminozuurana-lyse (tabel 8-3) de inbouw van fenylalamne ongeveer 40°/ bedroeg Een identiek verschijnsel is l a t e r door Hancock et al (147) geconstateerd b i j de koppeling van Boc-Asp(Bzl)-0H aan H-Tyr(Bzl)-Ile-Asn-Gly-poly-meer (polystyreen-1%divinylbenzeen) t i j d e n s de synthese van fragment 63-74 van acyl c a r r i e r protein Z i j hebben de sequentie-afhankel i j k e problemen - zoals onvolledige ontscherming en koppeling, onvolledige a c e t y l e n n g van resterende aminogroepen, discrepantie tussen de via de Dormanprocedure en door aminozuuranalyse bepaalde inbouw van een amino-zuur, doorgroei van een "truncated sequence - b i j de vaste fase syn-these van bovengenoemd fragment u i t v o e r i g onderzocht, hetgeen leidde t o t de hypothese " t h a t incomplete coupling and/or deprotection r e f l e c t s sites which are not solvated by the reagents and may be inaccessible to chain-terminating reagents or to t i t r a t i o n as well as to coupling". Hagenraier en Frank (148) hebben het C-terminale nonapeptide 24-32 van menselijk calcitonine gebruikt als model om verschillende parameters van de vaste fase methode te bestuderen De basis hiervoor was de schei-ding van de acht tussenliggende peptiden in de de-amidovorm op een kat-lonenwisselaar

Z i j (149) verbeterden de koppelingsopbrengsten b i j de synthese van Boc2832polymeer door in plaats van de gebruikelijke wijze van i n

-Chloornethylering polystyreen-2% divinylbenzeen

Polystyreen-2% divinylbenzeen (200-400 mesh, Dow Chemical Company) werd tweemaal gewassen met 1 N NaOH, 1 N HCl, HpO, DMF, MeOH en vervolgens in vacuum b i j 100° gedroogd. Elementaire analyse: C 91,9 H 7,8%.

100 g polymeer werd gedurende 1 uur b i j 25 in CHCl, geroerd, waarna de suspensie t o t 0 werd gekoeld. In 10 min werd een mengsel van 20 ml SnCl, en 100 ml gedestilleerde Cl-CH„-0-CH, toegedruppeld b i j een tem-peratuur van -2 t o t +1 . Na nog 50 min roeren b i j 0 werd de suspensie g e f i l t r e e r d . Het polymeer werd vervolgens steeds gedurende 10 min opge-roerd met 300 ml dioxan/3 N HC1-, dioxan/H^O-, dioxan/MeOH-mengsels en t e n s l o t t e met MeOH. Het produkt werd in vacuum gedroogd b i j 100 . Ele-mentaire analyse: C 84,1 H 7,3 CI 9,0%. Belading: 2,54 mmol Cl/g poly-meer.

Boc-Pro-polymeer

Een geroerde suspensie van 10,93 g (50,8 mmol) Boc-Pro-OH, 6,36 ml (45,7 mmol) Et^N en 20 g gechloormethyleerd polymeer in 60 ml EtOH werd 25 uur onder terugvloeiing gekookt. Na f i l t r a t i e werd het poly-meer grondig gewassen met EtOH, EtOH/H20 (1:1 v / v ) , EtOH, HOAc en CH^Clp. Het produkt werd in vacuum b i j 40 gedroogd.

Aan de hand van een c h l o r i d e t i t r a t i e in het f i l t r a a t van de neutra-l i s a t i e s t a p werd de beneutra-lading van het poneutra-lymeer bepaaneutra-ld: 1,00 mmoneutra-l Pro/g polymeer. Daarnaast bepaalde T.S. Lie ( d i t Laboratorium) colorime-t r i s c h de hoeveelheid proline in hecolorime-t zure hydrolysaacolorime-t van Boc-Pro-po-lymeer (146). Belading: 0,94 mmol Pro/g poBoc-Pro-po-lymeer.

Synthese van fragment 20-32

De synthese werd uitgevoerd in de op d i t Laboratorium ontwikkelde ma-chine voor peptidesynthese (57, 152) volgens het programma, dat ver-meld IS in tabel 8-4. De wasstappen waren geprogrammeerd. Voor de

stappen met reagentia werd de handbediening gebruikt. De stappen 29-45 omvatten de procedure volgens Dorman (141) voor het bepalen van amino-groepen. Indien de koppeling onvolledig was, werd deze herhaald.

Een aantal maal is na stap 48 de ninhydrintest van K a i s e r e t a l . (140) toegepast Voor het toepassen van deze t e s t diende het polymeer gron-dig gewassen te z i j n , omdat we geconstateerd hadden dat een Boc-amino-zuur + DCCI een positieve ninhydrintest gaf.

In een aantal gevallen is TFA/CH„Clp gebruikt voor de ontscherming. Na de neutral i s a t i e s t a p werd dan de Dormanprocedure toegepast. Later is gebleken dat de neutral isatiestap achterwege kon b l i j v e n . Het t n fluoracetaat werd namelijk volledig vervangen door het chloride t i j -dens de pyridine.HCl behandeling van het TFA.H-peptide-polymeer.

Eerste synthese

Het syntheseverloop is vermeld in tabel 8-1 Uitgegaan werd van 1,60 g Boc-Pro-polymeer. Verkregen werd 2,04 g Boc-26-32-polymeer. De amino-zuuranalyse IS vermeld in tabel 8-3.

100 mg van d i t produkt werd gedurende 22 uur geroerd i n 40 ml 1 M Et^N/MeOH. Opbrengst 46 mg. Smeltpunt 220-1°; [ a ] ^ ^ - 7 2 ° , [ a ] 5 7 g -77° (c=0,9 in MeOH). Hindriks (57) smeltpunt 221-2°; [ a ] p ^ -73° (c=l in MeOH). Op die ( s i l i c a ) l i c h t verontreinigd in

chloroform - methanol 8:1 R^: 0,39

isopropylalcohol - benzeen - water 4.3.1 R^; 0,65

tert-amylalcohol - isopropylalcohol - water 51:21:28 R^; 0,73.

Aminozuuranalyse van Boc-26-32-0Me: Pro (1) 1,13, Gly (2) 1,86; Ala (2) 2,04; Val (1) 1,00; He (1) 0,97.

Na d n e weken werd de synthese voortgezet met 1,34 g Boc-26-32-poly-meer. Opbrengst 1,61 g. De aminozuuranalyse van d i t produkt is vermeld in tabel 8-5

40 mg Z-20-32-polymeer werd gedurende 50 uur behandeld met een meng-sel van 15 ml Et^N, 45 ml MeOH en 40 ml DMF. Na f i l t r a t i e werd het po-lymeer gewassen met DMF en de oplossing ingedampt. Opbrengst 20 mg. De aminozuuranalyse i s vermeld in tabel 8-5.

Samenvatting

Het onderzoek had ten eerste tot doel menselijk calcitonine in

oplos-sing te synthetiseren; dit ter vergelijking met de vaste fase synthese

van [Asn-"-J-mensel ijk calcitonine (H. Hindriks, Proefschrift, Delft,

1973). De strategie hierbij was de fragmentsynthese: de menselijk

cal-citonesequentie werd verkregen door koppeling van drie hoofdfragmenten,

die elk uit twee fragmenten waren opgebouwd. Twee hoofdfragmenten werden

ook stapsgewijs gesynthetiseerd. De fragmenten werden met behulp van de

re-petitieve overmaat gemengd anhydride methode (repetitive excess mixed

anhydride, REMA, method) gesynthetiseerd. Hierdoor werd, als tweede doel,

meer inzicht verkregen in de mogelijkheden en beperkingen van de

REMA-methode.

I 1

H C y s G l y — Asn L e u S e r T h r C y s M e t L e u — G l y

-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Thr Tyr — Thr — G i n — A s p — Phe — A s n Lys ~ Phe -11 12 13 14 15 16 17 18 19

- H I S - Thr - Phe - Pro — G i n - Thr - A l a - He - Gly - Vol - Gly - A l a - Pro - N H j 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

De aminozuursequentie van menselijk calcitonine.

Hoofdstuk 1 geeft een overzicht van de calcitonines, waarvan de

amino-zuursequenties zijn opgehelderd. Daarnaast wordt uitgebreid aandacht

geschonken aan de in de literatuur beschreven synthesen van menselijk

calcitonine en analoga.

Hoofdstuk 2 handelt over de synthese van hoofdfragment 20-32. Dit werd

zowel door fragmentsynthese (20-28 + 29-32, fig. 2-1) als door

stapsge-wijze synthese (fig. 2-2) verkregen. De isolering van de C-terminale

peptiden tot het octapeptidestadium werd aanzienlijk verbeterd door

be-op het gevormde produkt beter mogelijk dan b i j de vaste fase methode, Er werden ook emge beperkingen van de REMA-methode ondervonden. De wateroplosbaarheid van sommige peptiden bemoeilijkte de i s o l e r i n g van het produkt. Dit t r a d op b i j de synthese van het C-terminale heptapep-tide (hoofdstuk 2) en werd verholpen door bescherming van het primaire amide door de 4,4'-dimethoxybenzhydrylgroep. Ook bleek het wenselijk in d i t verband de hydroxylfuncties in de zijketens van te koppelen ami-nozuren te beschermen.

Zoals bekend kan asparagine m e t via een gemengd anhydride worden ge-koppeld. Asparagine op de posities 3 en 17 werd daarom met behulp van dicyclehexylcarbodi imide/N-hydroxybenzotnazool gekoppeld.

B i j de REMA-synthese van de sequentie 1-10 van menselijk groeihor-moon i n Delft was gebleken dat prolylpeptiden in belangnjke mate met de ongewenste kant van het gemengd anhydride reageerden. Dit werd ook waargenomen b i j de synthese van het Cterminale dipeptide van c a l c i t o -nine Deze nevenreactie werd in de synthese van fragment 20-28 en 20-32 vermeden door koppeling van het dipeptide Boc-Phe-Pro-OH.

Uit een apart onderzoek (1) was gebleken dat b i j koppeling van h i s t i -dine via de overmaat gemengd anhydride methode de imidazoolring meet worden beschermd. De Boc-, iBoc- ( i n s i t u gevormd), Z- en Tos-groepen werden geschikt bevonden In de synthese van de fragmenten 20-28 en 20-32 werd het eindstandige h i s t i d i n e als d i - Z - , r e s p e c t i e v e l i j k di-Boc-derivaat gekoppeld.

Hoofdstuk 8 handelt over de vaste fase synthese van fragment 20-32. Naast het hierboven beschreven onderzoek is aandacht besteed aan de vaste fase synthese van d i t fragment, waarbij ontscherming en koppe-l i n g op graad van omzetting werden gecontrokoppe-leerd. B i j herhaakoppe-lde syn-these bleek dat na koppeling van Boc-Phe-OH aan H-Pro^^-peptide-poly-meer het aantal voor koppeling beschikbare aminogroepen sterk was ge-daald. Dit onverklaarde verschijnsel is ook elders waargenomen.

LITERATUUR

1. H.C. Beyerman, J . H i r t , P Kranenburg, J.L M. Syrier en A. van Zon, Reel. Trav. Chim. Pays-Bas 93(1974)256.